Prolina (Pro) é metabolizada por suas próprias enzimas especializadas com seus próprios mecanismos de regulação e localizações teciduais e subcelulares. Foram descritos erros inatos no metabolismo da Pro em seres humanos. A Hiperprolinemia tipo II é uma doença hereditária causada por uma deficiência de Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, cuja característica bioquímica é a acumulação de Pro no plasma e tecidos causando diversos problemas, incluindo dano cerebral em alguns pacientes. Vários investigadores demonstram a Pro como uma fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) e uma relação entre uma concentração elevada de Pro e sintomas neurológicos tem sido demonstrada em pacientes com HPII. Uma vez que as mitocôndrias constituem uma fonte importante de EROs, investigou-se a geração de EROs mediada por Pro em mitocôndrias de fígado de rato. Os resultados sugeriram que uma função normal do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (CTE) parece ser essencial para a toxicidade da Pro, enquanto que a atividade dos complexos I e IV, e presença Ca+2, aparentemente, não são necessárias. Como existe uma escassez de informações sobre as funções da Pro no crescimento e desenvolvimento do feto e recém-nascido, bem como uma falta de novas estratégias terapêuticas, também investigamos a ação do piruvato e de creatina sobre os efeitos desencadeados pela administração crônica de Pro em ratas durante a gravidez e lactação sobre o cérebro da prole. administração de Pro nas mães induziu estresse oxidativo e diminuiu as atividades da piruvato quinase e creatina quinase no cérebro da prole. No entanto, a co-administração de creatina e piruvato preveniram apenas parcialmente as alterações causadas pela administração de Pro. / Proline (Pro) is metabolized by its own specialized enzymes with their own tissue and subcellular localizations and mechanisms of regulation. Inborn errors of Pro metabolism have been described. Type II Hyperprolinemia is an inherited disorder caused by a deficiency of Δ1-pyrroline- 5-carboxilic acid dehydrogenase, whose biochemical hallmark is Pro accumulation in plasma and tissues causing several problems including cerebral damage in some affected patients. Several investigators have shown that Pro is a source of reactive oxygen species (ROS) and a relationship between a high concentration of Pro and neurological symptoms has been demonstrated in patients with HPII. Since mitochondria constitute a major source of ROS, we investigated the generation of Pro-mediated ROS by Pro in rat liver mitochondria. We found that a normal function of complex III of the electron transport chain (ETC) seems to be essential for Pro toxicity, whereas activity of complexes I and IV and Ca+2 presence apparently are not required. Because there is a paucity of information about roles for Pro in growth and development of the fetus and neonate, as well as a lack on new therapeutic strategies, we also investigated the action of pyruvate and creatine on the effects elicited by chronic Pro administration to female rats during pregnancy and lactation on the offspring brain. We found that Pro administration to the mothers induced oxidative stress and diminished the pyruvate kinase and creatine kinase activities in the brain of the offspring. However, co-administration of creatine plus pyruvate did not fully prevented the alterations caused by Pro administration.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-18Bitstream added on 2014-06-13T19:42:29Z : No. of bitstreams: 1 akinaga_j_dr_botib_parcial.pdf: 68136 bytes, checksum: 63ef0cbc915c8aa41f833dd0c4a86b5b (MD5) Bitstreams deleted on 2014-12-19T18:32:50Z: akinaga_j_dr_botib_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-12-19T18:33:36Z : No. of bitstreams: 1 000714063.pdf: 501451 bytes, checksum: 105a66a9ea99849e798ced498018eeef (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As catecolaminas endógenas adrenalina e noradrenalina controlam importantes funções fisiológicas através da ativação de 1A-ARs, que são receptores com 7 domínios transmembrana os quais ativam proteínas G. Muitos agonistas de 1-ARs são utilizados na terapêutica, principalmente por conta de seu efeito vasoconstritor, porém, a taquifilaxia observada com a oximetazolina, um agonista de 1-ARs da classe das imidazolinas, é um efeito adverso importante e pode ser observado principalmente com a utilização de descongestionantes nasais por períodos de tempo prolongado. No presente estudo, investigamos a participação de PKC e GRK2 nos processos de fosforilação, dessensibilização e internalização de 1A-ARs induzidos pelos agonistas noradrenalina e oximetazolina. Segundo os resultados obtidos, a oximetazolina, mas não a fenilefrina, induziu taquifilaxia nas contrações de artéria caudal de rato. Além disso, 1A-ARs ativados pela oximetazolina são fosforilados principalmente pela GRK2, seguida de rápida dessensibilização e internalização. Já 1A-ARs ativados pela noradrenalina são fosforilados principalmente pela PKC, sem dessensibilização nem rápida internalização. Esses resultados em conjunto demonstram que a oximetazolina e a noradrenalina regulam os 1A-ARs através de diferentes mecanismos, envolvendo diferentes quinases / The endogenous cathecolamines epinephrine and norepinephrine control important physiological functions through activation of 1A-ARs, which are 7-transmembrane receptors that activate G proteins. Several 1-ARs agonists are therapeutically useful in reason of its vasoconstrictor effects; however, tachyphylaxis in the vasoconstrictor effects of nasal decongestant containing oxymetazoline, an imidazoline 1-ARs agonist, is an important adverse effect observed after prolonged treatment. On the present study, we investigated the roles of PKC and GRK2 on the 1A-AR phosphorylation, desensitization and internalization process after receptor activation by norepinephrine and oxymetazoline. The results show that oxymetazoline, but not phenylephrine, induce tachyphylaxis in contractions of rat tail artery. Moreover, 1A-ARs activated by oxymetazoline are phosphorylated predominantly by GRK2, followed by rapid desensitization and internalization whereas 1A-ARs activated by norepinephrine are phosphorylated predominantly by PKC and not followed by desensitization or rapid internalization. These results show that norepinephrine and oxymetazoline regulate 1A-ARs through different mechanisms, involving different protein kinases

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / The animal model of mania induced by dextroamphetamine (d-AMPH) has been considered a good model for the study of bipolar disorder (BD). However, some studies have shown differences between amphetamines to induce both behavioral and biochemical changes. Besides, several studies have suggested that dysfunctional energy metabolism have a central role in BD. In the present study was investigated the potency of the d-AMPH and methamphetamine (m-AMPH) on the behavior and energetic dysfunction in the brain of rats. Were investigated also the effects of the lithium (Li) and valproate (VPT) on behavioral and energy metabolism changes in brain of rats undergoing treatment with the m-AMPH. Finally, was to compare serum creatine kinase (CK) levels between bipolar disorder patients, in the various phases (depressive, manic, and euthymic). The work was divided into three parts. Part 1: Wistar rats were given single intraperitoneal (i.p) injections of saline, d-AMPH (2 mg/kg) or m-AMPH (0.25, 0.5, 1 or 2 mg/kg). Locomotor behavior was assessed using the open-field task and activities of Krebs cycle enzymes (citrate synthase and succinate dehydrogenase), mitochondrial respiratory chain complexes (I, II, III and IV) and CK were measured in brain of rats. Part 2: Wistar rats were first given m-AMPH or saline for 14 days, and then, between days 8 and 14, rats were treated with Li, VPA or saline i.p. The animals were submitted to the same behavioral and biochemical tests described in Part 1. Part 3: Was compared serum CK levels between BD patients, in the various phases (depressive, manic, and euthymic), and healthy volunteers. In the first part of the study was demonstrated that d-AMPH and m-AMPH (all doses administered) increased locomotor activity of animals. The numbers of visits to the centre were increased by d-AMPH and m-AMPH at 2 mg/kg. The m-AMPH administration at 2mg/kg increased the amount of stereotypic behavior. The amphetamines significantly decreased the activities of Krebs cycle enzymes, mitochondrial respiratory chain complexes and CK; nevertheless, this effect varied depending on the brain region evaluated. In the second part of this study we found that Li and VPA reversed m-AMPH-induced hyperactivity. Besides, Li and VPA reversed m-AMPH-induced energetic metabolism dysfunction; however, the effects of Li and VPA were dependent on the brain region analyzed. Finally, in the third part of this study was demonstrated that CK levels were higher in the manic patients than in the controls. Together these data show that: 1) at high doses, m-AMPH increased stereotyped (sniffing) behavior in rats, but d-AMPH did not. However, this study shows that d-AMPH and m-AMPH seem to have similar effects on the brains energetic metabolism; and the d-AMPH, m-AMPH is able to induced hyperactivity and energetic metabolism dysfunction, both seen in BD. In addition, Li and VPA reversed m-AMPH’s effects on locomotor activity and energetic metabolism. The clinical differences among the depressive, manic, and euthymic phases of BD are paralleled by contrasting levels of CK. However, further studies are needed in order to understand the state-dependent differences observed in serum CK activity. / O modelo animal de mania induzido por dextroanfetamina (d-AMPH) é descrito na literatura como um bom modelo animal de transtorno bipolar (TB). Entretanto, tem sido relatado diferenças entre os tipos de anfetaminas em induzir alterações comportamentais e neuroquímicas. Além disso, vários estudos sugerem que o TB está associado à disfunções no metabolismo energético. No presente estudo foi avaliado a diferença entre d-AMPH e metanfetamina (m-AMPH) sobre o comportamento e disfunção no metabolismo energético no cérebro de ratos. Foi avaliado também os efeitos de lítio (Li) e valproato (VPA) sobre as alterações comportamentais e sobre metabolismo energético induzidos por m-AMPH. Finalmente, comparamos os níveis de creatina quinase (CK) no soro de pacientes bipolares nas fases depressiva, maníaca e eutímica. Para tanto, o trabalho foi dividido em três partes. Parte 1: Ratos Wistar receberam uma injeção intraperitoneal (i.p) de salina, d-AMPH (2mg/kg) ou m-AMPH (0,25, 0,5, 1 ou 2mg/kg) e foram submetidos ao teste do campo aberto para avaliação comportamental 2 h após. Foi avaliada também a atividade das enzimas do ciclo de Krebs (citrato sintase, succinato desidrogenase e malato desidrogenase), dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (I, II, II-III, IV) e da CK no cérebro dos ratos. Parte 2: Foi administrado m-AMPH ou salina i.p em ratos Wistar durante 14 dias e entre o 8º e o 14º dia os animais eram tratados com Li, VPA ou salina via i.p. Os animais foram submetidos aos mesmos testes comportamentais e bioquímicos descritos na Parte1. Parte 3: Foram avaliados os níveis de CK no soro de pacientes bipolares - eutímicos, depressivos e em mania – que foram comparados com voluntários saudáveis. Na primeira parte do trabalho foi demonstrado que d-AMPH e m-AMPH aumentaram a atividade locomotora nos ratos. As visitas ao centro do campo aberto aumentaram com a administração de ambas as drogas na dose de 2mg/kg. A administração de m-AMPH na dose de 2mg/kg aumentou o comportamento estereotipado dos animais (sniffing). A administração tanto de d-AMPH quanto de m-AMPH diminuiu a atividade das enzimas do ciclo de Krebs, dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e da CK; entretanto, estes efeitos variam de acordo com a região cerebral avaliada. Na segunda parte do trabalho foi demonstrado que Li e VPA revertem a hiperatividade e alterações no metabolismo energético induzida por m-AMPH. Por fim, na terceira parte do trabalho foi demonstrado que durante a mania, os níveis de CK estão aumentados no soro dos pacientes bipolares quando comparado com voluntários saudáveis. Estes dados demonstram que a m-AMPH, mas não d-AMPH, induz comportamento estereotípico em ratos; porém, as duas drogas parecem ter efeitos similares sobre o metabolismo energético; e que, assim como a d-AMPH, a m-AMPH é capaz de induzir hiperatividade e disfunção no metabolismo energético que são revertidos por Li e VPA. As fases maníaca, depressiva e eutímica do TB, além de apresentarem sintomatologia distinta, também podem ser diferenciadas pelo nível de CK presente no soro dos pacientes. Entretanto, mais estudos são necessários para entender as diferenças observadas na atividade da CK durante as fases do TB.

A fenilcetonúria (PKU) é um dos erros inatos do metabolismo mais frequentes. Ela é causada pela deficiência na atividade da fenilalanina hidroxilase, levando à acumulação de fenilalanina e dos seus metabolitos no sangue e tecidos. A PKU ou hiperfenilalaninemia materna não tratada pode resultar em prole não fenilcetonúrica com baixo peso ao nascer e sequelas neonatais, especialmente microcefalia e deficiência intelectual. Os mecanismos subjacentes à neuropatologia da lesão cerebral na síndrome da fenilcetonúria materna são pouco compreendidos. No presente estudo, avaliou-se o possível efeito preventivo da coadministração de creatina e piruvato sobre os efeitos desencadeados pela administração de fenilalanina a ratas Wistar durante a gestação e lactação em algumas enzimas envolvidas na rede de fosforil transferência no córtex cerebral e no hipocampo da prole aos 21 dias de idade. A administração de fenilalanina provocou diminuição do peso corporal, do córtex cerebral e hipocampo e diminuição da atividade da adenilato-cinase e creatina-cinase citosólica e mitocondria. A coadministração de creatina e piruvato foi eficaz na prevenção destas alterações provocadas por fenilalanina, sugerindo que modificações no metabolismo energético podem ser importantes na fisiopatologia da PKU materna. Se estas alterações também ocorrem na PKU materno, é possível que a suplementação com creatina e piruvato à dieta restrita em fenilalanina possa ser benéfica para os filhos de mães fenilcetonúricas. / Phenylketonuria (PKU) is the most frequent inborn error of metabolism. It is caused by deficiency in the activity of phenylalanine hydroxylase, leading to accumulation of phenylalanine and its metabolites. Untreated maternal PKU or hyperphenylalaninemia may result in nonphenylketonuric offspring with low birth weight and neonatal sequelae, especially microcephaly and intellectual disability. The mechanisms underlying the neuropathology of brain injury in maternal PKU syndrome are poorly understood. In the present study, we evaluated the possible preventive effect of the co-administration of creatine plus pyruvate on the effects elicited by phenylalanine administration to female Wistar rats during pregnancy and lactation on some enzymes involved in the phosphoryltransfer network in the brain cortex and hippocampus of the offspring at 21 days of age. Phenylalanine administration provoked diminution of body, brain cortex an hippocampus weight and decrease of adenylate kinase, mitochondrial and cytosolic creatine kinase activities. Coadministration of creatine plus pyruvate was effective in the prevention of those alterations provoked by phenylalanine, suggesting that altered energy metabolism may be important in the pathophysiology of maternal PKU. If these alterations also occur in maternal PKU, it is possible that pyruvate and creatine supplementation to the phenylalanine-restricted diet might be beneficial to the children born from phenylketonuric mothers.

Prolina (Pro) é metabolizada por suas próprias enzimas especializadas com seus próprios mecanismos de regulação e localizações teciduais e subcelulares. Foram descritos erros inatos no metabolismo da Pro em seres humanos. A Hiperprolinemia tipo II é uma doença hereditária causada por uma deficiência de Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, cuja característica bioquímica é a acumulação de Pro no plasma e tecidos causando diversos problemas, incluindo dano cerebral em alguns pacientes. Vários investigadores demonstram a Pro como uma fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) e uma relação entre uma concentração elevada de Pro e sintomas neurológicos tem sido demonstrada em pacientes com HPII. Uma vez que as mitocôndrias constituem uma fonte importante de EROs, investigou-se a geração de EROs mediada por Pro em mitocôndrias de fígado de rato. Os resultados sugeriram que uma função normal do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (CTE) parece ser essencial para a toxicidade da Pro, enquanto que a atividade dos complexos I e IV, e presença Ca+2, aparentemente, não são necessárias. Como existe uma escassez de informações sobre as funções da Pro no crescimento e desenvolvimento do feto e recém-nascido, bem como uma falta de novas estratégias terapêuticas, também investigamos a ação do piruvato e de creatina sobre os efeitos desencadeados pela administração crônica de Pro em ratas durante a gravidez e lactação sobre o cérebro da prole. administração de Pro nas mães induziu estresse oxidativo e diminuiu as atividades da piruvato quinase e creatina quinase no cérebro da prole. No entanto, a co-administração de creatina e piruvato preveniram apenas parcialmente as alterações causadas pela administração de Pro. / Proline (Pro) is metabolized by its own specialized enzymes with their own tissue and subcellular localizations and mechanisms of regulation. Inborn errors of Pro metabolism have been described. Type II Hyperprolinemia is an inherited disorder caused by a deficiency of Δ1-pyrroline- 5-carboxilic acid dehydrogenase, whose biochemical hallmark is Pro accumulation in plasma and tissues causing several problems including cerebral damage in some affected patients. Several investigators have shown that Pro is a source of reactive oxygen species (ROS) and a relationship between a high concentration of Pro and neurological symptoms has been demonstrated in patients with HPII. Since mitochondria constitute a major source of ROS, we investigated the generation of Pro-mediated ROS by Pro in rat liver mitochondria. We found that a normal function of complex III of the electron transport chain (ETC) seems to be essential for Pro toxicity, whereas activity of complexes I and IV and Ca+2 presence apparently are not required. Because there is a paucity of information about roles for Pro in growth and development of the fetus and neonate, as well as a lack on new therapeutic strategies, we also investigated the action of pyruvate and creatine on the effects elicited by chronic Pro administration to female rats during pregnancy and lactation on the offspring brain. We found that Pro administration to the mothers induced oxidative stress and diminished the pyruvate kinase and creatine kinase activities in the brain of the offspring. However, co-administration of creatine plus pyruvate did not fully prevented the alterations caused by Pro administration.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-20T15:45:34Z No. of bitstreams: 1 2010_RafaeladoSocorrodeSouzaeSilvaMoura.pdf: 957775 bytes, checksum: 59461723f79620cde77821717b9b643b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(tempestade_b@hotmail.com) on 2011-06-21T16:47:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_RafaeladoSocorrodeSouzaeSilvaMoura.pdf: 957775 bytes, checksum: 59461723f79620cde77821717b9b643b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-21T16:47:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_RafaeladoSocorrodeSouzaeSilvaMoura.pdf: 957775 bytes, checksum: 59461723f79620cde77821717b9b643b (MD5) / Introdução: O acometimento renal em hipertensos é considerado um fator de risco para eventos cardiovasculares adversos e progressão para doença renal crônica. A cistatina C parece identificar disfunções renais precocemente. Estudos sugerem que a cistatina C também pode ser considerada um fator de risco cardiovascular independente da função renal. Métodos: Realizou-se um estudo transversal com 117 pacientes com diagnóstico de hipertensão arterial primária. Foram excluídos pacientes diabéticos e com creatinina sérica igual ou superior a 1,5 mg/dL. Os pacientes foram submetidos a dosagem de cistatina C, creatinina, ácido úrico, perfil lipídico, proteína C reativa, microalbuminúria e depuração de creatinina endógena (DCr). A taxa de filtração glomerular (TFG) foi estimada por equações baseadas na creatinina, na cistatina C e na combinação de ambas. Sessenta e dois pacientes foram submetidos a exame ecocardiográfico para estimativa do índice de massa ventricular esquerda. Foi realizada uma análise comparativa entre a depuração de creatinina e as equações para estimativa da TFG por meio do coeficiente de correlação intraclasse e da análise gráfica de Bland-Altman. A cistatina foi correlacionada aos outros fatores de risco cardiovascular por meio do coeficiente de correlação de Pearson. Foram considerados significativos valores de p<0,05 e marginalmente significativos valores de p entre 0,05 e 0,10. Resultados: Doze pacientes (10,26%) apresentaram TFG < 60ml/min/1,73m2 estimada pela equação MDRD, e, quarenta e três pacientes (36,7%) apresentaram cistatina C superior a 0,95mg/L. Na análise comparativa entre as diversas equações e a DCr, observou-se que a melhor concordância foi apresentada pela equação MDRD (ICC = 0,42; IC95% = 0,26 – 0,56). A equação de Rule apresentou uma concordância estatisticamente igual zero com a DCr (ICC = 0,11; IC95% = -0,08 – 0,29). A equação de Rule também não apresentou concordância com as equações baseadas na creatinina. Na análise de Bland-Altman a menor diferença observada foi entre a fórmula combinada e a equação MDRD, com uma diferença média de 3,78. A cistatina C, diferentemente da creatinina, correlacionou-se positivamente com a microalbuminúria (r = 0,22; p = 0,02) e apresentou uma correlação marginal com o log TG/HDL (r = 0,18; p = 0,07). Conclusões: A equação MDRD e a equação que combina creatinina e cistatina apresentaram maior concordância com a depuração de creatinina. A cistatina C, diferentemente da creatinina, apresentou correlação com a microalbuminúria, portanto parece ser um marcador de dano renal precoce em pacientes com diagnóstico de hipertensão arterial primária. Estudos prospectivos na população de hipertensos brasileiros devem ser estimulados para comprovar se a cistatina C é um fator de risco cardiovascular independente da função renal. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Renal injury in hypertensive subjects is a risk factor cardiovascular events and kidney failure development. Cystatin C seems to detect early renal damage. Recent reports suggest that cystatin could be a risk factor for cardiovascular events independently of renal function. Methods: A transversal study with 117 hypertensive subjects was made. Diabetics and patients with creatinine values _ 1,5mg/dL were excluded. Cystatin C, creatinine, uric acid, cholesterol, triglycerides, C - reactive protein, microalbuminuria and creatinine clearance was evaluated. Glomerular filtration rate (GFR) was calculated by creatinine-based and cystatin-based equations. Left ventricular mass index (LVMI) was calculated in 62 patients by echocardiography. Intraclass correlation coefficient (ICC) and Bland-Altman graphic was used to compare creatinine clearance and RFG equations. For correlation between cystatin C and other cardiovascular risk factors it was used Pearson’s coefficient. Values of p < 0.05 were considered statistically significant and those between 0.05 and 0.10 were considered marginally significant. Results: Twelve patients (10,26%) had GFR < 60ml/min/1,73m2 estimated by MDRD equation and 43 (36,7%) had cystatin C > 0,95mg/L. Comparing with creatinine clearance, MDRD shows the best agreement (ICC = 0,42; CI 95% = 0,26 – 0,56). Rule equation shows the worst agreement (ICC = 0,11; CI 95% = -0,08 – 0,29). Bland-Altman analysis demonstrate better agreement between creatinine and cystatin combined equation and MDRD (average difference of 3,78). Serum cystatin C level, differently from creatinine, was positively correlated with microalbuminuria (r = 0,22; p = 0,02) and showed a correlation of marginal significance with the atherogenic index log TG/HDLc (r = 0,18; p = 0,07). Conclusions: MDRD and creatinine and cystatin combined equation shows the best agreement with creatinine clearance. Cystatin C, but not creatinine, correlates with microalbuminuria so it seems to be an early marker of renal damage in hypertensive subjects. Prospective studies should be done in Brazilian hypertensive population to evaluate whether cystatin C is a cardiovascular risk factor independently of renal function.

Prolina (Pro) é metabolizada por suas próprias enzimas especializadas com seus próprios mecanismos de regulação e localizações teciduais e subcelulares. Foram descritos erros inatos no metabolismo da Pro em seres humanos. A Hiperprolinemia tipo II é uma doença hereditária causada por uma deficiência de Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, cuja característica bioquímica é a acumulação de Pro no plasma e tecidos causando diversos problemas, incluindo dano cerebral em alguns pacientes. Vários investigadores demonstram a Pro como uma fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) e uma relação entre uma concentração elevada de Pro e sintomas neurológicos tem sido demonstrada em pacientes com HPII. Uma vez que as mitocôndrias constituem uma fonte importante de EROs, investigou-se a geração de EROs mediada por Pro em mitocôndrias de fígado de rato. Os resultados sugeriram que uma função normal do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (CTE) parece ser essencial para a toxicidade da Pro, enquanto que a atividade dos complexos I e IV, e presença Ca+2, aparentemente, não são necessárias. Como existe uma escassez de informações sobre as funções da Pro no crescimento e desenvolvimento do feto e recém-nascido, bem como uma falta de novas estratégias terapêuticas, também investigamos a ação do piruvato e de creatina sobre os efeitos desencadeados pela administração crônica de Pro em ratas durante a gravidez e lactação sobre o cérebro da prole. administração de Pro nas mães induziu estresse oxidativo e diminuiu as atividades da piruvato quinase e creatina quinase no cérebro da prole. No entanto, a co-administração de creatina e piruvato preveniram apenas parcialmente as alterações causadas pela administração de Pro. / Proline (Pro) is metabolized by its own specialized enzymes with their own tissue and subcellular localizations and mechanisms of regulation. Inborn errors of Pro metabolism have been described. Type II Hyperprolinemia is an inherited disorder caused by a deficiency of Δ1-pyrroline- 5-carboxilic acid dehydrogenase, whose biochemical hallmark is Pro accumulation in plasma and tissues causing several problems including cerebral damage in some affected patients. Several investigators have shown that Pro is a source of reactive oxygen species (ROS) and a relationship between a high concentration of Pro and neurological symptoms has been demonstrated in patients with HPII. Since mitochondria constitute a major source of ROS, we investigated the generation of Pro-mediated ROS by Pro in rat liver mitochondria. We found that a normal function of complex III of the electron transport chain (ETC) seems to be essential for Pro toxicity, whereas activity of complexes I and IV and Ca+2 presence apparently are not required. Because there is a paucity of information about roles for Pro in growth and development of the fetus and neonate, as well as a lack on new therapeutic strategies, we also investigated the action of pyruvate and creatine on the effects elicited by chronic Pro administration to female rats during pregnancy and lactation on the offspring brain. We found that Pro administration to the mothers induced oxidative stress and diminished the pyruvate kinase and creatine kinase activities in the brain of the offspring. However, co-administration of creatine plus pyruvate did not fully prevented the alterations caused by Pro administration.

A fenilcetonúria (PKU) é um dos erros inatos do metabolismo mais frequentes. Ela é causada pela deficiência na atividade da fenilalanina hidroxilase, levando à acumulação de fenilalanina e dos seus metabolitos no sangue e tecidos. A PKU ou hiperfenilalaninemia materna não tratada pode resultar em prole não fenilcetonúrica com baixo peso ao nascer e sequelas neonatais, especialmente microcefalia e deficiência intelectual. Os mecanismos subjacentes à neuropatologia da lesão cerebral na síndrome da fenilcetonúria materna são pouco compreendidos. No presente estudo, avaliou-se o possível efeito preventivo da coadministração de creatina e piruvato sobre os efeitos desencadeados pela administração de fenilalanina a ratas Wistar durante a gestação e lactação em algumas enzimas envolvidas na rede de fosforil transferência no córtex cerebral e no hipocampo da prole aos 21 dias de idade. A administração de fenilalanina provocou diminuição do peso corporal, do córtex cerebral e hipocampo e diminuição da atividade da adenilato-cinase e creatina-cinase citosólica e mitocondria. A coadministração de creatina e piruvato foi eficaz na prevenção destas alterações provocadas por fenilalanina, sugerindo que modificações no metabolismo energético podem ser importantes na fisiopatologia da PKU materna. Se estas alterações também ocorrem na PKU materno, é possível que a suplementação com creatina e piruvato à dieta restrita em fenilalanina possa ser benéfica para os filhos de mães fenilcetonúricas. / Phenylketonuria (PKU) is the most frequent inborn error of metabolism. It is caused by deficiency in the activity of phenylalanine hydroxylase, leading to accumulation of phenylalanine and its metabolites. Untreated maternal PKU or hyperphenylalaninemia may result in nonphenylketonuric offspring with low birth weight and neonatal sequelae, especially microcephaly and intellectual disability. The mechanisms underlying the neuropathology of brain injury in maternal PKU syndrome are poorly understood. In the present study, we evaluated the possible preventive effect of the co-administration of creatine plus pyruvate on the effects elicited by phenylalanine administration to female Wistar rats during pregnancy and lactation on some enzymes involved in the phosphoryltransfer network in the brain cortex and hippocampus of the offspring at 21 days of age. Phenylalanine administration provoked diminution of body, brain cortex an hippocampus weight and decrease of adenylate kinase, mitochondrial and cytosolic creatine kinase activities. Coadministration of creatine plus pyruvate was effective in the prevention of those alterations provoked by phenylalanine, suggesting that altered energy metabolism may be important in the pathophysiology of maternal PKU. If these alterations also occur in maternal PKU, it is possible that pyruvate and creatine supplementation to the phenylalanine-restricted diet might be beneficial to the children born from phenylketonuric mothers.

Los defectos de creatina cerebral (DCC) constituyen un grupo de enfermedades neurometabólicas hereditarias, descritas recientemente y hasta ahora infradiagnosticadas, tanto por la falta de procedimientos adecuados para su diagnóstico, como por el amplio e inespecífico espectro de síntomas con que se manifiestan.Se ha reportado que el defecto de transportador de creatina (CRTR) constituye una de las causas más frecuentes de retraso mental ligado al cromosoma X. Por ello, uno de nuestros objetivos ha sido determinar la prevalencia en nuestro medio del defecto de CRTR, mediante el cribaje de metabolitos de la Cr en orina en una población de pacientes afectos de retraso mental y/o autismo. Además se realizaron estudios bioquímicos para evaluar qué factores dietéticos pueden influir en la alteración de los resultados bioquímicos en orina y así dificultar el diagnóstico bioquímico de esta entidad.Posteriormente con el objetivo de incrementar el conocimiento del fenotipo clínico en pacientes con defecto de CRTR, evaluamos específicamente las características de la epilepsia, síntoma frecuente y que asocia complicaciones graves. Hemos estudiado los mecanismos fisiopatogénicos de la epilepsia y la eficacia de los respectivos tratamientos antiepilépticos además de evaluar la correlación fenotipo-genotipo respecto a la gravedad de la epilepsia.Dado que el defecto de CRTR, es una enfermedad que no dispone de tratamiento efectivo en la actualidad, gran parte de nuestro trabajo se ha basado en ensayar diferentes estrategias terapéuticas en pacientes con defecto de CRTR, y evaluar la respuesta a estos tratamientos.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-09T12:55:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9379467 bytes, checksum: 3d00842f5ce615ad92103a3787053deb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-09T12:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9379467 bytes, checksum: 3d00842f5ce615ad92103a3787053deb (MD5) Previous issue date: 2018-06-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho foi desenvolvido com os objetivos de avaliar a excreção de creatinina para validação da coleta spot de urina, bem como as excreções de derivados de purinas (DP) e compostos nitrogenados (CN) e suas relações com a creatinina em novilhas Nelore suplementadas a pasto (Capítulo 1); objetivou-se também avaliar a recuperação da creatinina em função do tempo e de diferentes temperaturas de armazenamento (Capítulo 2). O experimento referente ao Capítulo 1, foi conduzido no setor de gado de corte da Universidade Federal de Viçosa/MG, utilizando-se cinco novilhas Nelore com peso corporal (PC) médio de 400 ± 15kg, distribuídas em quadrado latino 5x5. Os cinco tratamentos experimentais se basearam na suplementação proteico-energética (concentrado com 22% de proteína bruta na matéria seca (MS), fornecido às12h), baseada no PC (0, 3, 6, 9 e 12 g/kg PC (PC0, PC3, PC6, PC9 e PC12, respectivamente)). Os animais receberam sal mineral ad libitum. Cada período experimental teve duração de 16 dias, sendo 12 de adaptação à dieta e quatro de coleta. A coleta total de urina e amostral de fezes, foi realizada em três dias, nos horários das 0h00-4h00, 4h00-8h00, 8h00-12h00, 12h00-16h00, 16h00-20h00 e 20h00-24h00. A coleta de spot de urina, foi realizada a cada 4 horas, assim como as coletas de líquido ruminal e sangue nos horários das 0, 4, 8, 12, 16, 20 horas. Para a coleta total de urina, utilizou-se sonda de Folley no26, acoplada a mangueira de polietileno que conduziu a urina até uma bolsa coletora de urina por sistema fechado, que foi esvaziada a cada quatro horas. A amostragem da urina coletada foi realizada a cada 4 horas, nos mesmos horários descritos para a coleta de sangue, medindo- se o volume e retirando-se duas amostras, uma diluída com solução H2SO4 0,036N e outra não diluída. Para determinação da excreção fecal, utilizou-se o dióxido de titânio, fornecido na quantidade total diária de 15g, entre os dias 8o e 16o de cada período. Para estimativa do consumo de pasto, utilizou-se a fibra indigestível em detergente neutro (FDNi) como indicador interno. Realizou-se coleta de pasto pela técnica do quadrado para determinação da MS potencialmente digestível (MSpd) no terceiro dia de cada período experimental. Nos dias 13o e 16o de cada período, realizou-se simulação de pastejo para estimar a composição do pasto ingerido. Nas amostras de urina foram determinadas as concentrações de creatinina, nitrogênio total urinário (NU), ureia (NUreia), ácido úrico (AU) e alantoína (AL). Para análise estatística utilizou-se o programa estatístico Proc Mixed do SAS 9.4. A avaliação da adequação da melhor forma de coleta de urina foi realizada utilizando a raiz quadrada do quadrado médio do erro da predição (QMEP) entre as amostras de urina obtidas por meio da coleta spot. O experimento, referente ao Capítulo 2, foi realizado no Departamento de Zootecnia da UFV. Foram utilizadas urina de vinte e cinco animais, dez provenientes da raça Nelore e quinze da raça Holandesa. As urinas (10 de Nelore e 10 de Holandês) foram diluídas em solução de H2SO4 0,036N, fracionadas e conservadas em temperatura ambiente, resfriadas (4oC) e congeladas (-20oC e a -40oC), analisadas em diferentes dias após a coleta (1, 3, 7, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 dias). Imediatamente após a coleta, a urina foi diluída e seu pH corrigido para valor inferior a 3, e a urina foi analisada, dando origem ao valor de creatinina, resultado utilizado como valor de referência da concentração de creatinina na amostra. Este valor referência, foi utilizado como divisor dos valores de creatinina obtidos nos dias da análise, por amostra, obtendo-se o valor de creatinina relativa, o que permite a observação do aumento ou diminuição da concentração de creatinina ao longo do tempo. Para avaliar a conversão de creatina em creatinina na urina de bovinos, utilizou-se urina proveniente de cinco bovinos da raça Holandesa. Estas urinas também foram diluídas e tiveram seu pH corrigido para valor inferior a 3. Para avaliar o efeito da adição de creatina na urina, adicionou-se solução de creatina (concentrações de 20, 40 e 60 mg/dL) nos eppendorf contendo urina diluída. Estas urinas foram analisadas em diferentes dias após a coleta (1, 3, 7, 15, 30 e 45 dias), sendo armazenadas nas mesmas temperaturas descritas anteriormente. No capítulo 1 observou-se efeito linear positivo (P=0,001) sobre o consumo de MS total devido ao aumento nas quantidades de suplemento fornecido aos animais, porém observou-se efeito quadrático (P=0,018) sobre a ingestão de MS proveniente do pasto. A ingestão de N diferiu entre os tratamentos (P<0,05), causado pelo aumentou na ingestão de suplemento, o que possibilitou aumento (P=0,001) na ingestão de CN. O fornecimento de suplementação possibilitou efeito sobre a concentração de N amoniacal ruminal (P<0,05). A concentração de N uréico no soro (NUS) foi afetada (P<0,05) pelo fornecimento de concentrado no período de 24 horas, porém o tratamento PC0 não apresentou variação na concentração de NUS (P>0,05), em função da ausência de suplementação. A excreção de creatinina diária foi de 23,01 ± 0,19 (22,82 – 23,2) mg/kgPC. As excreções de AL, AU e DP, em mmol, foram influenciadas linearmente pelos tratamentos (P=0,002; P=0,004; P=0,003, respectivamente). A síntese de nitrogênio microbiano (NM) foi influenciada, assim como as excreções de DP, linearmente (P=0,001) pelos tratamentos. As relações entre AL, AU e DP com a creatinina, não foram influenciadas pelos dias de coleta, períodos de coleta, tratamentos e suas interações (P>0,05), apresentando média de relações de 1,36 para AL:creatinina, 0,121 para AU:creatinina e 1,48 para PD:creatinina. Além do efeito de tratamento sobre a excreção de NU e NUrea, a excreção de CN na urina foi influenciada (P<0,05) também pelos períodos de coleta. As relações NU:creatinina e NUreia:creatinina na urina não apresentaram efeito (P>0,05) de tratamento, dias e períodos de coleta. A avaliação comparativa da excreção de creatinina observada nas amostras obtidas a partir da coleta total de urina, a cada 4 horas por 3 dias, com as amostras spot de urina obtidas em momentos pontuais (às 12, 16, 20, 0, 4 e 8 horas), demonstrou não haver diferença (P>0,05) entre as duas formas de coleta estudadas. A observação das relações AL:creatinina e AU:creatinina, nos métodos de coleta avaliados neste estudo, possibilitou a observação de que não houve variação (P>0,05) entre as amostras obtidas na forma de coleta total ou spot de urina. Na análise das relações NU:creatinina e NUreia:creatinina, observou-se que os horários das amostras obtidas às 4, 8, 12, 16 e 20 horas, foram similares (P>0,05) independentemente do método de amostragem. Entretanto, no horário da meia noite (amostragem 20h00-24h00, coleta total/0 hora, coleta spot de urina), observou-se variação na excreção de NU (inclinação, P=0,03) e de NUreia (inclinação, P=0,01; e intercepto, P=0,03), indicando que coletas spot de urina realizadas neste horário, não representariam a excreção de CN ao longo do período de 24 horas. Conclui- se que a excreção de creatinina é constante em 24h e estima adequadamente o volume urinário em bovinos mantidos em pastejo; e que uma única amostra spot de urina obtida no pasto, em qualquer horário do dia, pode ser usada para estimar a excreção de derivados de purinas. Para a estimativa da excreção de CN na urina são necessárias duas amostras spot de urina, uma quatro horas antes e outra quatro após a suplementação, em bovinos em pastejo. Os principais resultados do capítulo 2 foram que, a recuperação da creatinina foi constante (P>0,05) até o décimo quinto dia de armazenamento, independente da temperatura utilizada. A partir do 30o dia de armazenamento houve efeito de tempo e/ou temperatura (P<0,05) na recuperação de creatinina na urina de bovinos. As amostras armazenadas em temperatura ambiente e a 4oC apresentaram aumento na concentração da creatinina relativa com o passar dos dias (P<0,05). As amostras congeladas (-20oC e a -40oC) mantiveram a recuperação constante (P>0,05). A adição de creatina na urina causou aumento (P<0,05) nas concentrações de creatinina nas amostras armazenadas a temperatura ambiente e em refrigeração, a partir de 30 dias de armazenamento. Nas amostras armazenadas em temperaturas de congelamento, não houve alteração na concentração de creatinina (P>0,05). Amostras de urina podem ser armazenadas em qualquer temperatura estudada até quinze dias após a coleta para determinação da concentração de creatinina. Amostras que necessitem tempos de armazenamentos superiores a quinze dias devem ser congeladas a -20oC ou -40oC. / Aimed to evaluate the creatinine excretion to validate the urine spot sampling technique, as well as the excretions of purine derivatives (PD) and nitrogen compounds (NC) and their relationship with creatinine in Nelore heifers supplemented on pasture (Chapter 1); Were also aimed evaluate the recovery of creatinine as a function of time and different storage temperatures (Chapter 2). The experiment related to Chapter 1 were conducted in the beef cattle department of the Federal University of Viçosa/MG, using five Nelore heifers with mean body weight (BW) of 400 ± 15 kg, distributed in 5x5 Latin square. The five experimental treatments were based on protein-energy supplementation (concentrate with 22% crude protein in dry matter (DM) bases) offered based on BW (0, 3, 6, 9 and 12 g/kg BW (BW0, BW3, BW6, BW9 and BW12, respectively)). Each experimental period had a duration of 16 days, 12d to diet adaptation and four to sampling of urine, feces, blood and ruminal fluid. The total collection of urine and spot of feces sample was performed in three days, from 0:00-4:00, 4:00-8:00, 8:00-12:00, 12:00-16:00, 16:00- 20:00 and 20:00-24:00. Sampling spot of urine was performed for 24 hours, as well as the collection of ruminal fluid and blood at the times of 0, 4, 8, 12, 16, 20 hours. For total urine collection, a Folley no26 probe was used, coupled with a polyethylene hose that carried the urine to a closed urine collection bag, which was emptied every four hours. Sampling of the urine was performed every 4 hours, at the same times as described for blood sampling, by measuring the volume and taking two samples, one diluted with 0.036N H2SO4 and one undiluted. To determine fecal excretion, titanium dioxide, supplied in the total daily amount of 15 g, was used between days 8th and 16th of each period. In order to estimate pasture consumption, indigestible neutral detergent fiber (iNDF) was used as the internal marker. Pasture was collected by the square technique to determine the potentially digestible DM (pdDM) on the third day of each experimental period. On the 13th and 16th days of each period, manual grazing simulation was performed to estimate the composition of the pasture. In the urine samples, the concentrations of creatinine, total urinary nitrogen (UN), urea (UreaN), uric acid (UA) and allantoin (AL) were determined. Statistical analysis was performed using SAS's 9.4 Proc Mixed statistical software. The evaluation of the adequacy of the best form of urine collection was performed using the square root of the mean square of the prediction error (MSPE) among the urine samples obtained through spot sampling. The experiment, referring to Chapter 2, was carried out at the Animal Science Department of the UFV. Urine of twenty-five animals, ten from the Nelore and fifteen from the Holstein, were used. Urine samples (10 from Nelore and 10 from Holstein) were diluted in 0.036N H2SO4, fractionated and stored at room temperature, cooled (4°C) and frozen (-20°C and -40°C), being analyzed different days after sampling (1, 3, 7, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 days). Immediately after sampling, the urine was diluted, and its pH corrected to less than 3, and the urine was analyzed, giving a result used as a reference value of the creatinine concentration in the sample. This reference value was used as a divider of the creatinine values obtained on the days of the analysis, per sample, obtaining the relative creatinine value, which allows the observation of increase or decrease in creatinine concentration over time. To evaluate the conversion of creatine to creatinine in the urine of cattle, urine from five Holstein cows was used. These urines were also diluted and had their pH corrected below 3. To evaluate the effect of adding creatine to the urine, creatine solution (concentrations of 20, 40 and 60 mg/dL) was added to eppendorf containing diluted urine. These urines were analyzed on different days after sampling (1, 3, 7, 15, 30 and 45 days), being stored at the same temperatures described previously. In Chapter 1, a positive linear effect (P=0.001) was observed on the total DM intake due to the increase in the amount of supplementation provided to the animals. However, a quadratic effect (P=0.018) was observed on DM intake from pasture. Intake of N differed among treatments (P<0.05), caused by increased supplement intake, which allowed an increase (P=0.001) on the intake of N NC. The supply of supplementation influenced the ruminal ammoniacal N concentration (P<0.05). Serum urea N concentration (SUN) was affected (P<0.05) by the supply of concentrate in the 24-hour period, once the BW0 treatment did not show a variation in the SUN (P>0.05), as a function absence of supplementation. The creatinine excretion daily was 23.01 ± 0.19 (22.82 - 23.2) mg/kgBW. Excretions of AL, UA and PD, in mmol, were influenced by treatments (P=0.002, P=0.004, P=0.003, respectively). Microbial N synthesis (NM) was influenced, as well as the excretions of PD (P=0.001) by the treatments. The ratios between AL, UA and PD with creatinine were not influenced by collection days, collection periods, treatments and their interactions (P>0.05), with an average ratios of 1.36 for AL:creatinine, 0.121 for UA:creatinine and 1.48 for PD:creatinine. In addition to the treatment effect on UN and UreaN excretion, urine excretion of NC was also influenced (P<0.05) by collection periods. The UN:creatinine and UreaN:creatinine ratios showed no treatment effect (P>0.05), days and collection periods. The comparative evaluation of creatinine excretion observed in the samples obtained from the total collection of urine, sampling every 4 hours per 3 days, with the urine spot samples obtained at punctual moments (at 12, 16, 20, 0, 4 and 8 hours), showed no difference (P>0.05) between the two techniques of sampling. The observation of AL:creatinine and UA:creatinine of the two methods evaluated in this study allowed the observation that there was no variation (P>0.05) between the samples obtained in the form of total collection or urine spot. The analysis of the UN:creatinine and UreaN:creatinine ratios, it was observed that the sample times obtained at 4, 8, 12, 16 and 20 hours were similar (P>0.05) regardless of the sampling method. However, at midnight (sampling 20h00-24h00, total collection/0h, urine spot collection), there was variation in the excretion of UN (slope, P=0.03) and UreiaN (slope, P=0.01, and intercept, P=0.03), indicating that urine spot collections performed at this time would not represent NC excretion over the 24-hour period. Concluded that creatinine excretion is constant in 24 hours and adequately estimates the urinary volume in beef cattle kept in pasture; and that a single urine spot sample obtained in the pasture, at any time of the day, can be used to estimate the purine derivatives excretion. However, two urine spot samples, one obtained four hours before and other four hours after supplementation, are required for the estimation of excretion of CN in urine in grazing cattle. The main results of Chapter 2 were that the creatinine recovery was constant (P>0.05) until the 15th day of storage, regardless of the temperature used. From the 30th day of storage there was a time and/or temperature effect (P<0.05) on the recovery of creatinine in bovine urine. Samples stored at room temperature and at 4oC showed an increase in relative creatinine concentration with the passage of days (P<0.05). Frozen samples (-20oC and -40oC) maintained the constant recovery (P>0.05). The addition of creatine in the urine caused an increase (P<0.05) on creatinine recovery in the samples stored at room temperature and in refrigeration, after 30 days of storage. In samples stored at freezing temperatures, there was no change in creatinine recovery (P>0.05). Urine samples can be stored at any temperature evaluated to 15 days after collection for determination of creatinine concentration. Samples requiring storage times greater than 15 days should be frozen at - 20°C or -40°C.