The coxsackie-adenovirus receptor (CAR) is a viral receptor for Group B coxsackieviruses (CVB). Physiologically, CAR is a cellular adhesion protein. I report that upregulation of cardiac CAR in the young adult mouse (CAR+/MtTA+ ) caused a cardiomyopathy that was characterized by inflammation and hypertrophy. In the hearts of CAR+/MtTA+ mice c-Jun N terminal kinase (JNK) was specifically activated. JNK activation is known to promote hypertrophy of cardiomyocytes, and disrupt proteins at the intercalated disc. CVB3-infected CAR+/MtTA+ mice did not exhibit increased cardiac viral load or myocarditis severity, but did demonstrate a greater cardiac interferon-γ (IFN-γ) response when compared to littermate controls. CAR-induced expression of this antiviral cytokine may have prevented the increase in myocarditis susceptibility. Further investigation into the activation of protein kinase signaling, and antiviral signaling will provide better understanding of how CAR participates in the pathogenesis of both viral and non-viral heart diseases.

The coxsackie-adenovirus receptor (CAR) is a viral receptor for Group B coxsackieviruses (CVB). Physiologically, CAR is a cellular adhesion protein. I report that upregulation of cardiac CAR in the young adult mouse (CAR+/MtTA+ ) caused a cardiomyopathy that was characterized by inflammation and hypertrophy. In the hearts of CAR+/MtTA+ mice c-Jun N terminal kinase (JNK) was specifically activated. JNK activation is known to promote hypertrophy of cardiomyocytes, and disrupt proteins at the intercalated disc. CVB3-infected CAR+/MtTA+ mice did not exhibit increased cardiac viral load or myocarditis severity, but did demonstrate a greater cardiac interferon-γ (IFN-γ) response when compared to littermate controls. CAR-induced expression of this antiviral cytokine may have prevented the increase in myocarditis susceptibility. Further investigation into the activation of protein kinase signaling, and antiviral signaling will provide better understanding of how CAR participates in the pathogenesis of both viral and non-viral heart diseases.

Les coxsackievirus du groupe B (CVB) sont des petits virus à ARN appartenant à au genre Enterovirus et à la famille des Picornaviridae. Chez, l’homme, les CVB sont responsables de nombreuses infections aiguës bénignes ou sévères. Ils sont également incriminés dans le développement de maladies chroniques telles que le diabète de type 1 (DT1). En effet, plusieurs données épidémio-cliniques sont en faveur d’un lien entre les entérovirus et notamment les CVB et le DT1. Deux mécanismes majeurs ont été proposés pour expliquer cette pathogenèse entérovirale du DT1. Il s’agit de l’activation « en passant » d’un environnement inflammatoire et la persistance virale qui concourent à l’initiation du processus auto-immun. Les études présentées dans cette thèse visent à comprendre les caractéristiques et conséquences de l’infection à CVB qui pourraient expliquer l’implication de ces mécanismes. Les résultats obtenus suggèrent que CVB4 (utilisé comme modèle des CVB) est un virus inflammatoire. In vitro, il induit la production de grandes quantités d’IFNα par les cellules mononuclées du sang (CMN). Néanmoins cette induction d’IFNα n’est possible qu’en cas de facilitation de l’infection par des anticorps non neutralisants, qui se traduit par une entrée importante du virus dans les cellules. Dans nos travaux, l’IFNα a été détecté dans le plasma de sujets diabétiques, et fréquemment associé à la présence d’ARN entéroviral. De même, parmi les CMN, les monocytes ont été identifiés comme les principales cellules cibles du virus. En dehors de l’IFNα, nous avons montré que CVB4 peut induire la synthèse de plusieurs autres cytokines pro-inflammatoires notamment l’IL-6 et le TNFα. De façon intéressante, l’infection des cellules n’est pas indispensable car cette induction est possible par des particules non infectieuses. Cette production de cytokines pro-inflammatoires par les CMN peut également être amplifiée par la facilitation de l’infection en présence de particules infectieuses de CVB4. Nous avons montré que les macrophages, cellules effectrices importantes de l’immunité innée au niveau tissulaire, peuvent produire en présence de CVB4 de l’IFNα et d’autres cytokines pro-inflammatoires. Les macrophages dérivés de CMN en présence de M-CSF (mais pas de GM-CSF) sont infectables par CVB4 et le virus peut persister dans ces cellules. CVB4 peut également établir une infection chronique productive de type « état porteur » dans des cellules canalaires pancréatiques. Les cellules chroniquement infectées peuvent être guéries grâce à un traitement par de la fluoxétine. Cette molécule utilisée dans le traitement de troubles psychiatriques, présente in vitro une activité antivirale vis-à-vis de certains entérovirus, et permet d’éliminer complètement en quelques semaines le virus des cellules chroniquement infectées par CVB4. Des modifications cellulaires ont été observées au niveau des cellules chroniquement infectées notamment une diminution de l’expression de PDX-1, une résistance à la lyse au cours d’une réinfection par CVB4, ainsi qu’une diminution très importante de l’expression du récepteur CAR. Ces modifications cellulaires acquises au cours de l’infection chronique pouvaient persister après l’élimination du virus. Les cellules chroniquement infectées présentent également un profil de microARNs très différent de celui des cellules non infectées. Une évolution du virus a été également observée avec des changements phénotypiques et génotypiques. L’ensemble de nos observations montre que les caractéristiques de l’infection à CVB4 sont compatibles avec les mécanismes évoqués dans la pathogenèse entérovirale du DT1 et renforcent l’hypothèse de l’implication des CVB dans cette maladie. / Group B coxsackieviruses (CVB) are small RNA viruses belonging to Enterovirus genus and to the Picornaviridae family. In humans, CVB can cause numerous mild and severe acute infections. They are also thought to be involved in the development of chronic diseases such as type 1 diabetes (T1D). Several epidemiological and clinical data support a link between enteroviruses, especially CVB and T1D. Two main mechanisms have been described to explain this enteroviral pathogenesis of T1D including a “bystander activation” of an inflammatory environment and viral persistence. These mechanisms contribute to initiation of the autoimmune process. Our studies aimed to understand the features and outcomes of CVB infection that could explain their involvement in these mechanisms. The results suggest that CVB4 (used as CVB model) is an inflammatory virus. CVB4 induces in vitro the production by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of high amounts of IFNα. However this induction is only possible when CVB4 infection is enhanced by non-neutralizing antibodies, resulting in increased viral entry in cells. We also reported detection of IFNα in plasma of T1D patients, commonly associated with enteroviral RNA. In addition, monocytes have been identified as major targets of enteroviruses among PBMCs. Besides IFNα, CVB4 can induce the synthesis of other proinflammatory cytokines, mainly IL-6 and TNFα. Interestingly, infection is not needed, since inactivated viral particles can induce these proinflammatory cytokines. In addition, the enhancing of CVB4 infection in PBMCs results in increased production of these cytokines. We have shown that macrophages that are known as major innate immunity effectors can produce IFNα and other proinflammatory cytokines upon infection with CVB4. Macrophages derived from PBMCs in presence of M-CSF (but not GM-CSF) can be infected by CVB4, and the virus can persist in these cells. CVB4 can also establish a productive, carrier-sate persistent infection in pancreatic ductal-like cells. The virus can be completely cleared from chronically-infected cells using fluoxetine. This molecule already used in the treatment of depression and other mental disorders, has displayed antiviral activity against many enteroviruses, and can completely clear CVB4 from chronically-infected cells within few weeks. Cellular changes have been observed during chronic infection including a reduced expression of PDX-1, a resistant profile to lysis upon superinfection with CVB4, and an important decrease of CAR expression. These changes can linger even after the clearance of CVB4. In addition the miRNA profile in chronically-infected ductal-like cells was clearly different from that of mock-infected cells. Some phenotypic and genotypic changes were also observed in the virus derived from chronic infection. Altogether, these findings show the features of CVB4 infection are compatible with mechanisms reported in the enteroviral pathogenesis of T1D, and support the hypothesis of involvement of CVB in this disease.

Le genre Enterovirus comporte de nombreux virus à ARN non enveloppés regroupés en espèces EV-A-J et Rhinovirus A-C. Les coxsackievirus B (CV-B) appartiennent à l’espèce EV-B. Le rôle des CV-B et notamment de CV-B4 dans la pathogenèse du diabète de type 1 (DT1) est fortement suspecté. Coxsackievirus-B4 E2 (CV-B4 E2) isolé à partir du pancréas d’un patient souffrant de DT1 est capable d’induire une hyperglycémie chez des souris. Les mécanismes de la pathogenèse entérovirale du diabète ne sont pas encore bien connus. Il a été montré que les monocytes humains sont infectés par CV-B4 in vitro grâce à des anticorps anti-VP4 formant des complexes avec le virus, et que les macrophages humains également sont infectés par CV-B4 in vitro. Les études réalisées in vitro sont riches d’informations mais des modèles d’infection in vivo sont nécessaires pour explorer d’avantage les mécanismes des infections à entérovirus. Malgré l’impact des entérovirus en pathologie les moyens de lutte contre ces virus sont limités.Nos principaux objectifs étaient i) d’étudier l’infection à CV-B4 E2 chez la souris et de déterminer si les monocytes/macrophages sont des cibles du virus in vivo ii) de mettre en œuvre un modèle de diabète induit par CV-B4 E2 chez la souris iii) d’étudier l’activité anti-CV-B4 de diverses molécules in vitro iiii) de mettre en évidence la survenue d’infections entérovirales naturelles chez des animaux.L'ARN viral est présent in vivo dans les monocytes (CD14+) et macrophages (F4/80+) de la rate et dans les cellules de la moelle osseuse de souris ICR-CD1 inoculées avec CV-B4 E2. In vitro, CV-B4 E2 infecte les cellules CD14+ et les cellules F4/80+ de la rate. Les macrophages dérivés de la moelle osseuse cultivés en présence de M-CSF sont infectés par CV-B4 in vitro. Le sérum de souris infectée par CV-B4 E2 facilite l’infection in vitro des cellules spléniques par CV-B4 E2, mais pas celle des macrophages dérivés de la moelle osseuse. Chez des souris ICR-CD1 préalablement traitées par des doses sub-diabétogènes de streptozotocine β (STZ), l’inoculation de CV-B4 E2 provoque une hyperglycémie associée à une hypo-insulinémie. La charge virale du pancréas évaluée par RT-PCR quantitative n’est pas différente chez les animaux diabétiques (STZ/CV-B4 E2) par rapport aux animaux inoculés avec le virus mais non diabétiques. L'analyse histologique du pancréas d’animaux diabétiques (STZ/CV-B4 E2) met en évidence des foyers d’inflammation au niveau des ilots de Langerhans. Des dérivés de pirodavir, molécules qui se fixent à la capside des entérovirus inhibent l’infection à echovirus 7 et 11 mais pas à CV-B4 E2 in vitro. Par contre la fluoxétine a fait preuve d’un effet anti-CV-B4 E2 dans un modèle de culture de fragments de pancréas et de cellules béta pancréatiques murins. La détection d’anticorps sériques anti-VP4 par ELISA, à l’aide d’un peptide de 50 acides-aminés de la protéine VP4 d’EV-G1 (un entérovirus porcin), a été appliquée à la mise en évidence de l’infection de jeunes porcs par des entérovirus. Une homologie de 88% de la séquence du peptide VP4 d’EV-G1 avec celle des protéines VP4 d’ autres EV-G suggère que des anticorps dirigés contre ces virus distincts d’EV-G1 puissent être détectés.En conclusion, CV-B4 E2 peut infecter les monocytes et les macrophages in vitro et in vivo dans un système murin, et le virus peut provoquer un diabète chez des souris préalablement exposées à de faibles doses de STZ. La fluoxétine inhibe l’infection à CV-B4 E2 de cellules pancréatiques in vitro. La détection d’anticorps anti-VP4 d’EV-G1 a permis de mettre en évidence des infections naturelles à entérovirus chez des jeunes porcs. Ce modèle porcin pourrait être mis à profit pour étudier la physiopathologie des infections à entérovirus et tester des moyens de lutte contre ces virus. / Enterovirus genus encompasses a number of non-enveloped RNA viruses grouped into 12 species, EV-A-J and Rhinovirus A-C. Group B coxsackieviruses (CV-B) belong to the EV-B species. CV-B and particularly CV-B4 is thought to be involved in the development of chronic diseases like type 1 diabetes (T1D). A strain of CV-B4 (CV-B4 E2) was isolated from the pancreas of a patient with T1D, and was able to induce a hyperglycemia in mouse. The mechanisms of the enteroviral pathogenesis of T1D are not well known yet. It has been observed that the infection of human monocytes with CV-B4 E2 in vitro can be enhanced by anti-VP4 antibodies bound to the virus, and human macrophages are also infected by CV-B4 in vitro. The in vitro studies are rich with information but in vivo infection models are needed to better understand the mechanisms of enterovirus infections. Despite the effect of enterovirus on health, the means in the fight against these viruses are limited.Our main objectives were i) to investigate CV-B4 E2-infection in mice and to determine whether monocytes / macrophages are targets of the virus in vivo ii) to implement a CV-B4 E2-induced diabetes model in mice iii) to study the anti-CV-B4 activity of various molecules in vitro iiii) To highlight the natural occurrence of enterovirus infections in animals.Viral RNA was found in vivo in monocytes (CD14+) and macrophages (F4/80+) of the spleen and in bone marrow cells of ICR-CD1 mice inoculated with CV-B4 E2. In vitro, CV-B4 E2 infected the CD14+ and the F4/80+ cells of the spleen. Bone marrow-derived macrophages (BMDM) were infected by CV-B4 in vitro. The serum of CV-B4 E2- infected mice enhanced in vitro the infection of spleen cells by CV-B4 E2 but not the infection of BMDM. ICR-CD1 mice, treated with a sub-diabetogenic dose of Streptozotocin β (STZ), and afterwards inoculated with CV-B4 E2 developped hyperglycaemia and hypoinsulinemia. The viral load of pancreas assessed by quantitative RT-PCR was not different in diabetic animals (STZ/CV-B4 E2) compared to non-diabetic animals inoculated with CV-B4 E2. Histological analysis of diabetic animals highlighted an inflammation of pancreas isletsPirodavir-derived molecules, which bind to the enteroviruses capsid, inhibited the infection with echovirus 7 and 11 but not the infection with CV-B4 E2 in vitro. On the other hand, it was displayed that an anti-CV-B4 E2 effect of fluoxetine in cultures of mouse pancreas fragments and mouse beta cells. The detection of anti-VP4 antibodies in serum by ELISA using a 50 amino acids peptide of VP4 from EV-G1 (a porcine enterovirus) was applied to piglets to highlight enterovirus infections. A strong sequence homology (88%) between the VP4 of EV-G1 and of other EV-G suggests that antibodies directed against viruses other than EV-G1 can be detected.In conclusion, CV-B4 E2 can infect monocytes and macrophages in vitro and in vivo in a murine system, and the virus can cause diabetes in mice previously exposed to low doses of STZ. Fluoxetine inhibits the infection of pancreatic cells with CV-B4 E2 in vitro. The detection of anti-EV-G1-VP4 antibodies highlighted natural enterovirus infections in young pigs. This porcine model could be used to study the pathophysiology of enterovirus infections and to evaluate approaches aimed to fight these viruses.

Les cellules NKT invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T non conventionnels restreints par la molécule CD1d qui présente des glycolipides. Les cellules iNKT expriment un TCR avec une chaîne a invariante, Va14-Ja18 chez la souris et Va28-Ja18 chez l’homme. Elles ont la particularité de produire de grande quantité de cytokines (IFN-? et IL-4) rapidement après leur activation et peuvent à leur tour stimuler d’autres cellules du système immunitaire comme les cellules dendritiques, les cellules NK et les lymphocytes T. Elles représentent ainsi un pont entre les réponses immunitaires innées et adaptatives. Le diabète de type 1 est une maladie autoimmune caractérisée par la destruction des cellules ß pancréatiques productrices d’insuline. Bien que l’apparition de diabète de type 1 soit associée à des polymorphismes génétiques, les facteurs environnementaux ont également été impliqués dans l’étiologie de cette maladie. De nombreuses études suggèrent que les infections virales, en particulier les infections par le virus de coxsackie B4 (CVB4), pourraient être impliquées dans le développement de cette maladie. Notre étude a été réalisée avec des souris NOD qui développent un diabète de type 1 vers 15 semaines d’âge et des souris NOD déficientes pour la proinsulin 2 (Pro-ins2-/-) développant un diabète vers 8 semaines d’âge. Nos résultats montrent qu’après infection par CVB4, la moitié des souris NOD et Pro-ins2-/- développent un diabète accéléré par rapport à des souris non infectées. Toutefois, une injection de l’agoniste des cellules iNKT, la molécule aGalactosylceramide (aGalCer), au moment de l’infection des souris, diminue fortement l’incidence de diabète. L’infection par CVB4 induit un fort recrutement de macrophages dans le pancréas et l’activation des cellules iNKT modifie la fonction de ces macrophages. En effet, les macrophages pancréatiques des souris infectées par CVB4 expriment fortement les cytokines IL-1ß, IL-6 et TNF-a, révélant leur caractère pro-inflammatoire alors que les macrophages des souris infectées et traitées par aGalCer expriment faiblement ces cytokines inflammatoires et fortement des enzymes immunosuppressives iNOS (inducible NO synthase), IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) et arginase I. L’utilisation d’inhibiteurs de ces enzymes montre que la protection contre le diabète est induite par IDO. Nous avons également observé une forte infiltration de lymphocytes T autoréactifs dans les îlots pancréatiques des souris infectées. De façon intéressante, l’incidence accrue de diabète du groupe CVB4 est associée à une fréquence élevée de cellules T autoréactives produisant de l’IFN-? dans le pancréas, alors que la production d’IFN-? par les cellules T autoréactives est très faible dans les souris du groupe CVB4+aGalCer. Cette inhibition de la production d’IFN-? est dépendante de l’enzyme IDO, car l’utilisation d’un inhibiteur d’IDO augmente fortement la production d’IFN-? par les lymphocytes T anti-îlots et l’incidence de diabète. Dans l’ensemble nos résultats montrent, que l’activation des cellules iNKT lors de l’infection par CVB4 induit des macrophages immunosuppresseurs dans le pancréas, ces cellules inhibant la fonction des lymphocytes T autoréactifs et ainsi le développement du diabète. / INKT cells are non-conventional T lymphocytes that are restricted to glycolipid presenting CD1d molecule. iNKT cells express an invariant TCR a chain (Va14-Ja18 in mice and Va28-Ja18 in humans). Their particularity is to rapidly produce copious amounts of cytokines (IFN-? and IL-4) after activation and to activate other cells of the immune system such as dendritic cells, NK cells and T lymphocytes. iNKT cells, therefore, form a bridge between innate and adaptive immune responses. Type 1 diabetes is an autoimmune disease characterized by the destruction of pancreatic ß cells whose role is to produce insulin. While diabetes development can clearly be associated with genetic polymorphisms, environmental factors were also implicated in the etiology of the disease. Numerous studies suggest that viral infections, particularly infections with Coxsackievirus B4 (CVB4), could be implicated in the development of type 1 diabetes. Our study was performed with NOD mice that develop type 1 diabetes around 15 weeks of age and with proinsulin 2 knockout NOD mice (Pro-ins2-/-) which become diabetic around 8 weeks of age. Our results show that CVB4 infection induces accelerated diabetes in around half of NOD and Pro-ins2-/- mice compared to uninfected mice. However, the activation of iNKT cells with their agonist, aGalactosylceramide (aGalCer), at the time of infection greatly decreases diabetes incidence. CVB4 infection induces a strong recruitment of macrophages into the pancreas. Interestingly, iNKT cell activation modifies the function of these macrophages. Indeed, pancreatic macrophages of CVB4 infected mice strongly express IL-1, IL-6 and TNF-a, indicating their pro-inflammatory character. On the contrary, macrophages of mice infected with CVB4 and treated with aGalCer express low levels of these cytokines, but strong levels of suppressive enzymes iNOS (inducible NO synthase), IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase) and arginase I. The use of inhibitors of these enzymes showed that diabetes prevention is induced by IDO. We have also observed that autoreactive T cells strongly infiltrate the pancreatic islets after CVB4 infection. It is interesting to note that the high diabetes incidence of CVB4 infected mice is associated with an increased frequency of IFN-? producing autoreactive T cells in pancreatic islets. On the contrary, the frequency of these cells is very low in infected mice treated with aGalCer. The inhibition of IFN-? production is dependent on IDO enzyme, since the use of its inhibitor strongly increases IFN-? production by anti-islet T cells and diabetes incidence. To summarize, our results show that iNKT cell activation during the infection with CVB4 induces immunosuppressive macrophages in the pancreas. These cells inhibit the function of autoreactive T cells and prevent diabetes development.

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Title from PDF of title page. / Document formatted into pages; contains 86 pages. / Thesis (M.S.P.H.)--University of South Florida, 2003. / Includes bibliographical references. / Text (Electronic thesis) in PDF format. / ABSTRACT: The Enterovirus genus within the family Picornaviridae contains over 100 serotypes, of which sixty-four are known to be human pathogens. Infection with this group of RNA viruses produces a myriad of clinical conditions including poliomyelitis, meningitis, encephalitis, respiratory illnesses, and hand-foot-and-mouth disease. Outbreaks have been documented worldwide; significant morbidity and mortality exist to warrant laboratory surveillance. Traditionally, enteroviruses have been identified to the level of serotype by the serum neutralization assay. However, numerous problems are associated with this assay. The serum neutralization assay is labor intensive, results are often ambiguous, and reagents are becoming difficult to obtain. Recently, molecular-based typing protocols have been described that are cost effective and produce results that are more reliable. / ABSTRACT: The overall objective of this thesis was to implement a molecular-based typing protocol to replace the serum neutralization method currently used. Three specific aims were identified to reach this objective. First, a database cataloging all enteroviruses isolated at the Florida Department of Health - Tampa Branch Laboratory from 1981 through 2002 was created. Serotype prevalence, specimen submission rates, and temporal trends were analyzed to demonstrate the public health importance of enterovirus surveillance. Next, five oligonucleotide primer sets were compared with respect to sensitivity, specificity, and overall utility in molecular typing protocols developed to accurately determine enterovirus type. Finally, the most effective molecular assay was used to conduct two basic molecular epidemiological analyses of intratypic variation of Coxsackievirus B5 isolates, and of intratypic variation of successive Echovirus 9 passages. / ABSTRACT: The results from this study show that implementation of a molecular-based typing system for enteroviruses would be an improvement over current enterovirus serotyping methods. Results are obtained more rapidly and are more reliable. The implementation of such a system would improve the surveillance capabilities of the State of Florida Department of Health. / System requirements: World Wide Web browser and PDF reader. / Mode of access: World Wide Web.

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