Evidências anteriores deste laboratório mostraram que o núcleo mediano da rafe (NMR) está envolvido no controle do condicionamento contextual do medo. Lesão eletrolítica dessa estrutura causa sinais de desinibição comportamental com aumento da atividade locomotora medida no teste de campo aberto. Nesse trabalho, estendemos nossos estudos analisando as respostas comportamentais e autonômicas em um paradigma de condicionamento de medo contextual e clássico (pareamento luz ou som/choque nas patas) em ratos tanto com lesão neuroquímica com N-Methyl-D-Aspartato (NMDA), quanto com microinjeção de 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralina (8-OH-DPAT) no NMR. Os animais receberam microinjeções de NMDA, 8-OH-DPAT ou salina no NMR e foram submetidos ao condicionamento em uma caixa experimental, onde eles receberam dez choques nas patas (0,7 mA, 1 s, intervalo variável entre 10 e 50 s) pareados com contexto, luz ou som (CS). No dia seguinte, os animais foram testados em presença do CS, e o tempo de congelamento, o número de levantamentos, micção e defecação foram registrados. Os animais expostos ao CS apresentaram mais congelamento que ratos controles. Essa resposta de congelamento foi inibida em ratos com lesão com NMDA ou com microinjeção de 8-OH-DPAT no NMR testados no condicionamento contextual ou com pareamento luz/choque, mas não foi alterada em animais submetidos ao condicionamento acústico. No teste de campo aberto, microinjeções de NMDA e 8-OH-DPAT no NMR causaram uma maior atividade locomotora do que o grupo controle, sem alterar o número de levantamentos. Esses resultados mostram que mecanismos serotonérgicos do NMR estão envolvidos no condicionamento de medo (contexto ou luz como estímulo condicionado). Distintos substratos neurais parecem estar envolvidos no condicionamento do medo a estímulos acústicos. / We have shown that the median raphe nucleus (MRN) is involved in the control of contextual fear conditioning. Besides, electrolytic lesion of MRN causes signs of behavioral disinhibition with an increase in the locomotor activity measured in an open field. In this work we extend this study by analyzing the behavioral and autonomic responses in a contextual and classical (light or tone/foot-shock pairings) fear conditioning paradigms in rats with either neurochemical lesion with N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) or microinjected with 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralin (8-OH-DPAT) into the MRN. The animals received NMDA, 8-OH-DPAT or saline microinjections into the MRN and were submitted to conditioning trials in an experimental chamber where they received ten foot-shocks (0.7 mA, 1 sec, variable interval between 10 and 50 sec) paired with the context, light or tone. The next day, animals were tested either in the same or in a different experimental chamber in the presence of light or tone, where the duration of freezing, number of rearings, bouts of micturition and number of fecal boli were recorded. Context, light or tone alone caused a significant amount of freezing. This freezing behavior was clearly inhibited in rats with NMDA lesions or with 8-OH-DPAT microinjections in the MRN tested in contextual conditioning or light/foot-shock association, but not in the conditioning fear test with tones. In the open-field test, the NMDA and 8-OH-DPAT microinjections into the MRN caused higher horizontal locomotor activity than control rats without changing the number of rearings. These results clearly show that 5-HT mechanisms of the MRN are involved in the fear conditioning (contextual or light as conditioned stimuli). Distinct neural substrates seem to subserve conditioning fear with acoustic stimuli.

Evidências anteriores deste laboratório mostraram que o núcleo mediano da rafe (NMR) está envolvido no controle do condicionamento contextual do medo. Lesão eletrolítica dessa estrutura causa sinais de desinibição comportamental com aumento da atividade locomotora medida no teste de campo aberto. Nesse trabalho, estendemos nossos estudos analisando as respostas comportamentais e autonômicas em um paradigma de condicionamento de medo contextual e clássico (pareamento luz ou som/choque nas patas) em ratos tanto com lesão neuroquímica com N-Methyl-D-Aspartato (NMDA), quanto com microinjeção de 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralina (8-OH-DPAT) no NMR. Os animais receberam microinjeções de NMDA, 8-OH-DPAT ou salina no NMR e foram submetidos ao condicionamento em uma caixa experimental, onde eles receberam dez choques nas patas (0,7 mA, 1 s, intervalo variável entre 10 e 50 s) pareados com contexto, luz ou som (CS). No dia seguinte, os animais foram testados em presença do CS, e o tempo de congelamento, o número de levantamentos, micção e defecação foram registrados. Os animais expostos ao CS apresentaram mais congelamento que ratos controles. Essa resposta de congelamento foi inibida em ratos com lesão com NMDA ou com microinjeção de 8-OH-DPAT no NMR testados no condicionamento contextual ou com pareamento luz/choque, mas não foi alterada em animais submetidos ao condicionamento acústico. No teste de campo aberto, microinjeções de NMDA e 8-OH-DPAT no NMR causaram uma maior atividade locomotora do que o grupo controle, sem alterar o número de levantamentos. Esses resultados mostram que mecanismos serotonérgicos do NMR estão envolvidos no condicionamento de medo (contexto ou luz como estímulo condicionado). Distintos substratos neurais parecem estar envolvidos no condicionamento do medo a estímulos acústicos. / We have shown that the median raphe nucleus (MRN) is involved in the control of contextual fear conditioning. Besides, electrolytic lesion of MRN causes signs of behavioral disinhibition with an increase in the locomotor activity measured in an open field. In this work we extend this study by analyzing the behavioral and autonomic responses in a contextual and classical (light or tone/foot-shock pairings) fear conditioning paradigms in rats with either neurochemical lesion with N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) or microinjected with 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralin (8-OH-DPAT) into the MRN. The animals received NMDA, 8-OH-DPAT or saline microinjections into the MRN and were submitted to conditioning trials in an experimental chamber where they received ten foot-shocks (0.7 mA, 1 sec, variable interval between 10 and 50 sec) paired with the context, light or tone. The next day, animals were tested either in the same or in a different experimental chamber in the presence of light or tone, where the duration of freezing, number of rearings, bouts of micturition and number of fecal boli were recorded. Context, light or tone alone caused a significant amount of freezing. This freezing behavior was clearly inhibited in rats with NMDA lesions or with 8-OH-DPAT microinjections in the MRN tested in contextual conditioning or light/foot-shock association, but not in the conditioning fear test with tones. In the open-field test, the NMDA and 8-OH-DPAT microinjections into the MRN caused higher horizontal locomotor activity than control rats without changing the number of rearings. These results clearly show that 5-HT mechanisms of the MRN are involved in the fear conditioning (contextual or light as conditioned stimuli). Distinct neural substrates seem to subserve conditioning fear with acoustic stimuli.

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Through this work we used a new experimental protocol in order to develop a new behavioural paradigm in the study of social anxiety. Mice were exposed to an apparatus adapted from rat exposure test (RET) and it consisted of three interconnected regions: home chamber, tunnel and surface area. Animals were exposed to the experimental apparatus for five consecutive days, being the first three days for habituation to the apparatus (habituation 1 , 2 and 3) and on the fourth day occurred the social interaction between conspecifics (not aggressive for animals from "non-defeated group" and aggressive for animals from "defeated group"). On the fifth and final experimental day the animals were re-exposed to the apparatus for 10 minutes and the following behaviors were assessed: frequency of entries and time spent in the three regions of the apparatus (home chamber/tunnel/surface area), frequency of the stretched attend posture (SAP) behaviour in the three regions, time spent on self-grooming in the three regions, frequency of rearing in the surface area and latency to reach the surface area once the animals were re-exposed to the experimental apparatus. Factor analysis was used in this study to trace the behavioural profile of socially defeated mice (n=90) when re-exposed to the apparatus where the aggressive interaction occurred; we also compared the behavioural profile of non-defeated (n=89) and defeated (n=90) mice when re-exposed to the context where social (non-aggressive or aggressive) interaction occurred, using Student’s t test. Final factor analysis yielded 4 factors that together represent 72.09% of total variance: factor 1 was loaded with time spent in the home chamber and in the surface area and self-grooming in the home chamber, while factor 2 loaded on time spent in the tunnel and total entries in the three compartments of the apparatus (home chamber, tunnel and surface area). Factor 3 was loaded with SAP frequency in the tunnel and in the surface area; and factor 4 was loaded only with latency to reach the surface area. Student’s t test showed that socially defeated mice spent more time to reach the surface area and performing self-grooming in the home chamber when compared to non-defeated mice. Together, these results suggest that the increase in the latency to reach the surface area and self-grooming in the home chamber were conditioned to a single social defeat, but there were no conditioning for classical measures such as: place aversion and risk assessment behaviour (SAP). / As interações agressivas entre animais co-específicos têm sido amplamente utilizadas como uma fonte etológica de estresse social para se estudar alguns aspectos da ansiedade social. Por meio deste trabalho, nós utilizamos um novo protocolo experimental com objetivo de desenvolver um novo paradigma comportamental para o estudo da ansiedade social. Camundongos foram expostos a um aparato adaptado a partir do teste de exposição ao rato (TER) e este era composto por três regiões interconectadas: toca, túnel e a superfície. Os animais foram expostos ao aparato experimental por cinco dias consecutivos, sendo os três primeiros dias para habituação ao aparato (habituação 1, 2 e 3) e no quarto dia ocorria a interação social entre coespecíficos (não agressiva para os animais do “grupo não derrotado” e agressiva para os animais do “grupo derrotado”). No quinto e último dia experimental os animais eram reexpostos ao aparato durante 10 minutos e os seguintes comportamentos eram avaliados: tempo de permanência e frequência de entrada nas três regiões do aparato (toca/túnel/superfície), frequência do comportamento stretched attend posture (SAP) nas três regiões do aparato, tempo realizando o comportamento de auto-limpeza nas três regiões do aparato, frequência de levantamento na superfície e latência em segundos para o animal adentrar a superfície após ser reexposto ao aparato. A análise fatorial foi empregada neste estudo com objetivo de traçar o perfil comportamental de camundongos socialmente derrotados (N=90) quando reexpostos ao aparato experimental onde a interação agressiva ocorreu; nós também comparamos o perfil comportamental de camundongos não derrotados (GND, N=89) e socialmente derrotados (GD, N=90) quando reexpostos ao contexto onde a interação social (não agressiva ou agressiva) ocorreu por meio do Teste t de Student. A análise fatorial final apresentou quatro fatores que juntos representam 72,09% da variância total: o fator 1 foi carregado com o tempo gasto na toca e na superfície do aparato, além do tempo realizando auto-limpeza na toca; enquanto o fator 2 foi carregado com tempo gasto no túnel e o total de entradas nos três compartimentos do aparato (toca, túnel e superfície). O fator 3 foi carregado com a frequência de SAP no túnel e na superfície; e o fator 4 foi carregado apenas com a latência para atingir a superfície. O teste t de Student indicou que camundongos socialmente derrotados levaram mais tempo para atingir a superfície do aparato e passaram mais tempo realizando auto-limpeza na toca quando comparados aos camundongos não derrotados. Juntos, esses resultados sugerem que o aumento na latência para atingir a superfície e no tempo realizando auto-limpeza na toca foram condicionados ao contexto por meio de uma única derrota social, entretanto não houve condicionamento para medidas clássicas tais como aversão espacial e medidas de avaliação de risco (como o SAP).

A substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPd) é considerada uma das principais estruturas do teto mesencefálico envolvida no substrato neural da aversão a estímulos proximais. GABA e 5-HT são apontados como neurotransmissores envolvidos na modulação das respostas defensivas elaboradas na SCPd. Recentemente, mecanismos neurocininérgicos também têm sido propostos como mediadores das reações de defesa organizadas nessa estrutura. O objetivo do presente estudo foi avaliar o envolvimento dos receptores NK-1 e NK-3 da SCPd no comportamento defensivo induzido pela estimulação elétrica dessa região em ratos com e sem experiência prévia ao condicionamento contextual aversivo. Para isso, os limiares aversivos de congelamento e fuga foram medidos durante a estimulação elétrica da SCPd em ratos ingênuos e em animais submetidos previamente ao procedimento de condicionamento contextual aversivo. A mediação destas repostas defensivas pelos receptores NK-1 e NK-3 foi avaliada pela injeção local de spantide (100 pmol/0,2 L) e SB 222200 (50 e 100 pmol/0,2 L), antagonistas seletivos de receptores NK-1 e NK-3, respectivamente. Os resultados mostraram que a injeção intra-SCPd de spantide aumentou os limiares aversivos determinados pela estimulação elétrica da SCPd em animais ingênuos e com experiência aversiva prévia. Injeções similares de 100 pmol de SB 222200 na SCPd também causaram um aumento nos limiares de congelamento e fuga. Entretanto, esses efeitos devem ser atribuídos a um déficit motor causado por essa dose da droga, uma vez que SB 222200 na dose de 100 pmol, reduziu significativamente a atividade motora dos animais submetidos ao teste do campo aberto. Estes resultados sugerem que receptores NK-1, mas não NK-3, estão envolvidos na mediação do comportamento defensivo induzido pela estimulação elétrica da SCPd. / The dorsal periaqueductal gray (dPAG) constitutes the main structure of the neural substrate for the defensive response to proximal aversive stimuli. It is well established that GABA and 5-HT are important neuromediators of the defense reaction at the dPAG level but neurokinin-mediated mechanisms have also been recently implicated in these processes. The aim of the present investigation was to examine the involvement of NK-1 and NK-3 receptors of the dPAG in the unconditioned defensive behaviors induced by electrical stimulation of the dPAG of rats with and without previous experience with contextual fear conditioning. For this, aversive thresholds were measured as the lowest intensity of electric current to produce freezing and escape behaviors using a procedure of gradual increases of the electrical stimulation of the dPAG. These thresholds were also measured in rats previously submitted to a contextual fear conditioning procedure. The mediation of these defensive responses by NK-1 and NK-3 receptors of the dPAG was evaluated by local injections of spantide (100 pmol/0.2 L) and SB 222200 (50 and 100 pmol/0.2 L), selective antagonists of NK-1 and NK-3 receptors, respectively. The present results showed that spantide injections into the dPAG increased the aversive thresholds (anti-aversive effects) determined by stimulation of the dPAG in naive and in animals subjected previously to the contextual fear conditioning. Similar injections of SB 222200 100 pmol into the dPAG increased the freezing and escape thresholds. However, this effect can be attributable to a motor deficit since this dose of SB 222200 decreased the exploratory activity of the animals subjected to the open field test. These results suggest that NK-1 receptors, but not NK-3 receptors, are involved in the mediation of the defensive behaviors induced by electrical stimulation of the dPAG.

A substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPd) é considerada uma das principais estruturas do teto mesencefálico envolvida no substrato neural da aversão a estímulos proximais. GABA e 5-HT são apontados como neurotransmissores envolvidos na modulação das respostas defensivas elaboradas na SCPd. Recentemente, mecanismos neurocininérgicos também têm sido propostos como mediadores das reações de defesa organizadas nessa estrutura. O objetivo do presente estudo foi avaliar o envolvimento dos receptores NK-1 e NK-3 da SCPd no comportamento defensivo induzido pela estimulação elétrica dessa região em ratos com e sem experiência prévia ao condicionamento contextual aversivo. Para isso, os limiares aversivos de congelamento e fuga foram medidos durante a estimulação elétrica da SCPd em ratos ingênuos e em animais submetidos previamente ao procedimento de condicionamento contextual aversivo. A mediação destas repostas defensivas pelos receptores NK-1 e NK-3 foi avaliada pela injeção local de spantide (100 pmol/0,2 L) e SB 222200 (50 e 100 pmol/0,2 L), antagonistas seletivos de receptores NK-1 e NK-3, respectivamente. Os resultados mostraram que a injeção intra-SCPd de spantide aumentou os limiares aversivos determinados pela estimulação elétrica da SCPd em animais ingênuos e com experiência aversiva prévia. Injeções similares de 100 pmol de SB 222200 na SCPd também causaram um aumento nos limiares de congelamento e fuga. Entretanto, esses efeitos devem ser atribuídos a um déficit motor causado por essa dose da droga, uma vez que SB 222200 na dose de 100 pmol, reduziu significativamente a atividade motora dos animais submetidos ao teste do campo aberto. Estes resultados sugerem que receptores NK-1, mas não NK-3, estão envolvidos na mediação do comportamento defensivo induzido pela estimulação elétrica da SCPd. / The dorsal periaqueductal gray (dPAG) constitutes the main structure of the neural substrate for the defensive response to proximal aversive stimuli. It is well established that GABA and 5-HT are important neuromediators of the defense reaction at the dPAG level but neurokinin-mediated mechanisms have also been recently implicated in these processes. The aim of the present investigation was to examine the involvement of NK-1 and NK-3 receptors of the dPAG in the unconditioned defensive behaviors induced by electrical stimulation of the dPAG of rats with and without previous experience with contextual fear conditioning. For this, aversive thresholds were measured as the lowest intensity of electric current to produce freezing and escape behaviors using a procedure of gradual increases of the electrical stimulation of the dPAG. These thresholds were also measured in rats previously submitted to a contextual fear conditioning procedure. The mediation of these defensive responses by NK-1 and NK-3 receptors of the dPAG was evaluated by local injections of spantide (100 pmol/0.2 L) and SB 222200 (50 and 100 pmol/0.2 L), selective antagonists of NK-1 and NK-3 receptors, respectively. The present results showed that spantide injections into the dPAG increased the aversive thresholds (anti-aversive effects) determined by stimulation of the dPAG in naive and in animals subjected previously to the contextual fear conditioning. Similar injections of SB 222200 100 pmol into the dPAG increased the freezing and escape thresholds. However, this effect can be attributable to a motor deficit since this dose of SB 222200 decreased the exploratory activity of the animals subjected to the open field test. These results suggest that NK-1 receptors, but not NK-3 receptors, are involved in the mediation of the defensive behaviors induced by electrical stimulation of the dPAG.

[pt] Os ratos Carioca com alto condicionamento (CAC) e Carioca com baixo condicionamento (CBC) são duas linhagens que são criadas seletivamente para altos e baixos níveis de congelamento, em resposta a sugestões contextuais previamente associadas ao estímulos elétricos nos membros. Essas duas linhas têm traços significativamente diferentes de respostas semelhantes à ansiedade, em diferentes protocolos comportamentais. O presente estudo utilizou ratos machos e fêmeas de CAC e CBC para investigar possíveis associações entre comportamento relacionado à ansiedade e ingestão de álcool. Quinina e sacarina foram utilizadas como soluções de controle do paladar. Os resultados indicaram que os ratos CAC tinham um fenótipo ansioso mais alto e os animais CBC tinham um fenótipo ansioso mais baixo, quando as duas linhagens foram comparadas com uma linhagem, selecionada aleatoriamente, que foi usada como grupo controle (CTR). Os ratos machos exibiram consistentemente maior congelamento condicionado do que as fêmeas. Os ratos CAC consumiram mais concentrações de álcool de 6 porcento e 10 porcento do que os ratos CBC em um teste de livre escolha de consumo e maior consumo na concentração de álcool 10 porcentp em um teste de escolha forçada. Ratos fêmeas CAC exibiram a maior quantidade de ingestão de álcool durante essas três condições, em comparação com ratos machos CAC e também consumiram mais quinina que ratos machos. Finalmente, ratos CAC exibiram menor consumo de sacarina em comparação com CBC e animais controle. No total, esses resultados revelaram diferenças entre os sexos no comportamento semelhante ao da ansiedade e no consumo de álcool, corroborando a hipótese de que existe uma relação positiva entre ansiedade e ingestão de álcool. / [en] Carioca High-conditioned Freezing (CHF) and Carioca Low-conditioned Freezing (CLF) rats are two linesthat are selectively bred for high and low levels of freezing in response to contextual cues that are previously associated with footshock. These two lines have significantly different traces of anxiety-like responses in different behavioral protocols. The present study used male and female CHF and CLF rats to investigate possible associations between anxietyrelated behavior and alcohol intake. Quinine and saccharin were used as taste control solutions.The results indicated that CHF rats had a higher anxious phenotype and CLF animals had a lower anxious phenotype when both breeding lines were compared with a randomly selected line that was used as a control group. Male rats consistently exhibitedmore conditioned freezing than females. CHF rats consumed more 6 percent and 10 percent alcohol concentrations than CLF rats in a free-choice test and more of a 10 percent alcohol concentration in a forcedchoice test. Female CHF rats exhibited the highest amount of alcohol intake during these three conditions compared with male CHF rats. Female rats also consumed more quinine than male rats. Finally, CHF rats exhibited lower saccharin consumption compared with CLF and control animals. Altogether, these results revealed sex differences in anxiety-like behavior and alcohol consumption,supporting the hypothesis that there is a positive relationship between anxiety and alcohol intake. The Carioca breeding lines were developed for high and low defensive behavior in response to diffusecontextual cues that are associated with footshock but not to well-defined danger-related stimuli, corroborating the view that anxiety but not fear is associated with alcohol consumption.