La toxicologie génétique est une discipline qui vise à détecter des facteurs chimiques ou physiques interagissant avec l'ADN des cellules et qui, en l'absence de réparation fidèle, sont susceptibles de provoquer des mutations géniques et/ou chromosomiques. Le test des comètes est un test court de génotoxicité simple, reproductible et rapide pour étudier la survenue de lésions primaires de l'ADN. Il s'agit d'une technique micro-électrophorétique très sensible permettant la mise en évidence des lésions de l'ADN de cellules eucaryotes individuelles exposées à des agents génotoxiques. En présence de cassures de l'ADN, les fragments d'ADN ainsi formés migrent plus rapidement que l'ADN intact lors de l'électrophorèse, donnant aux noyaux cellulaires l'aspect de comètes. La cryoconservation des ovocytes matures par vitrification a de nombreuses applications: alternative à la congélation d'embryons en FIV, préservation de la fertilité avant traitement gonadotoxique, développement du don d'ovocyte. La vitrification consiste à transformer un liquide en un état vitreux et utilise des agents cryoprotecteurs (CP) à haute concentration. Plusieurs centaines de naissances d'enfants en bonne santé ont été décrites . Néanmoins peu d'études ce sont intéressées aux effets à long terme de cette technique en particulier au plan génétique. L'objectif de ce travail a été dans un premier temps de développer et de valider une technique de test des comètes sur ovocyte de souris, puis d'utiliser ce test pour évaluer la génotoxicité du PrOH sur les ovocytes de souris qu'il soit employé seul ou inclus dans les solutions de vitrifications commercialisées pour la cryoconservation d'ovocytes humains. / Genetic toxicology is a discipline that aims to detect chemical or physical factors interact with the DNA of somatic and / or germ cells and in the absence of accurate repair, are likely to cause gene and / or chromosomal mutations. The comet assay is a simple, reproductive and rapid test to study primary DNA damage. This microelectrophoretic technique, is used to visualize denatured DNA fragments migrating out of the cell nucleus during electrophoresis. The image obtained is a ''comet'' with a distinct head consisting of intact DNA and a tail containing relaxed DNA loops or broken pieces of DNA. Oocyte vitrification techniques is booming in the world, with the key to many applications: alternative to IVF embryo freezing, fertility preservation before gonadotoxic treatment, development of oocyte donation. Oocyte Vitrification traps all the aqueous solutions in a vitreous solid phase, preventing any ice crystal formation, because of very high cooling rates and high cryoprotectants concentrations. vitrification-cryopreservation has led to several hundred live births with reassuring obstetrical and perinatal outcomes. However, little is known about the possible long-term consequences on human live births after oocyte vitrification. The objective of this work was initially to develop and validate a technique comet assay on mouse oocyte, then to evaluate on mature oocytes the genotoxic effects of PrOH solution and finally the genotoxic effects of three oocyte vitrification protocols used in human ART the genotoxic of three oocyte vitrification protocols used in human.

The latest model of tertiary structure of capsid protein of potato virus X (PVX CP) was used as a template to design new insertion sites suitable for the preparation of PVX-based antigen presentation system. Based on this model, seven insertion sites (A-G) located in putative surface loops were tested. As an antigen inserted into these sites was used 17 amino acids long epitope derived from human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein (E7 epitope) fused with either 6xHis tag or StrepII tag in both possible orientations (6xHis-E7 and E7-6xHis, StrepII-E7 and E7-StrepII). Prior to plant expression, modified PVX CPs were expressed in Escherichia coli MC1061. The results showed that only PVX CP carrying StrepII-E7 or E7-StrepII in the insertion site A formed virus particles. The results from transient expression experiments with modified PVX CPs in Nicotiana benthamiana showed that only the insertion site A (located between 24th and 25th amino acid in the PVX CP) could tolerate all tested inserts. Importantly, viral particles were detected only in the presence of StrepII tag and their stability was affected by the insert orientation (StrepII-E7 vs. E7-StrepII) as only the viral particles presenting E7-StrepII could be purified. Besides the preparation of PVX-based antigen presentation system, an...

Os corantes são amplamente usados como aditivos na indústria alimentícia. Atualmente, diversas pesquisas têm demonstrado que alguns corantes de origem natural, como por exemplo, polifenóis, antocianinas, carotenóides, dentre outros, são dotados de efeitos benéficos, atuando como promotores da saúde, o que desperta o interesse na produção de alimentos com propriedades funcionais. A polpa de açaí é rica em pigmentos polifenóis e antocianinas, e o óleo de buriti é a maior fonte de - caroteno já identificada em frutos até o momento. No entanto, ainda existem poucos estudos evidenciando os seus efeitos bioativos. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial mutagênico e antimutagênico da polpa de açaí e do óleo de buriti, frente aos danos ao DNA induzidos pelo antitumoral doxorrubicina (DXR), em diferentes tecidos de camundongos Swiss. As metodologias envolvem o teste do micronúcleo em células da medula óssea e em sangue periférico e o ensaio do cometa em células sanguíneas, renais e hepáticas em dois diferentes protocolos de tratamento, sendo um agudo (gavagem e eutanásia após 24 horas) e um sub-agudo (gavagem por 14 dias e eutanásia 24 horas após a última gavagem). Em cada protocolo de tratamento, foram testadas 3 doses diferentes da polpa de açaí (3,33; 10,00 e 16,67g/kg p.c.), usando 8 grupos experimentais (n=6). Seguindo o mesmo delineamento experimental, para cada protocolo de tratamentnoto foram testadas 3 doses do óleo de buriti (100; 200 e 300 mg/Kg p.c.), diluído em óleo de milho, em 10 grupos experimentais (n=6). A DXR (16 mg/kg p.c.; i.p.) foi usada como controle positivo nos testes de antimutagenicidade. Nos ensaios com a polpa de açaí e com o óleo de buriti, em ambos os tratamentos, não houve diferença estatística significativa (p<0,05) entre os grupos tratados apenas com a polpa e o controle negativo, demonstrando ausência de efeitos genotóxicos e mutagênicos. Os tratamentos com as associações de polpa de açaí e DXR mostraram redução significativa (p<0,05) de danos ao DNA induzidos pela DXR em todos os órgão testados, no teste do micronúcleo e no ensaio do cometa, e o tratamento subagudo demonstrou ter sido mais efetivo na inibição da genotoxicidade induzida pela DXR. O óleo de buriti mostrou atividade antimutagênica significativa (p<0,05) em células sanguíneas, no tratamento agudo e no tratamento sub-agudo. No entanto, nota-se que o óleo de milho, usado como solvente nos experimentos com o óleo de buriti interferiu nos resuldados encontrados. A identificação e caracterização de pigmentos naturais polifenóis e antocianinas na polpa de açaí e carotenóides, tocoferóis e compostos fenólicos no óleo de buriti, mencionados na literatura como antimutagênicos e antigenotóxicos, pode justificar os resultados encontrados. Os efeitos antimutagênicos detectados na polpa de açaí e no óleo de buriti encorajam novos estudos, visto que estes podem ter seu uso amplamente explorado na indústria cosmética e farmacêutica, em ações de benefícios à saúde da população e, também na indústria alimentícia, no desenvolvimento de produtos com propriedades funcionais. / The dyes are widely used as additives in the food industry. Currently, several studies have shown that some dyes from natural sources, such as polyphenols, anthocyanins, carotenoids, among others, are endowed with beneficial effects, acting as health promoters, which raises the interest in the production of foods with functional properties. The açai is rich in polyphenols and anthocyanins pigments, and the buriti oil is the largest source of -carotene in fruit that has been identified so far. However, there are few studies showing the bioactive effects. The aim of this study was to evaluate the mutagenic and antimutagenic proprieties of the açai pulp and buriti oil, compared to DNA damage induced by the antitumoral doxorubicin (DXR) in different tissues of Swiss mice. The methods involve the micronucleus test in bone marrow and peripheral blood and the comet assay in blood cells, liver and kidney in two different treatment protocols, an acute (gavage and euthanized after 24 hours) and a sub-acute treatment (gavage for 14 days and euthanized 24 hours after the last gavage).In each treatment protocol, we tested three different doses of açai pulp (3.33, 10.00 and 16.67 g/kg b.w.), using eight experimental groups (n=6). Following the same experimental design for each protocol were tested three doses trataments of buriti oil (100, 200 and 300 mg/kg b.w.), diluted in corn oil, in 10 experimental groups (n = 6). The DXR (16 mg/kg b.w., ip) was used as positive control in the antimutagenicity tests. In tests with the pulp and buriti oil in both treatments, there was no statistically significant difference (p<0.05) between groups treated with pulp and negative control, demonstrating a lack of genotoxic and mutagenic . The treatments with associations of açai pulp and DXR showed a significant reduction (p<0.05) in the DNA damages induced by DXR in all organs tested, in the micronucleus test and comet assay, and subacute treatment showed have been more effective in inhibiting the genotoxicity induced by DXR. Buriti oil showed antimutagenic activity (p<0.05) in blood cells, to treat acute and subacute treatment. However, note that the corn oil used as solvent in experiments with buriti oil resuIts interfere in matches. The identification and characterization of natural pigments, polyphenols and anthocyanins in the açai pulp and carotenoids, tocopherols and phenolic compounds in the buriti oil, mentioned in the literature as antimutagenic and antigenotoxicity, can justify the results. The antimutagenic effects found in açai pulp and buriti oil encourage further studies, since they may have fully explored its use in cosmetic and pharmaceutical industry, in shares of health benefits to the population and also in the food industry in developing of products with functional properties.

A ação antimicrobiana da nanopartícula de prata (AgNP) favorece seu uso em diversos produtos. Sua toxicidade está relacionada com o tamanho da nanopartícula, seu estado de agregação e a capacidade em gerar espécies reativas de oxigênio (EsRO). O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos citogenotóxicos, como também o estresse oxidativo em eritrócitos de Trachinotus carolinus expostos à AgNP. Os peixes receberam, via injeção intraperitoneal, três diferentes doses de suspensão de AgNP, 3, 1.5 e 0.75 &#956;gAgNP/gpeixe. Após 12, 24, 36, 72 e 108 horas o sangue foi coletado para realizar o ensaio cometa e o teste do micronúcleo (MN) outras anormalidades nucleares (ANE), como também o fígado para a atividade enzimática da catalase. A AgNP demonstrou ser citogenotóxica, como também se capaz de promover o estresse oxidativo em Trachinotus carolinus. Os resultados mostram que os danos ao DNA e a ocorrência de MN e ANE apresentaram relação dose-resposta dependente. A redução no dano ao DNA mostrou estar relacionada com o aumento da atividade da catalase. / Silver nanoparticles (AgNP) are applied as antimicrobial agents to many manufactured products. Nanoparticles size, aggregation and its induction of reactive oxygen species (ROS) are associated with AgNP toxicity. This study was undertaken to examine the citogenotoxicity as well as oxidative stress of AgNP in Trachinotus carolinos erythrocytes. The fish received tree different doses of 3, 1.5 e 0.75 µgAgNP/gfish by intraperitoneal injection. Bloods samples were collected and at 12, 24, 36, 72 and 108 hours post-injection to perform the comet assay and the micronucleus test. Extract of liver were used to measure catalase activity. This study showed that AgNP is citogenotoxic to this species and is able to induce oxidative stress. The results showed that the DNA damage, micronucleus and nuclear abnormalities was dose dependent. The reduction of DNA damage exhibit a close relationship with catalase activity.

O processo de tratamento da madeira utiliza substâncias que geram compostos perigosos que podem contaminar os compartimentos ambientais. O presente estudo avaliou uma área sob influência da contaminação de solo proveniente das atividades de uma usina de tratamento de madeira desativada. A presença e o efeito de compostos mutagênicos em amostras ambientais foram utilizados como marcadores de exposição associada à avaliação de marcadores genéticos de efeito precoce em humanos, com foco em crianças como grupo sensível. Uma área 1750 m distante da usina, fora do quadrante dispersão preferencial atmosférica e em oposição à drenagem do local, foi utilizada como local de referência para a coleta de amostras e comparação. Extratos orgânicos de água de abastecimento, poeira de sótão e material particulado atmosférico fino (PM2,5) foram avaliados para mutagenicidade por meio do ensaio Salmonella/microssoma. Cobre (Cu), cromo (Cr), arsênio (As) e pentaclorofenol (PCP) foram quantificados em amostras de poeira do sótão. Os 16 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) prioritários foram avaliados nos extratos de PM2,5 e poeira do sótão. Crianças residentes no entorno da usina e na área de referência foram avaliadas quanto à presença de micronúcleos em amostras de sangue e mucosa oral, e danos primários no DNA, pelo ensaio cometa em linfócitos de sangue periférico. De acordo com a análise de metais, as residências perto da entrada da usina foram as mais afetadas. PCP foi identificado em amostras de poeira de sótão (0,49 mg/kg) e a concentração total de HPAs nesta matriz variou 0,40-13,31 mg/g, com maior dispersão. Todas as amostras de poeira do sótão em que a concentração total de HPAs estava acima de 2μg/g apresentaram resposta positiva para a atividade mutagênica. A contribuição dos HPAs para a mutagênese na poeira de sótão representou 10%, indicando que outros compostos podem contribuir para o efeito mutagênico. A atividade mutagênica e a concentração de HPAs nas amostras de PM2,5foram, de maneira geral, mais elevadas na área de risco, embora em alguns períodos de amostragem a área de referência atingiu valores semelhantes ou mesmo superiores. O efeito mutagênico e as concentrações de HPAs observados nas amostras de PM2,5 foram semelhantes aos valores encontrados em estudos que avaliaram áreas urbanas e com influência industrial. Extratos orgânicos de água de abastecimento não apresentaram mutagenicidade. As frequências de MN em linfócitos de sangue periférico e de células binucleadas na mucosa oral foram significativamente maiores no grupo de risco. Nos demais biomarcadores avaliados não foram observadas diferenças significativas entre os grupos. O conjunto de resultados indica a necessidade de novas avaliações utilizando grupo de referência menos suscetível às influências da área contaminada. O conjunto de dados coletados neste estudo indica a necessidade de uma avaliação mais cuidadosa dos biomarcadores individualmente e de um grupo de referência menos suscetível a influências da área contaminada. Apesar da ausência de diferenças significativas entre os grupos de risco e de referência em biomarcadores de danos no DNA avaliados em crianças, os resultados observados nas amostras de poeira de sótão e PM2,5 sugerem que a população esteve ou ainda está potencialmente exposta a substâncias capazes de causar efeitos adversos à saúde humana. / The mutagenic activity and the concentration of PAHs in PM2.5 samples were generally higher in the risk area, although in some periods the reference area has reached similar or even higher values. The mutagenic effect and the concentrations of PAHs recorded in the PM2.5 samples were similar to those found in studies that assessed areas of intense urban occupation and industrial influence. Organic extracts from supply water showed no mutagenicity. The MN frequencies in peripheral blood lymphocytes and binucleated cells of the oral mucosa were significantly higher in the risk group. No significant differences between children from the reference and risk area were observed in others genetic biomarkers assessed. The result set indicates the need for further evaluations using reference group less susceptible to the influences of the contaminated area. The set of data collected in this study indicates the need for a more cautious assessment of biomarkers individually, and a reference group less susceptible to influences from the contaminated area is necessary. Despite the absence of significant differences between the risk and reference groups in biomarkers of DNA damage assessed in children, the results in attic and PM2.5 samples suggest that the population was or is still potentially exposed to substances with strong negatives effects on human health.

Le sélénium est reconnu comme un micronutriment important pour l'homme et les animaux. Plusieurs études ont montré qu'une supplementation en sélénium dans le régime alimentaire pourrait être bénéfique contre les cancers du foie, du colon, du pancréas et de la prostate. Le mécanisme anti-carcinogène du sélénium se produit au niveau systémique, cellulaire et nucléaire. Ces processus peuvent également impliquer le système immunitaire et ne doivent pas être interprétés par un seul mécanisme. Jusqu'à présent son mécanisme d'action est encore inconnu. L'objectif de cette étude était d'étudier l'effet des composés du sélénium, à faibles concentrations, sur la capacité de réparation de l'ADN dans les cellules du cancer de la prostate LNCaP (p53 compétentes). Ce travail est divisé en trois parties. La première partie du travail a été consacrée à étudier l'effet des deux composés du sélénium (SS et SM) sur les propriétés cytotoxiques et génotoxiques de différents stress oxydatifs et non oxydatifs. Les résultats ont montré qu'un prétraitement avec une faible dose en Se stimulait la synthèse des sélénoprotéines, et protègait contre la toxicité et les dommages oxydatifs à l'ADN induites par les UVA ou H2O2, mais pas par MMS ou UVC. La deuxième partie a été consacrée à l'influence de la supplementation en sélénium sur la capacité de réparation de l'ADN. Notre travail a clairement montré l'augmentation de l'efficacité d'excision de certaines glycosylases que n'est pas nécessairement corrélée à une augmentation de l'expression génique et /ou protéiques. Enfin, la troisième partie de notre travail a été dédiée à l'optimisation de la technique Host Cell Reactivation (HCR) qui nous a permis d'étudier la capacité de réparation de l'ADN in cellulo, afin de cibler les partenaires impliqués dans la voie de signalisation affectées par la supplémentation en sélénium. En conclusion, nous pourront penser que le mécanisme d'action du sélénium est représenté par un délicat équilibre entre l'activation et la répression de l'activité de certaines protéines qui induit des changements conformationnels plus ou moins directement impliqués dans la réparation de l'ADN et la progression de la croissance cellulaire. / Selenium was recognized as an important micronutrient for both humans and animals. Several studies showed that increased selenium in the diet might be beneficial against liver, colon, pancreas and prostate cancer. The anticarcinogenic actions of Se occur at the systemic, cellular and nuclear level. These actions may also involve the immune system and thus cannot be interpreted by a single mechanism. Until now its mechanisms of action are not well understood. The objective of this study was to investigate the effect of selenocompounds at low doses on DNA repair capacity in the p53-proficient LNCaP prostate cancer cells. This work is divided into three parts. The first part of the work was devoted to study the effect of two selenocompounds (SS and SM) on the cytotoxic and genotoxic properties of various oxidative and non oxidative stresses. The results showed that low doses of Se pre-treatment stimulates selenoprotein synthesis, protects against toxicity and oxidative DNA damage induced by UVA or H2O2 but not by MMS or UVC. The second part of our investigation was devoted to the influence of selenium supplementation on DNA repair capacity. Our work clearly showed an increase in excision efficiency of the glycosylases activity that was not necessarily correlated with an increase of gene expression and/or protein levels. Finally, the third part of our work was devoted to the optimization of Host Cell Reactivation assay (HCR) to study the DNA repair capacity in cellulo, in order to target the partners involved in the signalling pathway affected by selenium supplementation. In conclusion, we could image that the mechanism of action of selenium is represented by a delicate balance between activation and repression of protein activity that induces conformational changes of several proteins more or less directly involved in DNA repair and progression of cell growth.

O câncer é a primeira causa de mortes por doença, após 1 ano de idade, até o final da adolescência, excetuando aquelas relacionadas aos acidentes e à violência. A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) afeta células linfoides e agrava-se rapidamente. São os tumores mais frequentes na infância e representam um terço de todas as neoplasias malignas nesta faixa etária. Em média, a taxa de cura excede 70%, todavia, apesar dos avanços das últimas décadas, os índices de crianças que apresentam recidiva da doença continua significativo. Danos endógenos ao DNA ocorrem numa frequência altíssima, além dos danos causados por terapias antitumorais. Alteração no reparo ao dano do DNA pode induzir mecanismos de resistência ao tratamento quimioterápico, resultando em aumento do reparo de lesões do DNA. Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é a via de reparo de DNA mais versátil e flexível nas células. Seus componentes estão sendo estudados como biomarcadores de prognóstico e terapias-alvo. No entanto, alguns relatórios têm abordado danos de DNA em Leucemia Linfoide Aguda (LLA) pediátrica. Neste estudo, realizamos um estudo de acompanhamento observacional em pacientes pediátricos para avaliar os danos do DNA pelo Ensaio Cometa Alcalino e expressão gênica da via de NER durante a indução da quimioterapia. Amostras de medula óssea (MO) ao diagnóstico, dia 15 (D15) e 30 (D30) do tratamento foram coletadas de 28 pacientes com LLA. Não houve aumento no índice de dano. No entanto, houve uma redução de células com baixo danos na comparação do D35 com o diagnóstico. Este resultado se confirmou em pacientes que apresentaram doença residual mínima positiva. A via de NER permaneceu constante, no entanto, em um único paciente, foi observada uma diminuição significativa da expressão dos genes, talvez devido ao silenciamento ou a regulação negativa das vias de reparo. Níveis de danos e reparação do DNA podem influenciar o resultado clínico, estar envolvidos na resistência aos fármacos e potencializar o risco de recidiva. Este é o primeiro estudo que avalia o dano ao DNA em amostras de MO de pacientes pediátricos com LLA. Apesar do pequeno número de pacientes alocados para o estudo, a partir dos achados é possível concluir que complexos de reparo merecem ser investigados a curto e a longo prazo. Acompanhamento dos resultados do paciente vai ajudar a elucidar a implicação dos nossos achados em taxas de cura e de recidiva. / Cancer is the leading cause of death by disease after 1 year old until the end of adolescence, except those related to accidents and violence. Acute Lymphoid Leukemia (ALL) affects lymphoid cells and worsens quickly. They are the most frequent tumors in childhood and account for a third of all malignancies in this age group. On average, the cure rate exceeds 70%, however, despite the progress of recent decades, rates of children with disease recurrence remains significant. Endogenous DNA damage occurs at a very high frequency, in addition to the damage caused by anti-tumor therapies. Change in the repair of DNA damage can induce resistance mechanisms to chemotherapy, resulting in increased repair of DNA lesions. Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is the more versatile and flexible DNA repair in cells. Its components are being studied as prognostic biomarkers and targeted therapies. However, there are some reports of DNA damage in pediatric Acute Lymphoid Leukemia (ALL). In this study, we conducted an observational follow-up study in pediatric patients to assess DNA damage by alkaline comet assay and gene expression of NER pathway during induction chemotherapy. Bone marrow (BM) samples at diagnosis, 15th (D15) and 30th (D30) of treatment were collected from 28 patients with ALL. There was no increase in damage index. However, there was a reduction of cells with low damage in comparison to the D35 diagnosis. This result was confirmed in patients with positive minimal residual disease. The NER pathway remained constant, however, in one patient, a significant decrease of gene expression was observed perhaps due to the silencing or down-regulation of repair pathways. Damage levels and DNA repair can influence the clinical result and may be involved in drug resistance and enhance the risk of recurrence. This is the first study to assess DNA damage in BM samples of pediatric patients with ALL. Despite the small number of patients allocated to the study, from the findings we conclude that repair complex deserves to be investigated in the short and long term. Monitoring patient’s outcomes will help to access the implication of our findings in cure and relapse rates.

A baixa eficiência e a dificuldade de reprodução de resultados da técnica de transferência gênica mediada por espermatozoides (TGME) têm como possível explicação à ativação de endonucleases espermáticas. Assim, a inibição desta enzima poderia evitar a fragmentação de DNA (exógeno e genômico), possibilitando assim, o uso de maiores concentrações de DNA exógeno, aumentando a eficiência e garantindo a reprodutibilidade da técnica. O ácido aurintricarboxílico (ATA) é um inibidor geral de endonucleases (HALLICK et al., 1977), inclusive das endonucleases espermáticas (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a inibição das endonucleases espermáticas, pelo ácido aurintricarboxílico (ATA). Para isso, três experimentos foram realizados: 1) avaliar a inibição das endonucleases espermáticas pela adição do ácido aurintricarboxílico, após incubação com DNA exógeno; 2) verificar a eficiência do ATA na inibição de fragmentação de DNA genômico e 3) detectar o aumento nos índices de internalização após o uso de ATA. Para o primeiro experimento, um ensaio de digestão plasmidial com os plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3 e três concentrações de ATA (10&micro;M, 25&micro;M e 50&micro;M) foram testados. As digestões dos vetores plasmidiais ocorreram pela incubação dos plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3, com e sem a presença de ATA, com extratos espermáticos. As incubações ocorreram durante 1 hora à 37ºC e os produtos foram analisados por eletroforese (2 horas, 100mV) em gel de agarose 0,7%. Os resultados foram avaliados em escala de cruzes, no qual 1 foi considerado digestão total dos plasmídeos e 3, a não digestão. Os resultados foram analisados em nível de significância de 5%. Os resultados demonstraram diferenças nas digestões dos dois vetores plasmidiais, sendo o pmGENIE3 mais susceptível à degradação pelo extrato espermático, demonstrando ausência de bandas em algumas replicatas (mediana=1). O PCX-EGFP apresentou inibição parcial da degradação já com 10&micro;M de ATA. Já o pmGENIE só apresentou inibição da degradação com 25 ou 50&micro;M de ATA. Assim a concentração utilizada nos experimentos consecutivos foi a de 50&micro;M. Para o experimento 2, espermatozoides de camundongos da linhagem Bl-6/DBA (F1) foram incubados com duas concentrações (500 ou 1000ng) do plasmídeo PCX-EGFP, com ou sem pré-incubação com ATA. As incubações ocorreram durante 5 horas, em ar com 5% de CO2 à 37ºC. Assim, os espermatozoides foram submetidos ao teste de susceptibilidade à denaturação ácida e ao ensaio de cometa alcalino para verificar possível fragilidade da cromatina. Os dados demonstraram que o uso do ATA em espermatozoides murinos leva à fragilidade do genoma, independente de serem incubados com DNA exógeno e a concentração do mesmo. Além disso, foi possível verificar que pode existir um limiar de concentração ótima para que as endonucleases causem fragmentação do DNA cromossomal, o qual foi de 500ng. O uso de concentrações maiores, como 1000ng, pode ter agido como fator protetor ao DNA genômico, podendo este DNA exógeno ter sido o alvo primário das endonucleases, já que quando as amostras foram incubadas com essa concentração de plasmídeo, não houve altos índices de fragmentação no DNA endógeno. No experimento 3, espermatozoides de camundongos foram incubados com 500 ou 1000ng de PCX-EGFP/106 células, sendo ou não pré-incubados com ATA. O DNA genômico das células espermáticas foi extraído pelo método de fenol clorofórmio, diluído para concentração de 1ng/&micro;l e submetidos à quantificação de DNA plasmidial pela técnica de quantificação absoluta em tempo real (qPCR). Os resultados demonstraram que o ATA não melhorou a eficiência de incorporação, já que tanto na concentração de 500 quanto na de 1000ng de DNA exógeno, a porcentagem foi menor (0,001% para os dois grupos) em relação aos grupos nos quais este não foi utilizado. Os grupos em que o ATA não foi utilizado não apresentaram diferença entre si demonstrando que a quantidade de 500ng de DNA exógeno foi suficiente na internalização deste ao espermatozoide, sendo a porcentagem de incorporação maior do que 1000ng (0,20% contra 0,10%). Contudo, o uso do inibidor de endonucleases, ao invés de aumentar os índices de incorporação apresentou resultados opostos, indicando que seu uso não trouxe melhorias para a técnica de TGME. / The low efficiency and low repeatability of sperm-mediated gene transfer (SMGT) could be due to the activation of sperm endonucleases. The inhibition of this enzyme would avoid genomic DNA fragmentation enabling the use of higher concentrations of exogenous DNA, increasing the efficiency and ensuring the reproducibility of this technique. Aurintricarboxilic acid (ATA) is a general inhibitor of endonucleases (HALLICK et al., 1977), including sperm endonucleases (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). This study aimed to evaluate the inhibition of sperm endonucleases using the aurintricarboxilic acid (ATA). For that, three experiments were set: 1) evaluate the inhibition of sperm endonucleases by adding aurintricarboxilic acid after incubation with exogenous DNA, 2) study the inhibition efficiency of ATA in genomic DNA fragmentation and 3) detect exogenous DNA internalization after the use of ATA. For the first experiment, a plasmid digestion assay with pmGENIE3 and PCX-EGFP and three concentrations of ATA (10&micro;M, 25&micro;M and 50&micro;M) were tested. The digestion of plasmid vector occurred by incubation of PCX-EGFP and pmGENIE3 with and without the presence of ATA with sperm extracts. Incubations took place for 1 hour at 37°C and the products were analyzed by electrophoresis (2 hours, 100mV) in 0,7% agarose gel. The results were evaluated on a cross scale whereas 1 was considered a total plasmid digestion and 3 no digestion. The results were analyzed with a significance level of 5%. The results show differences in the digestion of the two plasmid vectors, being pmGENIE3 more susceptible to degradation by sperm extract, demonstrating absence of bands in some replicates (median = 1). The PCX-EGFP showed a parcial inhibition of the degradation using 10&micro;M ATA. PmGENIE3 presented inhibiting of degradation only using 25 or 50&micro;M of ATA. Thus, the concentration used in the consecutives experiments was 50&micro;M. For experiment 2, sperm from Bl-6/DBA (F1) mice strain were incubated with two concentrations (500 or 1000ng) of the PCX-EGFP plasmid, with and without pre-incubation with ATA. Incubation took place for 5 hours, with 5% CO2 in air, at 37°C. Sperm samples were subjected to acid denaturation susceptibility test and alkaline comet assay to check for possible chromatin fragility. The data showed that the use of ATA in murine sperm leads to a fragility of their genome, independently of the incubation with exogenous DNA and its concentration. Result showed that there might be a threshold concentration for chromosomal DNA fragmentation caused by endonucleases, which was 500ng of plasmid. The use of higher concentrations, as 1000ng, may be a protective factor for genomic DNA integrity, since exogenous DNA seems to be the primary target of endonucleases, showed by, lower DNA fragmentation levels. In experiment 3, sperm were incubated with 500 or 1000ng PCX-EGFP/106 cells, pre-incubated or not with ATA. Genomic DNA was extracted by phenol chloroform method, diluted to concentrations of 1ng/&micro;l and subjected to quantification of plasmid DNA insertions by absolute quantification in real-time PCR (qPCR). The results showed that ATA did not improve the efficiency of DNA internalization, whereas both concentration of 500 and 1000ng presented a lower percentage of exogenous DNA integration (0.001% in both groups) compared with the groups in which ATA was not used. The groups without ATA did not differ indicating that the amount of 500ng of DNA was able to integrate exogenous DNA to sperm, and have higher percentage of incorporation compared to 1000ng (0,20% versus 0,10%). Thereby, the use of an endonuclease inhibitor instead of increasing integration indexes showed opposite results, indicating that its use did not bring improvements to the SMGT technique.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-09-10T00:55:01Z No. of bitstreams: 1 Nilton C N Santos Tese Geno Cito Endo 10 ago 20h.pdf: 2096544 bytes, checksum: fd3a63f3f5235dae758262d72d8a3bb2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-09-10T00:55:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nilton C N Santos Tese Geno Cito Endo 10 ago 20h.pdf: 2096544 bytes, checksum: fd3a63f3f5235dae758262d72d8a3bb2 (MD5) Previous issue date: 2015-06-29 / Pulp therapy for deciduous teeth is the last resort for preventing tooth loss, but among the products used for this, i.e. so-called filling pastes, none is considered to be ideal. The objective of this study, using the micronucleus test on the bone marrow of mice and the comet assay on human lymphocytes, was to evaluate the genotoxic and cytotoxic effects of four filling pastes that are used in this therapy: zinc oxide, calcium hydroxide P.A., mineral trioxide aggregate and an iodoform paste (Guedes-Pinto paste). To perform the micronucleus test, male Swiss mice (Mus musculus) were divided into groups of ten animals each: four groups were each exposed to one of the filling pastes, administered intraperitoneally at dilutions of 1/10, 1/50, 1/500 and 1/1000. Cyclophosphamide was used as the positive control. The negative controls used were the dilution vehicles: dimethylsulfoxide (DMSO) for the Guedes paste and zinc oxide; and phosphate-buffered saline solution (PBS) for the calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate. The animals were sacrificed 24 h and 48 h after the treatment. The bone marrow was extracted, in order to calculate the micronucleus occurrence rate in 1000 polychromatic erythrocytes (PCE) in each of the animals, under an optical microscope (1000 X), in a blinded test. Cytotoxicity was evaluated by determining the PCE/NCE (normochromatic erythrocyte) ratio in 200 erythrocytes/animal. For the comet assay, human lymphocytes were cultured in different dilutions of each of the filling pastes (1:500, 1:750, 1:1000 and 1:2000), for 3 h at 37 ?C, under an atmosphere containing 5% CO2. Two positive controls were used: methyl-methanesulfonate (0.4 ?M) for the calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate; and doxorubicin (0.6 ?M) for the Guedes paste and zinc oxide. Two negative controls were also used here: distilled water for the calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate; and DMSO for the Guedes paste and zinc oxide. Comets were identified by means of fluorescence microscopy (400 X), and 100 of them were counted on each of the three slides that were analyzed for each drug test. The statistical analysis on the results from the micronucleus test was performed using the conditional test for comparing proportions in situations of rare events. Analysis of variance, followed by the Tukey test, was used to assess the PCE/NCE ratio obtained from the different treatments and also to compare the means from the DNA damage indices that were obtained through the comet test, using the Prisma software, version 4.0. The micronucleus occurrence rate was significantly higher among the animals treated with Guedes paste, at all the dilutions tested and at both sacrifice times and also among the animals treated with zinc oxide and sacrificed 48 h after treatment at the dilutions of 1:50, 1:500 and 1:1000. Cytotoxic effects from these pastes were detected in the animals sacrificed at both times. Calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate did not present any cytotoxic or genotoxic effects. The results obtained from the comet assay also showed that zinc oxide and Guedes paste presented genotoxicity, whereas calcium hydroxide P.A. and mineral trioxide aggregate did not. These results show that there is a need to reassess the use of zinc oxide and Guedes paste and provide encouragement for conducting additional studies to evaluate the genotoxicity and cytotoxicity of these pastes. / A terapia pulpar de dentes dec?duos se constitui no ?ltimo recurso de preven??o da perda dent?ria, mas, dentre os produtos empregados para tal, as denominadas pastas obturadoras, nenhum ? considerado como ideal. O objetivo deste trabalho foi avaliar, com o uso do teste de micron?cleo em medula ?ssea de camundongo e do ensaio cometa em linf?citos humanos, os efeitos citot?xicos e genot?xicos de quatro pastas obturadoras utilizadas nesta terapia: ?xido de zinco, hidr?xido de c?lcio P.A., agregado tri?xido mineral e uma pasta iodoformada (pasta Guedes-Pinto). Para realiza??o do teste de micron?cleo, camundongos Swiss (Mus musculus), machos, foram divididos em grupos de dez animais, que foram expostos ?s pastas obturadoras, administradas via intraperitoneal nas dilui??es de 1/10, 1/50, 1/500 e 1/1000. Ciclofosfamida foi utilizada como controle positivo. Os controles negativos foram: dimetilsulf?xido (DMSO) para a pasta Guedes-Pinto e ?xido de zinco; e solu??o salina tamponada (PBS) para o hidr?xico de c?lcio P.A. e agregado trioxido mineral. Os animais foram sacrificados 24h e 48h ap?s tratamento, a medula ?ssea foi extra?da e foram analisados 1000 eritr?citos policrom?ticos (PCE) de cada um dos animais, sob microscopia ?ptica (1000X) e em teste cego. A citotoxicidade foi avaliada pela rela??o PCE (eritr?cito policrom?tico) / NCE (eritr?cito normocrom?tico) em 200 eritr?citos/animal. Para o ensaio cometa, linf?citos humanos foram cultivados nas dilui??es de 1:500, 1:750, 1:1000 e 1:2000 das pastas obturadoras, durante 3h, a 37?C, em atmosfera de 5% de CO2. Foram utilizados dois controles positivos: metil-metanosulfonato (0,4?M) para o hidr?xido de c?lcio P.A. e agregado tri?xido mineral, e doxorrubicina (0,6 ?M) para a pasta Guedes-Pinto e ?xido de zinco. Foram tamb?m dois os controles negativos utilizados: ?gua destilada para o hidr?xido de c?lcio P.A. e agregado tri?xido mineral, e DMSO para pasta Guedes-Pinto e ?xido de zinco. A identifica??o do cometa foi realizada sob microscopia de fluoresc?ncia (400X), sendo computados 100 deles em cada uma das tr?s l?minas analisadas para cada droga teste. A an?lise estat?stica dos resultados do teste de micron?cleo foi realizada com o uso do teste condicional para compara??o de propor??es em situa??o de eventos raros. An?lise de vari?ncia, seguida do teste de Tukey, foram utilizados para avalia??o da rela??o PCE/NCE obtida com os diferentes tratamentos e tamb?m para compara??o das m?dias dos ?ndices de danos ao DNA obtidos no ensaio cometa com o software Prisma vers?o 4.0. A ocorr?ncia de micron?cleos foi significativamente maior nos animais tratados com a pasta Guedes-Pinto em todas as dilui??es testadas, nos dois tempos de sacrif?cio e tamb?m para os animais tratados com ?xido de zinco e sacrificados 48h ap?s tratamento, nas dilui??es 1:50; 1:500 e 1:1000. Efeitos citot?xicos destas pastas foram detectados nos animais sacrificados nos dois tempos. O hidr?xido de c?lcio P.A. e o agregado tri?xido mineral n?o apresentaram efeitos citot?xicos nem genot?xicos. Os resultados obtidos com o ensaio cometa tamb?m apontaram para a genotoxicidade do ?xido de zinco e pasta Guedes-Pinto, e n?o do hidr?xido de c?lcio P.A. e agregado tri?xido mineral. Estes resultados mostram a necessidade de reavalia??o do uso do ?xido de zinco e pasta Guedes-Pinto e suscitam a realiza??o de estudos adicionais avaliando a genotoxicidade e citotoxicidade destas pastas.

<p>Generation of DNA damage is regarded to be an important initial event in the development cancer. Consequently, a battery of tests have been developed to detect different types of genotoxic effects in order to be able to predict the potential genotoxicity and mutagenicity of chemicals, including both pharmaceutical drugs and various types of environmental and occupational agents, as well as dietary factors. The aim of this thesis was to evaluate whether the combination of the comet assay and the extended-term cultures of human lymphocytes (ETC) can be used as an alternative <i>in vitro</i> system to more commonly used transformed mammalian cell lines, and primary cell cultures from humans, when testing the potential genotoxicity of chemicals. </p><p>Using the comet assay, a panel of reference compounds showed that the ETC were found to detect the DNA-damaging effects with no remarkable difference to what has been reported in other cell types. Moreover, in comparison with a well-established rodent cell line, the mouse lymphoma L5178Y cells, the ETC showed similar sensitivity to the DNA damaging effects of the genotoxic agents hydrogen peroxide and catechol. Although there was an interindividual variation in induced DNA damage and the subsequent repair when using ETC from different blood donors, it did not seem to be of crucial importance for the identification of DNA-damaging agents. The demonstrated difference in sensitivity to catechol-induced DNA damage between freshly isolated peripheral lymphocytes and ETC may very well be due to their different proliferative status but despite this difference, both <i>in vitro</i> systems were able to identify catechol as a DNA-damaging agent at the same concentration.</p><p>Based on these results, it is proposed that the ETC and the comet assay are a useful combination when testing for the potential DNA damaging effects of chemicals. Representing easily cultivated cells possessing the normal human karyotype, where one blood sample can be used for numerous experiments performed over a long time, extended-term cultures appear to be a useful alternative, both to transformed mammalian cell lines, and primary cell cultures from humans. In fact, the extended-term lymphocytes, with or without S9 and/or lesion specific DNA repair enzymes, should be used more frequently when screening for the potential genotoxicity of chemicals.</p>