Submitted by MARIANA RILLO SATO null (marillosato@gmail.com) on 2016-02-22T18:19:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertação FINAL - COM FICHA.pdf: 2624639 bytes, checksum: 73f8b5a016f99a538e050ac383d48e8e (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-02-24T14:12:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sato_mr_me_arafcf_par.pdf: 1019774 bytes, checksum: ef4be326766e21e326047c976e98d864 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-24T14:12:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sato_mr_me_arafcf_par.pdf: 1019774 bytes, checksum: ef4be326766e21e326047c976e98d864 (MD5) Previous issue date: 2016-02-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Tuberculosis (TB) is known worldwide as the leading infectious disease of chronic evolution in which the abandonment of treatment before the recommended period tends to cause the development of more severe disease, such as the appearance of resistant strains. Copper interacts with biologically active ligands developing copper(II) complex with activities antimicrobial. Nanostructured lipid carriers (NLCs) have gained prominence in the pharmaceutical field, since they have the ability to compartmentalize efficiently lipophilic drugs and modify their properties and behavior in the biological environment. The aims of this study was to evaluate the potential of copper(II) complexes-loaded NLCs applicable in the study against Mycobacterium tuberculosis. Copper(II) complexes containing isoniazid binder were obtained and they were entitled C1, C2, and C3 where they have co-binders anionic chloride, cyanate and thiocyanate, respectively. NLCs were obtained by fusion-emulsification technique, formulations were obtained by Ultra turrax at 5000 rpm for 10 minutes followed by sonicator at 8% amplitude for 20 minutes to obtain stable NLCs, those were incorporated of 3.50% and 0.50% to surfactant poloxamer 407 and cetrimonium bromide, respectively, and 2.07%, 2.50% and 0.88% of polyoxyethylene stearate lipids, triglycerides of capric acid/caprylic and ethoxylated hydrogenated castor oil 40 OE (F32) or castor oil (F38), respectively. Copper(II) complexes were incorporated into NLCs (F32.OE.C1, F32.OE.C2, F32.OE.C3 and F38.OR.C1, F38.OR.C2, F38.OR.C3) and characterized by diameter (Dmn) , polydispersivity index (PDI) and zeta potential (ZP) for 1, 15, 30, 45 and 60 days, which revealed homogeneous dispersion and excellent physical stability over the same period; the atomic force microscopy confirmed that developed NLCs are spherical particles dispersions at nanometer scales; differential scanning calorimetry revealed that the constituents used in the formulations interacted in the systems and confirmed that copper(II) complexes were incorporated in the NLCs. The antimicrobial activity of the complexes against M. tuberculosis H37Rv was determined by the resazurin microdilution assay demonstrated potential anti-TB when complexes were incorporated into NLCs. Cytotoxicity assay in murine macrophage-like cells J774A.1 (ATCC TIB-67) e MRC-5 (ATCC-CCL-171) for 24 h and acute toxicity of the complex against Artemia salina L (Artemiidae) showed the formulations have toxicity in all tested concentrations; although published reports indicated the safety of the components used of the formulations, studies should be conducted in animal models to assess the acute toxicity. These results suggest that NLCs have potential application in the study against Mycobacterium tuberculosis. / A Tuberculose (TB) é mundialmente conhecida como a principal doença infecto-contagiosa de evolução crônica, em que o abandono do tratamento antes do período recomendado tende a ocasionar o desenvolvimento de casos mais graves da doença, gerando o aparecimento de cepas resistentes. O cobre interage com ligantes biologicamente ativos desenvolvendo complexos de cobre(II) com ações antimicrobiana. Carreadores lipídicos nanoestruturados (CLNs) vêm se destacando na área farmacêutica, pois apresentam a capacidade de compartimentalizar, de maneira eficiente fármacos lipofílicos e de modificar suas propriedades e comportamento em meio biológico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de CLNs acrescidos de complexos de cobre(II) aplicáveis no estudo frente ao Mycobacterium tuberculosis. Foram obtidos 3 complexos de cobre(II), intitulados C1, C2 e C3 que contem o ligante isoniazida e os co-ligantes aniônicos cloreto, tiocianato e cianato, respectivamente. Os CLNs foram obtidos pela técnica de fusão-emulsificação, testando-se diversas formulações por Ultra turrax a 5000 rpm por 10 minutos e por sonicador com amplitude 8% por 20 minutos até a obtenção de CLNs estáveis, que foram constituídos de 3,50% e 0,50 % de poloxamer 407 e brometo de cetrimônio, respectivamente, e de 2,07%, 2,50% e 0,88% de estearato de polioxietileno, triglicérides do ácido cáprico/caprílico e óleo de rícino hidrogenado e etoxilado 40 (F32) ou óleo de rícino (F38), respectivamente. Os complexos de cobre(II) foram incorporados nos CLNs (F32.OE.C1, F32.OE.C2, F32.OE.C3, e F38.OR.C1, F38.OR.C2, F38.OR.C3), e caracterizados por diâmetro hidrodinâmico médio (Dnm), índice de polidispersidade (IPD) e potencial zeta (PZ) por 1, 15, 30, 45 e 60 dias, revelando homogeneidade da dispersão e excelente estabilidade física; a microscopia de força atômica confirmou que os CLNs tratam-se de dispersões de partículas esféricas em escalas nanométricas; a calorimetria exploratória diferencial revelou que os componentes utilizados nas formulações interagiram para formação do sistema e que os complexos de cobre(II) foram incorporados nos CLNs. A atividade antimicrobiana dos complexos, frente ao M. tuberculosis H37Rv determinada pelo ensaio de microdiluição com Resazurina evidenciaram potencialização da ação anti-TB pela incorporação dos complexos nos CLNs. Os ensaios de citotoxicidade frente à linhagem de macrófagos J774A.1 (ATCC TIB-67) e de MRC-5 (ATCC-CCL-171) em 24 h e a toxicidade aguda dos complexos frente à Artemia salina L., mostraram que as formulações apresentaram toxicidade em todas as concentrações testadas; apesar de relatos da literatura indicarem a segurança dos componentes das formulações, estudos devem ser realizados em modelos animais para avaliar a toxicidade aguda. Os resultados sugerem que os CLNs apresentam aplicação potencial no estudo frente ao Mycobacterium tuberculosis.

[pt] Foram sintetizados 16 complexos de cobre(II) coordenados com seis aminoácidos presentes na placa b-amilóide, que está associada à Doença de Alzheimer - ácido aspártico, ácido glutâmico, metionina, glicina, serina e arginina, outros dois aminoácidos também encontrados no cérebro - cisteína e homocisteína, além da L-carnitina e acetil-L-carnitina que vêm sendo utilizados como suplemento alimentar em pacientes com doenças neurodegenerativas. Nosso objetivo foi verificar a afinidade do cobre(II) com estes aminoácidos, uma vez que o envelhecimento provoca aumento no cérebro tanto das concentrações de íons cobre como dos níveis de todos estes aminoácidos (que são consequência de fragmentações peptídicas). Por esta razão, procurou-se trabalhar in vitro com condições próximas ao meio biológico utilizando apenas água deionizada como solvente. Os complexos obtidos foram caracterizados pelas seguintes técnicas: análise elementar (espectrometria de absorção atômica e CHN), condutimetria, análise termogravimétrica, ressonância paramagnética eletrônica, voltametria cíclica e espectroscopia no infravermelho. Foi possível verificar que, exceto a acetil-L-carnitina, todos se comportam como ligantes bidentados e complexam facilmente ao cobre(II). Ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, metionina, glicina e arginina se coordenaram através do átomo de oxigênio do grupo carboxilato e do átomo de nitrogênio do grupo amino, cisteína e homocistéina através do átomo de enxofre e do átomo de nitrogênio do grupo amino, L-caritina através do átomo de oxigênio do grupo carboxilato e do átomo de oxigênio alcoólico e acetil-L-carnitina se coordena monodentadamente através do átomo de oxigênio do grupo carboxilato. / [en] Sixteen complexes of copper(II) with six amino acids that are present in the b-amyloid peptide, which is associated with Alzheimer’s disease - aspartic acid, glutamic acid, methionine, glycine, serine and arginine -, two amino acids also found in the brain - cysteine and homocysteine -, as well as L-carnitine and acetyl-L-carnitine, which have been used as food supplement in patients with neurodegenerative diseases, were studied. Our aim was to determine the affinity of copper(II) with these amino acids, since aging causes an increase in brain concentrations of copper ions as well as in the level of all of these amino acids, as a consequence of peptide fragmentation. For this reason, we decided to do an in vitro study in similar conditions as the biological environment, using only deionized water as solvent. These compounds were characterized through the following techniques: elementary analysis (atomic absorption spectrometry and CHN), conductimetry, thermogravimetric analysis, electron paramagnetic resonance, electrochemical analysis, and infrared spectroscopy. It was possible to verify that, except for acetyl-L-carnitine, all amino acids behaved as bidentate ligands. They all form complexes with copper(II) easily. Aspartic acid, glutamic acid, serine, methionine, glycine and arginine coordinate through the oxygen atom of the a-carboxylate group and the nitrogen atom of the amine group. Cysteine and homocysteine coordinate through the sulfur atom and the nitrogen atom of the amine group, L-Carnitine coordinates through one oxygen atom of the carboxylate group and one oxygen atom of the alcohol group, and acetyl-L -carnitine coordinates through the oxygen atom of the carboxylate group.

[pt] Este trabalho descreve a síntese e caracterização de quatro complexos de cobre (II) e quatro complexos de zinco (II), com dipeptídeos, no estado sólido. Os dipeptídeos envolvidos foram: glicil-glicina, glicil-valina, metionil-metionina, metionil-glicina e cisteinil-glicina, cujos aminoácidos fazem parte de algumas proteínas envolvidas em processos de neurodegeneração, mais especificamente na doença de Alzheimer. Embora os mecanismos que desencadeiam esta patologia não estejam ainda totalmente esclarecidos, sabe-se que os íons metálicos, como o cobre (II) e o zinco (II), interagem com o peptídeo beta-amilóide. Acredita-se que tais interações favoreçam a formação de agregados protéicos sólidos deste peptídeo, observados nos cérebros de pacientes com essa doença. Dessa forma, a obtenção e o estudo de modelos simples no estado sólido, sintetizados em condições próximas ao meio biológico, podem permitir uma melhor compreensão de possíveis interações de tais metais neste sítio protéico. Os compostos obtidos foram caracterizados utilizando as seguintes técnicas: análise elementar, absorção atômica, espectroscopia de infravermelho, espectroscopia Raman, espectroscopia de ultravioleta-visível, termogravimetria, RPE (para os complexos de cobre) e condutivimetria. Para os complexos de zinco, foram realizados cálculos teóricos mecânico-quânticos para obtenção de parâmetros geométricos e espectros de infravermelho. A análise dos compostos obtidos mostrou que os complexos de cobre e zinco com os dipeptídeos estão coordenados por átomos de oxigênio e nitrogênio. Nos complexos de peptídeos contendo enxofre, a coordenação também ocorre pelo átomo de enxofre (cobre com metionil-metionina e metionil-glicina e zinco com cisteinil-glicina). Os compostos obtidos para ambos os metais na proporção metal-ligante (1:1) mostram comportamento diferente dos estudos em solução e aqueles obtidos na proporção metal-ligante (1:2) mostram comportamento similar a complexos de metais com aminoácidos. / [en] This work describes the synthesis and characterization of copper (II) and zinc (II) complexes, with dipeptides in solid state. The dipeptides involved were: glycyl-glycine, glycyl-valine, methionyl-methionine, methionyl-glycine and cysteinyl-glycine, whose aminoacids take part in some proteins involved in neurodegeneration processes, more specifically in Alzheimer’s disease. Although the mechanisms that trigger this pathology are still not totally clear, it is known that metallic ions, such as copper (II) and zinc (II) interact with the beta-amyloid peptide. It seems that such interactions favor the formation of solid proteic aggregates of this peptide, observed in the brains of patients with Alzheimer’s disease. Thus, the obtaining and study of simple models in the solid state, synthesized in similar conditions to the biological medium, may allow a better understanding of the possible interactions of such metals in this proteic site. The compounds obtained were characterized using the following techniques: elemental analysis, atomic absorption, infrared spectroscopy, Raman spectroscopy, ultraviolet-visible spectroscopy, thermogravimetry, EPR (for the copper complexes) and conductivimetry. For the zinc complexes, quantum-mechanical theoretical calculations were performed to obtain geometrical parameters and infrared spectra. The analysis of the compounds showed that the copper and zinc complexes with dipeptides are coordinated through oxygen and nitrogen atoms. In complexes of dipeptides containing sulfur, coordination trough the sulfur atom occurs too (copper with methionyl-methionine and methionyl-glycine and zinc with cysteinyl-glycine). The compounds obtained for both metals at the metal-ligand ratio (1:1) behave differently from those studied in solution e those obtained in the metal-ligand ratio (1:2) show similar behavior of metal complexes with aminoacids.

Neste trabalho alguns complexos diimínicos de cobre(II) com ligantes do tipo base de Schiff, já estudados em nosso laboratório, além de um novo complexo de zinco foram sintetizados e caracterizados por análise elementar, espectroscopias UV/Vis, Infravermelho e de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR). Estudos sobre a reatividade destes complexos de cobre(II) frente à oxidação de carboidratos por oxigênio molecular foram então realizados. Estes estudos envolveram várias etapas, com variação das concentrações do catalisador, do substrato e do tampão e variação do pH, verificando-se a influência de cada um destes fatores na cinética de reação. Para tentar entender a interação da albumina bovina (BSA) com os complexos diimínicos de cobre(II) estudados, foram realizados experimentos utilizando-se a técnica de dicroísmo circular e espectroscopia eletrônica. A estabilidade termodinâmica relativa dos vários compostos foi assim determinada, estimando-se os respectivos valores das constantes de estabilidade. Experimentos sobre a atividade oxidante destes complexos frente à albumina bovina, causando danos oxidativos à proteína, também foram efetuados, determinando-se a formação de grupos carbonil na proteína, que foram monitorados espectrofotometricamente, através da obtenção das correspondentes dinitrofenil-hidrazonas, pela reação com dinitrofenil-hidrazina (DNPH). Através da técnica de EPR, foram realizados estudos para a detecção e identificação de espécies radicalares na interação da albumina com os complexos de cobre(II) em presença de peróxido de hidrogênio, com o uso de um captador de spin apropriado. Estudos sobre as possíveis interações dos complexos de cobre(II) com a albumina humana (HSA) e com o plasma sanguíneo foram realizados através das técnicas de EPR e SDS-PAGE. Além disso, a reatividade dos complexos de cobre(II) frente a glutationa, um agente redutor presente em alta concentração no citosol, foi investigada através de experimentos de fluorescência. Finalmente, a influência dos complexos imínicos de cobre(II) sobre a respiração mitocondrial foi investigada, já que estes complexos se mostraram indutores eficientes de apoptose frente a diferentes células tumorais. Para este estudo utilizou-se um oxígrafo para monitorar o consumo de oxigênio durante a respiração mitocondrial, em presença dos complexos de cobre estudados. / In this work some copper(II) complexes with Schiff base ligands, already studied in our laboratory, have been prepared, as well as a new similar zinc complex. After being characterized, especially by spectroscopic techniques (UV/Vis, IR, and EPR), these complexes had their reactivity as catalysts for the oxidation of carbohydrates by molecular oxygen verified. The influence of different factors on the kinetics of reaction, such as variation of the catalyst concentration, substrate concentration, buffer concentration and pH of the solution, was investigated. In order to understand the possible interactions of the copper(II) complexes studied with the protein albumine, studies using CD and electronic spectroscopies were carried out by adding the copper complexes to bovine serum albumine (BSA), and determining the corresponding relative stability constants for each complex. The activity of such copper complexes as oxidant agents toward the protein was also verified, with the formation of carbonyl groups in the protein observed by monitoring spectrophotometrically the corresponding dinitrophenylhydrazones, after reaction with dinitrophenylhydrazine (DNPH). By using EPR spectroscopy and an appropriate spin scavenger, reactive oxygen species were detected and identified as a result of the oxidative damage to the protein occurring in the presence of the copper complexes and hydrogen peroxide. Interactions of the human serum protein (HSA) and human plasma with the copper complexes studied were verified by EPR and SDS-PAGE techniques. Additionally, the reactivity of these complexes toward the reductive agent glutathione, present in the citosol at high concentration, was investigated by fluorescence measurements. Finally, the influence of the complexes in the mitochondrial respiration was verified, since those compounds are able to induce efficiently apoptosis in the presence of different tumoral cells, monitoring the oxygen consumption with a selective oxygen electrode

Neste trabalho alguns complexos diimínicos de cobre(II) com ligantes do tipo base de Schiff, já estudados em nosso laboratório, além de um novo complexo de zinco foram sintetizados e caracterizados por análise elementar, espectroscopias UV/Vis, Infravermelho e de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR). Estudos sobre a reatividade destes complexos de cobre(II) frente à oxidação de carboidratos por oxigênio molecular foram então realizados. Estes estudos envolveram várias etapas, com variação das concentrações do catalisador, do substrato e do tampão e variação do pH, verificando-se a influência de cada um destes fatores na cinética de reação. Para tentar entender a interação da albumina bovina (BSA) com os complexos diimínicos de cobre(II) estudados, foram realizados experimentos utilizando-se a técnica de dicroísmo circular e espectroscopia eletrônica. A estabilidade termodinâmica relativa dos vários compostos foi assim determinada, estimando-se os respectivos valores das constantes de estabilidade. Experimentos sobre a atividade oxidante destes complexos frente à albumina bovina, causando danos oxidativos à proteína, também foram efetuados, determinando-se a formação de grupos carbonil na proteína, que foram monitorados espectrofotometricamente, através da obtenção das correspondentes dinitrofenil-hidrazonas, pela reação com dinitrofenil-hidrazina (DNPH). Através da técnica de EPR, foram realizados estudos para a detecção e identificação de espécies radicalares na interação da albumina com os complexos de cobre(II) em presença de peróxido de hidrogênio, com o uso de um captador de spin apropriado. Estudos sobre as possíveis interações dos complexos de cobre(II) com a albumina humana (HSA) e com o plasma sanguíneo foram realizados através das técnicas de EPR e SDS-PAGE. Além disso, a reatividade dos complexos de cobre(II) frente a glutationa, um agente redutor presente em alta concentração no citosol, foi investigada através de experimentos de fluorescência. Finalmente, a influência dos complexos imínicos de cobre(II) sobre a respiração mitocondrial foi investigada, já que estes complexos se mostraram indutores eficientes de apoptose frente a diferentes células tumorais. Para este estudo utilizou-se um oxígrafo para monitorar o consumo de oxigênio durante a respiração mitocondrial, em presença dos complexos de cobre estudados. / In this work some copper(II) complexes with Schiff base ligands, already studied in our laboratory, have been prepared, as well as a new similar zinc complex. After being characterized, especially by spectroscopic techniques (UV/Vis, IR, and EPR), these complexes had their reactivity as catalysts for the oxidation of carbohydrates by molecular oxygen verified. The influence of different factors on the kinetics of reaction, such as variation of the catalyst concentration, substrate concentration, buffer concentration and pH of the solution, was investigated. In order to understand the possible interactions of the copper(II) complexes studied with the protein albumine, studies using CD and electronic spectroscopies were carried out by adding the copper complexes to bovine serum albumine (BSA), and determining the corresponding relative stability constants for each complex. The activity of such copper complexes as oxidant agents toward the protein was also verified, with the formation of carbonyl groups in the protein observed by monitoring spectrophotometrically the corresponding dinitrophenylhydrazones, after reaction with dinitrophenylhydrazine (DNPH). By using EPR spectroscopy and an appropriate spin scavenger, reactive oxygen species were detected and identified as a result of the oxidative damage to the protein occurring in the presence of the copper complexes and hydrogen peroxide. Interactions of the human serum protein (HSA) and human plasma with the copper complexes studied were verified by EPR and SDS-PAGE techniques. Additionally, the reactivity of these complexes toward the reductive agent glutathione, present in the citosol at high concentration, was investigated by fluorescence measurements. Finally, the influence of the complexes in the mitochondrial respiration was verified, since those compounds are able to induce efficiently apoptosis in the presence of different tumoral cells, monitoring the oxygen consumption with a selective oxygen electrode

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / No presente trabalho é descrita a obtenção de hidrazonas derivadas de isoniazida e de seus complexos de cobre(II) e gálio(III) candidatos a protótipos de fármacos antituberculose e antitumoral. Para investigar o efeito da modificação química sobre as bioatividades do fármaco isoniazida, foram preparados cinco derivados hidrazônicos: 2-piridinocarboxaldeído isonicotinoil hidrazona (HPCIH, 1), 2-acetilpiridina isonicotinoil hidrazona (HAPIH, 2), 2-benzoilpiridina isonicotinoil hidrazona (HBPIH, 3), 2-piridinoformamida isonicotinoil hidrazona (HPAmIH, 4) e 2-pirazinoformamida isonicotinoil hidrazona (HPzAmIH, 5), sendo o composto HPAmIH (4) inédito. Análises de ponto de fusão, espectroscopia de infravermelho (IV), espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear (RMN), análise elementar e termogravimetria confirmaram a obtenção e pureza das hidrazonas. Foi determinada ainda a estrutura de HPCIH (1) por difração de raios X de monocristal. Essas moléculas foram efetivas em inibir o crescimento de cepas de micobactérias Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) nas concentrações testadas, com exceção de HPzAmIH (5). As hidrazonas HAPIH (2) e HBPIH (3) foram os compostos orgânicos mais ativos (concentração inibitória mínima, CIM = 0,625 g/mL), apresentando atividade antimicobacteriana apenas duas vezes inferior à do fármaco isoniazida.Quanto à ação contra células tumorais, as hidrazonas HAPIH (2) e HBPIH (3) foram as mais potentes contra as linhagens OVCAR-8 (tumor de ovário - humano), HCT-116 (tumor de cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma humano), com inibições de 34,98 a 98,63% do crescimento celular, na concentração de 5 g/mL, enquanto que a isoniazida não foi efetiva contra as linhagens estudadas. Para avaliar o efeito da coordenação a metais sobre a atividade farmacológica das hidrazonas, foram sintetizados os complexos de cobre(II) e gálio(III), sendo todos inéditos: [Cu(HPCIH)Cl2]∙H2O (6), [Cu(HAPIH)Cl2]∙H2O (7), [Cu2(HBPIH)2Cl2]Cl2∙4H2O(8), [Cu(HPAmIH)Cl2]∙H2O (9), [Cu(HPzAmIH)Cl2]∙H2O (10), [Ga(HPCIH)2](NO3)32H2O (11), [Ga(HAPIH)(APIH)](NO3)22H2O (12), [Ga(HPAmIH)(PAmIH)](NO3)22H2O(13) e [Ga(HPzAmIH)(PzAmIH)](NO3)2H2O (14). Os complexos foram caracterizados por espectroscopia de IV, análise elementar, condutivimetria, RMN e espectroscopia eletrônica. Em geral, os complexos também demonstraram ação contra M. tuberculosis, sendo que apenas para 6, 9, 10 e 14 foi verificada melhor atividade em relação às hidrazonas livres. Os complexos metálicos foram tanto quanto ou mais ativos contra as células tumorais OVCAR-8, HCT-116 e SF-295 do que as hidrazonas livres. Merecem destaque os complexos 79 e 12, que apresentaram inibição de crescimento celular de 72,2100%, na concentração de 5 g/mL. Os resultados demonstram portanto que em geral os compostos 114 são menos ativos do que a isoniazida contra M. tuberculosis, enquanto que a modificação química do fármaco, formando-se hidrazonas com posterior complexação cobre(II) e gálio(III) constituíram uma estratégia interessante na obtenção de compostos mais potentes contra células tumorais / In this work we describe the synthesis of isoniazide-derived hydrazones and their copper(II) and gallium(III) complexes candidates for drug prototypes to treat antituberculosis and cancer. Five hidrazone derivatives have been prepared in order to investigate the effect of chemical modification on the bioactivities of the drug isoniazid: 2-pyridinecarboxaldehyde isonicotinoyl hydrazone (HPCIH, 1), 2-acetylpyridine isonicotinoyl hydrazone (HAPIH, 2), 2-benzoylpyridine isonicotinoyl hydrazone (HBPIH, 3), 2-pyridineformamide isonicotinoyl hydrazone (HPAmIH, 4) and pyrazineformamide 2-isonicotinoyl hydrazone (HPzAmIH, 5), being HPAmIH (4) unpublished. Melting point, infrared spectroscopy (IR), mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR), elemental analysis and thermogravimetric analysis has confirmed the formation of hydrazones as well as its purity. All compounds have been effective in inhibiting the growth of Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) mycobacteria strains in the tested concentrations, except HPzAmIH (5). The hydrazones HAPIH (2) and HBPIH (3) have been the most active compounds (minimum inhibitory concentration, MIC = 0.625 g/mL), which have presented the antimycobacterial activity only two times lower than isoniazid drug. In relation to the action against tumor cells, the hydrazones HAPIH (2) and HBPIH (3) have been the most potent compounds against the cell lines OVCAR-8 (ovarian tumor - human), HCT-116 (colon tumor - human) and SF-295 (glioblastoma - human), with inhibitions from 34.98 to 98.63% of cellular growth at a concentration of 5 g/mL. Isoniazid, in turn, hasnt been effective against all cell lines studied. To evaluate the effect of coordinating the metal on the pharmacological activity of hydrazones, complexes of copper (II) and gallium (III) have been synthesized, being all novel compounds: [Cu(HPCIH)Cl2]∙H2O (6), [Cu(HAPIH)Cl2]∙H2O (7), [Cu2(HBPIH)2Cl2]Cl2∙4H2O(8), [Cu(HPAmIH)Cl2]∙H2O (9), [Cu(HPzAmIH)Cl2]∙H2O (10), [Ga(HPCIH)2](NO3)32H2O (11), [Ga(HAPIH)(APIH)](NO3)22H2O (12), [Ga(HPAmIH)(PAmIH)](NO3)22H2O (13) and [Ga(HPzAmIH)(PzAmIH)](NO3)2H2O (14).The complexes have been characterized by IR spectroscopy, NMR, elemental analysis, conductivimetry and electron spectroscopy. In general, these complexes have also shown action against M. tuberculosis, whereas only 6, 9, 10 and 14 have demonstrated better activity than the free hydrazones. The metal complexes have been equally or more active against human the cancer cell lines OVCAR-8, HCT-116 and SF-295 than the free hydrazones. The complexes 79 and 12 deserve to be highlighted, which have shown 72.2100% inhibition of cell growth in the 5 g/mL concentration. The results therefore demonstrate that in general compounds 114 are less active than isoniazid against M. tuberculosis, while chemical modification of the drug, forming hydrazones and subsequent complexation with the copper (II) and gallium(III) metal ions have been an interesting strategy to obtain compounds more potent against tumor cells

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / No presente trabalho é descrita a obtenção de hidrazonas derivadas de isoniazida e de seus complexos de cobre(II) e gálio(III) candidatos a protótipos de fármacos antituberculose e antitumoral. Para investigar o efeito da modificação química sobre as bioatividades do fármaco isoniazida, foram preparados cinco derivados hidrazônicos: 2-piridinocarboxaldeído isonicotinoil hidrazona (HPCIH, 1), 2-acetilpiridina isonicotinoil hidrazona (HAPIH, 2), 2-benzoilpiridina isonicotinoil hidrazona (HBPIH, 3), 2-piridinoformamida isonicotinoil hidrazona (HPAmIH, 4) e 2-pirazinoformamida isonicotinoil hidrazona (HPzAmIH, 5), sendo o composto HPAmIH (4) inédito. Análises de ponto de fusão, espectroscopia de infravermelho (IV), espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear (RMN), análise elementar e termogravimetria confirmaram a obtenção e pureza das hidrazonas. Foi determinada ainda a estrutura de HPCIH (1) por difração de raios X de monocristal. Essas moléculas foram efetivas em inibir o crescimento de cepas de micobactérias Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) nas concentrações testadas, com exceção de HPzAmIH (5). As hidrazonas HAPIH (2) e HBPIH (3) foram os compostos orgânicos mais ativos (concentração inibitória mínima, CIM = 0,625 g/mL), apresentando atividade antimicobacteriana apenas duas vezes inferior à do fármaco isoniazida.Quanto à ação contra células tumorais, as hidrazonas HAPIH (2) e HBPIH (3) foram as mais potentes contra as linhagens OVCAR-8 (tumor de ovário - humano), HCT-116 (tumor de cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma humano), com inibições de 34,98 a 98,63% do crescimento celular, na concentração de 5 g/mL, enquanto que a isoniazida não foi efetiva contra as linhagens estudadas. Para avaliar o efeito da coordenação a metais sobre a atividade farmacológica das hidrazonas, foram sintetizados os complexos de cobre(II) e gálio(III), sendo todos inéditos: [Cu(HPCIH)Cl2]∙H2O (6), [Cu(HAPIH)Cl2]∙H2O (7), [Cu2(HBPIH)2Cl2]Cl2∙4H2O(8), [Cu(HPAmIH)Cl2]∙H2O (9), [Cu(HPzAmIH)Cl2]∙H2O (10), [Ga(HPCIH)2](NO3)32H2O (11), [Ga(HAPIH)(APIH)](NO3)22H2O (12), [Ga(HPAmIH)(PAmIH)](NO3)22H2O(13) e [Ga(HPzAmIH)(PzAmIH)](NO3)2H2O (14). Os complexos foram caracterizados por espectroscopia de IV, análise elementar, condutivimetria, RMN e espectroscopia eletrônica. Em geral, os complexos também demonstraram ação contra M. tuberculosis, sendo que apenas para 6, 9, 10 e 14 foi verificada melhor atividade em relação às hidrazonas livres. Os complexos metálicos foram tanto quanto ou mais ativos contra as células tumorais OVCAR-8, HCT-116 e SF-295 do que as hidrazonas livres. Merecem destaque os complexos 79 e 12, que apresentaram inibição de crescimento celular de 72,2100%, na concentração de 5 g/mL. Os resultados demonstram portanto que em geral os compostos 114 são menos ativos do que a isoniazida contra M. tuberculosis, enquanto que a modificação química do fármaco, formando-se hidrazonas com posterior complexação cobre(II) e gálio(III) constituíram uma estratégia interessante na obtenção de compostos mais potentes contra células tumorais / In this work we describe the synthesis of isoniazide-derived hydrazones and their copper(II) and gallium(III) complexes candidates for drug prototypes to treat antituberculosis and cancer. Five hidrazone derivatives have been prepared in order to investigate the effect of chemical modification on the bioactivities of the drug isoniazid: 2-pyridinecarboxaldehyde isonicotinoyl hydrazone (HPCIH, 1), 2-acetylpyridine isonicotinoyl hydrazone (HAPIH, 2), 2-benzoylpyridine isonicotinoyl hydrazone (HBPIH, 3), 2-pyridineformamide isonicotinoyl hydrazone (HPAmIH, 4) and pyrazineformamide 2-isonicotinoyl hydrazone (HPzAmIH, 5), being HPAmIH (4) unpublished. Melting point, infrared spectroscopy (IR), mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR), elemental analysis and thermogravimetric analysis has confirmed the formation of hydrazones as well as its purity. All compounds have been effective in inhibiting the growth of Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) mycobacteria strains in the tested concentrations, except HPzAmIH (5). The hydrazones HAPIH (2) and HBPIH (3) have been the most active compounds (minimum inhibitory concentration, MIC = 0.625 g/mL), which have presented the antimycobacterial activity only two times lower than isoniazid drug. In relation to the action against tumor cells, the hydrazones HAPIH (2) and HBPIH (3) have been the most potent compounds against the cell lines OVCAR-8 (ovarian tumor - human), HCT-116 (colon tumor - human) and SF-295 (glioblastoma - human), with inhibitions from 34.98 to 98.63% of cellular growth at a concentration of 5 g/mL. Isoniazid, in turn, hasnt been effective against all cell lines studied. To evaluate the effect of coordinating the metal on the pharmacological activity of hydrazones, complexes of copper (II) and gallium (III) have been synthesized, being all novel compounds: [Cu(HPCIH)Cl2]∙H2O (6), [Cu(HAPIH)Cl2]∙H2O (7), [Cu2(HBPIH)2Cl2]Cl2∙4H2O(8), [Cu(HPAmIH)Cl2]∙H2O (9), [Cu(HPzAmIH)Cl2]∙H2O (10), [Ga(HPCIH)2](NO3)32H2O (11), [Ga(HAPIH)(APIH)](NO3)22H2O (12), [Ga(HPAmIH)(PAmIH)](NO3)22H2O (13) and [Ga(HPzAmIH)(PzAmIH)](NO3)2H2O (14).The complexes have been characterized by IR spectroscopy, NMR, elemental analysis, conductivimetry and electron spectroscopy. In general, these complexes have also shown action against M. tuberculosis, whereas only 6, 9, 10 and 14 have demonstrated better activity than the free hydrazones. The metal complexes have been equally or more active against human the cancer cell lines OVCAR-8, HCT-116 and SF-295 than the free hydrazones. The complexes 79 and 12 deserve to be highlighted, which have shown 72.2100% inhibition of cell growth in the 5 g/mL concentration. The results therefore demonstrate that in general compounds 114 are less active than isoniazid against M. tuberculosis, while chemical modification of the drug, forming hydrazones and subsequent complexation with the copper (II) and gallium(III) metal ions have been an interesting strategy to obtain compounds more potent against tumor cells

[pt] Um grande número de complexos de cobre(II) tendo como ligantes compostos biológicos têm sido utilizados como modelos para o entendimento das diversas reações que ocorrem in vivo. Diversas desordens neurodegenerativas são caracterizadas pela presença anormal de proteínas no sistema nervoso central que possuem uma alta afinidade pelo íon cobre(II). Essa coordenação do metal à proteínas favorece o processo de deposição e associado ocorre a produção em excesso de espécies reativas de oxigênio (ROS - reactive oxygen species). A metionina é um antioxidante presente no meio biológico que pode se ligar ao cobre e prevenir os danos oxidativos. No presente trabalho, estudamos em solução aquosa, os complexos binários Cu(II):L1 e Cu(II):L2 e o complexo ternário Cu(II):L1:L2 (L1 = GlyGly e L2 = Met) a 25 °C e μ = 0,1 mol L-1. As constantes de formação dos complexos foram calculadas utilizando o programa BEST7. Os modos de coordenação dos ligantes nos complexos de Cu(II) foram investigados por cálculos DFT utilizando o programa TURBOMOLE 6.1. Foi utilizado o funcional PBE empregando a aproximação da resolução da identidade (RI-J) e com o conjunto de bases def2-SVP. Os efeitos do solvente foram incluídos através do modelo de solvatação COSMO. Os resultados DFT mostraram comportamento bidentado da glicilglicina na espécie Cu(H-1GlyGly), sem a participação do oxigênio do grupo carboxílico na esfera de coordenação do metal. O modelo de cluster-contínuo foi utilizado para obter, para os complexos mais estáveis, as energias livres em fase gasosa e em solução aquosa através dos métodos DFT: B3LYP/def2/TZVP e PBE0/def2-TZVP. Para os complexos mais estáveis foi incluída a segunda camada de solvatação (36 moléculas de água) para verificar a interferência de moléculas explícitas do solvente nos cálculos. Os resultados mostraram comportamento monodentado do ligante glicilglicina no complexo [Cu(GlyGly)(H2O)36]+, sem a participação do oxigênio peptídico na esfera de coordenação do centro metálico. Observou-se que os clusters assumem diferentes geometrias: octaédrica ([Cu(Met)(H2O)36]+), pirâmide de base quadrada ([Cu(GlyGly)(H2O)36]+, [Cu(H-1GlyGly)(H2O)36], [Cu(Met)(OH)(H2O)36], [Cu(Met)(OH)2(H2O)36]-, [Cu(HGlyGly)(Met)(H2O)36], [Cu(GlyGly)(Met)(H2O)36]- e [Cu(GlyGly)(Met)(OH)(H2O)35]2-) e quadrado distorcido ([Cu(GlyGly)(OH)(H2O)35]-). Todos os clusters apresentaram uma configuração eletrônica do estado fundamental t6 2g d22 d1 x2-y2 o que concorda com a distorção Jahn-Teller. Nas doenças neurodegenerativas o pH fisiológico é levemente acidificado. Na espécie ternária [Cu(GlyGly)(Met)(H2O)36]-, que é formada em pH 7, o enxofre não faz parte da esfera de coordenação do cobre, indicando que ele pode exercer uma ação antioxidante em sistemas biológicos sob condições de estresse oxidativo. / [en] A great number of copper(II) complexes that have as ligands biological compounds have been used as models for the understanding of several reactions that occur in vivo. Several neurodegenerative disorders are characterized by the abnormal presence of proteins in the central nervous system that have a high affinity for the copper(II) ion. This coordination of metal to proteins favor the deposition process and associated the production in excess of reactive oxygen species (ROS) occurs. The methionine is an antioxidant present in the biological medium that could bind to copper and prevent the oxidative damages. In the present work we studied in aqueous solution the binary complexes Cu(II):L1 and Cu(II):L2 and the ternary complex Cu(II):L1:L2 (L1 = GlyGly and L2 = Met) at 25C and μ = 0.1 mol L-1. The binding constants of the complexes were determined using the BEST7 program. The coordination modes of the ligands in the Cu(II) complexes were investigated by DFT calculation using the TURBOMOLE 6.1 program. The PBE functional was used employing the resolution of identity approximation (RI-J) and with the def2-SVP basis set. The solvent effects were included through the COSMO solvation model. The DFT results showed bidentate behavior of the glycylglycine in the Cu(H-1GlyGly) species without the participation of the oxygen from the carboxylic group in the metal coordination sphere. The cluster-continuum model was used to obtain for the more stable complexes the free energies in gas phase and in the aqueous solution through DFT methods: B3LYP/def2/TZVP and PBE0/def2-TZVP. The second solvation shell (36 water molecules) was included in the more stable complexes to verify the interference of solvent explicit molecules in the calculation. The results showed monodentate behavior of the glycylglycine ligand in the complex [Cu(GlyGly)(H2O)36]+, without the participation of the peptidic oxygen in coordination sphere of metallic centre. It was observed that the clusters assume different geometries: octahedral ([Cu(Met)(H2O)36]+), square pyramid ([Cu(GlyGly)(H2O)36]+, [Cu(H-1GlyGly)(H2O)36], [Cu(Met)(OH)(H2O)36], [Cu(Met)(OH)2(H2O)36]-, [Cu(HGlyGly)(Met)(H2O)36], [Cu(GlyGly)(Met)(H2O)36]- and [Cu(GlyGly)(Met)(OH)(H2O)35]2-) and distorted square ([Cu(GlyGly)(OH)(H2O)35]-). All the clusters presented an electronic configuration of ground state t6 2g d22 d1 x2-y2 that agree with the Jahn-Teller distortion. In the neurodegenerative diseases the physiologic pH is slightly acidified. In the ternary species [Cu(GlyGly)(Met)(H2O)36]-, that is formed in pH 7, the sulfur is not part of the coordination sphere of copper, indicating that it could exert an antioxidant action in biological systems under oxidative stress conditions.

Neste trabalho, alguns novos complexos imínicos de cobre(II) com ligantes inspirados em biomoléculas como oxindóis, contendo grupos indólicos, imidazólicos ou pirrólicos com diferentes características estruturais, foram sintetizados e caracterizados por análise elementar, espectrometria ESI-MS e espectroscopias IV, UVNis e EPR. As possíveis interações desses complexos de cobre com a albumina humana (HSA) e com o plasma sanguíneo foram estudadas através das técnicas EPR, CD e SDS-PAGE, indicando que estas ocorrem principalmente no sítio N-terminal da proteína. Suas reatividades frente a compostos biológicos relevantes, tais como glutationa, ascorbato e peróxido de hidrogênio, também foram verificadas. Alguns dos complexos estudados podem ser ativados por glutationa, ascorbato ou peróxido de hidrogênio, sendo capazes de gerar espécies reativas de oxigênio em concentrações significativas, na presença desses redutores ou oxidantes biológicos. Adicionalmente, as propriedades pró-oxidantes de tais complexos foram investigadas, visando elucidar estudos prévios de suas atividades pró-apoptótica e antitumoral. Alguns destes complexos foram mais eficientes em causar danos oxidativos à 2-deoxi-D-ribose, enquanto outros foram mais eficientes em causar oxidantes na proteína HSA, com formação de grupos carbonílicos, principalmente em presença de H202. Experimentos de CD complementaram estes resultados, indicando que somente alguns complexos causaram modificações na α-hélice da proteína. Experimentos de EPR com captador de spin, na presença de HSA e H202, mostraram a formação de quantidades apreciáveis de radicais hidroxil e radicais de carbono, em presença de peróxido de hidrogênio. Além disso, os complexos apresentaram notável habilidade de ligação ao DNA e conseqüente atividade nuclease, promovendo clivagens nas duas fitas. Experimentos de fluorescência, EPR, gel de eletroforese marcado com α-32P-UTP e CD foram ainda realizados, visando elucidar o mecanismo de ação destes complexos no meio biológico. Estes experimentos indicaram que eles podem se associar ao DNA, através de suas bases ou pela interação com a deoxi-ribose, já que promoveram danos oxidativos nestes substratos. Entretanto, não catalisam a hidrólise dos grupos fosfato, atuando, portanto, predominantemente por um mecanismo oxidativo. Através de CD, poucas perturbações na elipsicidade do DNA foram observadas, o que indica que estes complexos provavelmente estão localizadas nas cavidades ou alças do ácido nucléico. / Some novel imine-copper(II) complexes with ligands inspired in biomolecules such as oxindoles, containing indole, pirrole or imidazole moieties with different structural features were synthesized, and characterized by elemental analysis, IV, UV/Vis and EPR spectroscopies, and ESI-MS spectrommetry. Interactions of these complexes with human serum albumin (HSA) and human plasma were verified by EPR, CD and SDS-PAGE techniques, showing that they occur mainly at the N-terminal site of the protein. Their reactivity towards biological relevant compounds, such as glutathione, ascorbate and hydrogen peroxide were also verified; some of them are capable of generating ROS in significant concentrations, in the presence of these reducing or oxidant agents. Additionally, the activity of such copper(II) complexes in promoting oxidative damage to different substrates was investigated, in order to elucidate previous studies on their pro-apoptotic and antitumoral activity. Some of these complexes were much more efficient to cause oxidative damage to 2-deoxy-D-ribose, especially in the presence of hydrogen peroxide. On the contrary, others were more active in causing damage to HSA protein, with the formation of carbonyl groups. Experiments by CD corroborated these results, since only some of the complexes caused modifications in the protein -helix. EPR spin trapping experiments, in the presence of HSA and H2O2, showed significant generation of hydroxyl as well as carbon centered radicals. Moreover, all the complexes showed remarkable ability to bind to DNA, promoting double-strand cleavage, upon H2O2 activation. In order to investigate their mechanism of action, fluorescence, EPR, gel-electrophoresis with labeled α-32P-UTP and CD experiments were carried out. The results indicated that these complexes can bind to DNA through its bases or can interact with the deoxi-ribose rings, promoting oxidative damage to those substrates. On the contrary, they do not catalyze the hydrolysis of phosphate groups. By CD spectroscopy, little perturbations on the helicity conformation of the DNA were observed, indicating that these complexes are probably located in the grooves.

Neste trabalho, alguns novos complexos imínicos de cobre(II) com ligantes inspirados em biomoléculas como oxindóis, contendo grupos indólicos, imidazólicos ou pirrólicos com diferentes características estruturais, foram sintetizados e caracterizados por análise elementar, espectrometria ESI-MS e espectroscopias IV, UVNis e EPR. As possíveis interações desses complexos de cobre com a albumina humana (HSA) e com o plasma sanguíneo foram estudadas através das técnicas EPR, CD e SDS-PAGE, indicando que estas ocorrem principalmente no sítio N-terminal da proteína. Suas reatividades frente a compostos biológicos relevantes, tais como glutationa, ascorbato e peróxido de hidrogênio, também foram verificadas. Alguns dos complexos estudados podem ser ativados por glutationa, ascorbato ou peróxido de hidrogênio, sendo capazes de gerar espécies reativas de oxigênio em concentrações significativas, na presença desses redutores ou oxidantes biológicos. Adicionalmente, as propriedades pró-oxidantes de tais complexos foram investigadas, visando elucidar estudos prévios de suas atividades pró-apoptótica e antitumoral. Alguns destes complexos foram mais eficientes em causar danos oxidativos à 2-deoxi-D-ribose, enquanto outros foram mais eficientes em causar oxidantes na proteína HSA, com formação de grupos carbonílicos, principalmente em presença de H202. Experimentos de CD complementaram estes resultados, indicando que somente alguns complexos causaram modificações na α-hélice da proteína. Experimentos de EPR com captador de spin, na presença de HSA e H202, mostraram a formação de quantidades apreciáveis de radicais hidroxil e radicais de carbono, em presença de peróxido de hidrogênio. Além disso, os complexos apresentaram notável habilidade de ligação ao DNA e conseqüente atividade nuclease, promovendo clivagens nas duas fitas. Experimentos de fluorescência, EPR, gel de eletroforese marcado com α-32P-UTP e CD foram ainda realizados, visando elucidar o mecanismo de ação destes complexos no meio biológico. Estes experimentos indicaram que eles podem se associar ao DNA, através de suas bases ou pela interação com a deoxi-ribose, já que promoveram danos oxidativos nestes substratos. Entretanto, não catalisam a hidrólise dos grupos fosfato, atuando, portanto, predominantemente por um mecanismo oxidativo. Através de CD, poucas perturbações na elipsicidade do DNA foram observadas, o que indica que estes complexos provavelmente estão localizadas nas cavidades ou alças do ácido nucléico. / Some novel imine-copper(II) complexes with ligands inspired in biomolecules such as oxindoles, containing indole, pirrole or imidazole moieties with different structural features were synthesized, and characterized by elemental analysis, IV, UV/Vis and EPR spectroscopies, and ESI-MS spectrommetry. Interactions of these complexes with human serum albumin (HSA) and human plasma were verified by EPR, CD and SDS-PAGE techniques, showing that they occur mainly at the N-terminal site of the protein. Their reactivity towards biological relevant compounds, such as glutathione, ascorbate and hydrogen peroxide were also verified; some of them are capable of generating ROS in significant concentrations, in the presence of these reducing or oxidant agents. Additionally, the activity of such copper(II) complexes in promoting oxidative damage to different substrates was investigated, in order to elucidate previous studies on their pro-apoptotic and antitumoral activity. Some of these complexes were much more efficient to cause oxidative damage to 2-deoxy-D-ribose, especially in the presence of hydrogen peroxide. On the contrary, others were more active in causing damage to HSA protein, with the formation of carbonyl groups. Experiments by CD corroborated these results, since only some of the complexes caused modifications in the protein -helix. EPR spin trapping experiments, in the presence of HSA and H2O2, showed significant generation of hydroxyl as well as carbon centered radicals. Moreover, all the complexes showed remarkable ability to bind to DNA, promoting double-strand cleavage, upon H2O2 activation. In order to investigate their mechanism of action, fluorescence, EPR, gel-electrophoresis with labeled α-32P-UTP and CD experiments were carried out. The results indicated that these complexes can bind to DNA through its bases or can interact with the deoxi-ribose rings, promoting oxidative damage to those substrates. On the contrary, they do not catalyze the hydrolysis of phosphate groups. By CD spectroscopy, little perturbations on the helicity conformation of the DNA were observed, indicating that these complexes are probably located in the grooves.