Transmissible spongiform encephalopathy (TSE) strains are defined by their biological properties on transmission to wild-type mice, specifically by their characteristic incubation periods and patterns of vacuolar pathology (‘lesion profiles’) in the brain. Whilst a single TSE strain has been identified in variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD), the phenotypic heterogeneity observed in sporadic CJD (sCJD) implies the existence of multiple strains of agent. These distinct strains are proposed to be enciphered by the different conformers of abnormal prion protein (PrP), recognised as different protease resistant PrP (PrPres) types by Western blotting (type 1 or type 2) and are thought to be substantially influenced by the different prion protein gene (PRNP) codon 129 polymorphism (MM, MV and VV). To test the relationship between disease phenotype and agent strain, this study carried out a full characterisation of the sCJD agent by primary transmission of brain tissue from 27 sCJD cases (comprising all six possible combinations of PRNP codon 129 genotype and PrPres type) in panels of wild-type mice using the standard strain typing properties of incubation period and lesion profiles, plus a full analysis of PrP in the mouse brain and the PrPres molecular subtypes present. Results were directly compared with the transmission characteristics of brain tissue from 10 vCJD cases. The characterisation of the agent strain in sCJD and vCJD was extended to include analysis of subsequent mouse-to-mouse passages. In an additional investigation, wild-type mice were experimentally challenged with a wide-range of lymphoid tissues, neural tissues and biological fluids from vCJD and sCJD patients in order to investigate the extent of peripheral involvement in CJD and to determine whether the agent is subject to any tissue-specific modifications. Analysis of all 27 sCJD sources demonstrated the existence of two strains of agent, one associated with the MM1/MV1 subgroups and the other associated with the MM2 subgroup, which could be distinguished by their transmission properties in the mice. The lack of transmission in mice challenged with VV1, MV2 and VV2 tissues provided evidence of at least one further sCJD strain. In contrast, all 10 vCJD sources resulted in consistent incubation periods and lesion profiles, suggesting that all 10 patients investigated were infected with the same strain of agent. Overall, the observation that PrPres type in sCJD and vCJD was maintained on transmission is consistent with the proposition that PrPres type plays a role in enciphering strain-specific information. Experimental transmissions from peripheral tissues extended the evidence for a peripheral infection in vCJD. However, comparison of incubation periods and lesion profiles from transmission of brain and peripheral tissues showed no evidence of tissue-specific modification in the biological properties of the agent. Furthermore, the detection of low levels of infectivity in a sCJD buffy coat sample provides supporting evidence for a peripheral involvement in sCJD. This study highlights the complex relationship between disease phenotype, PRNP codon 129 genotype, PrPres type and agent strain in sCJD and vCJD. Overall, this study confirms that multiple strains of agent are associated with sCJD, some of which successfully propagate in wild-type mice but none of which are identical to the agent responsible for vCJD. Importantly, the sCJD strains identified here by their biological properties partially correlated with the current sub-classification system for sCJD which is based on the clinical and pathological phenotype of the disease.

Les maladies à prions sont des pathologies neurodégénératives d’évolution fatale, transmissibles, pour lesquelles aucun traitement efficace n’existe. Elles associent sur le plan neuropathologique une spongiose, une gliose astrocytaire, une perte neuronale, et une accumulation de la forme anormalement repliée (PrPsc) de la protéine prion cellulaire codée par l’hôte. Certaines formes de cette maladie sont associées à une tauopathie et présentent des lésions neuropathologiques similaires à celles retrouvées dans la maladie d’Alzheimer (MA).Nous avons utilisé un modèle de cultures primaires de neurones afin d’explorer d’une part la relation entre la protéine prion et la physiopathologie de la protéine tau, et d’étudier d’autre part la propagation de souches humaines et l’effet de composés anti-prions sur cette propagation. Nos résultats indiquent que l’hyperphosphorylation de tau en réponse à l’exposition de PrP recombinantes est mutation dépendante, conformation dépendante, partiellement dépendante de la PrPc et est médiée par la kinase PDK1. Nous avons aussi démontré pour la première fois que la propagation d’isolats humains de maladie de Creutzfeldt-Jakob est possible dans un modèle in vitro et permet une évaluation rapide de l’efficacité de composés anti-prions, confirmée in vivo. Ces travaux ont permis de mieux caractériser la relation protéine amyloïde-physiopathologie de tau, d’ouvrir des perspectives de recherche dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la MA, et d’apporter un modèle unique permettant d’évaluer rapidement les effets de molécules anti-prions vis-à-vis des souches les plus pertinentes, dans une stratégie de repositionnement thérapeutique. / Prion diseases are fatal transmissible neurodegenerative disorders, with no effective treatment. Brain lesions include neuronal vacuolization, astrogliosis, neuronal loss and the accumulation of PrPSc, an abnormal isoform of the host-encoded cellular prion protein (PrPc). Some forms of prion diseases are associated with tau fibrillar pathology similar to that observed in Alzheimer’s disease except that Abeta peptides are replaced by PrPsc. Here we used a primary neuronal cultures to first explore the interplay between the formation of prion protein assemblies and the occurrence of tau pathology, and secondly to evaluate in vitro human strain propagation and the efficiency of some antiprion compounds towards human prions. We showed that tau hyperphosphorylation in response to recombinant PrPs exposition was mutation-dependent, conformation-dependent and varied with the PrPc expression level of exposed neurons. This effect was mediated by PDK1 kinase. We also demonstrated for the first time that human prion isolates could propagate in an in vitro model. This model was also useful to evaluate the efficacy of antiprion compounds that was further validated in vivo. Our results help us to better understand the amyloid protein-tau physiopathology interplay and provide a useful and unique tool for fast evaluation of therapeutic compounds active against human prion strains in a repositioning strategy in such rare but devastating diseases.

Le diagnostic biologique des maladies à prions du vivant du patient repose sur la recherche de protéine 14.3.3 dans le liquide céphalo-rachidien. Le dosage conjoint de la néoptérine permet d'améliorer nettement sa spécificité. Cependant, les performances analytiques ne sont pas suffisantes pour établir un diagnostic de certitude. Dans la quête d'un marqueur supposé plus spécifique, nous avons recherché la protéine prion pathologique résistante à la protéinase K (PrPres) dans le nerf péronier. Malgré l'optimisation de notre méthode, nous ne l'avons détecté que dans un cas sur trois. Cela nous a conduit à utiliser et valider la streptomycine comme ligand exogène pour concentrer la PrPres. Nous avons démontré sa capacité à concentrer la PrPres d'origine cérébrale et amygdalienne; sa sensibilité analytique s'avère être équivalente, pour une faible quantité de tissu initiale (5 mg), à celle de l'acide phosphotungstique. Par ailleurs, nous avons pu correctement classer, à partir d'un nombre significatif d'échantillons cérébraux, les patients EST des patients non atteints d'une EST avec une sensibilité et une spécificité de 100 %. Ainsi, nous disposons d'un outil susceptible d'augmenter la sensibilité des techniques initialement utilisées pour détecter la PrPres dans des nerfs facilement accessibles par biopsie.

Le diagnostic de la maladie d'Alzheimer (MA) est tardif et présente un manque de fiabilité en regard de l'examen neuropathologique postmortem permettant de confirmer ce diagnostic. En effet, les présentations cliniques de la MA peuvent être multiples et parfois atypiques. Des anomalies dans les concentrations des protéines tau, tau phosphorylées et amyloïdes bêta, au sein du liquide céphalorachidien (LCR), ont permis d'améliorer le diagnostic du vivant du patient. Nous avons évalué la performance de ces marqueurs, dans le LCR, utilisés pour le diagnostic de la MA dans les formes syndromiques atypiques. L'utilisation de ces marqueurs augmente la précision du diagnostic lors de ces différentes présentations cliniques. De plus, nous avons mis au point un test diagnostic biochimique postmortem des différentes tauopathies permettant de mieux les caractériser en complément de l'examen neuropathologique. Enfin, nous avons conçu et caractérisé des anticorps spécifiquement dirigés contre la protéine tau phosphorylée en position 231. Cet outil nous a permis de développer un test ELISA dans le LCR. Des résultats préliminaires suggéreraient une interaction in vivo entre les protéines tau et Prion. Ces résultats, décrits pour la première fois, sont corrélés à nos observations histologiques.

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) constituent de graves maladies neurodégéneratives atypiques, affectant aussi bien l'homme que l'animal. Ces maladies ont une origine infectieuse, génétique ou sporadique. On distingue chez l'homme la maladie de Creutzfeldt-Jakob, le syndrome de Gerstmann-Sträussler-Sheinker, le nouveau variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob dû à l'ingestion d'aliments contaminés, et les formes iatrogènes, qui surviennent le plus souvent à la suite d'une contamination contractée lors d'interventions chirurgicales. Les maladies à prions animales les plus courantes sont l'encéphalopathie spongiforme bovine et la tremblante du mouton. Le facteur commun à toutes ces maladies est la protéine prion ou PrP, présente de façon ubiquitaire dans l'organisme et de manière prépondérante dans le cerveau. La PrP existe sous deux états conformationnels qui ont la même séquence en acides aminés, mais qui possèdent des propriétés physicochimiques différentes. La forme anormale du prion appelée "scrapie" ou "PrPsc " est partiellement résistante aux protéases et plus riche en feuillets b que la PrPc, ce qui lui confère une susceptibilité exacerbée à l'agrégation. L'hypothèse de "la protéine seule" proposée par Prusiner prédit que le titre infectieux serait composé uniquement de la PrPsc, capable de se répliquer de manière autocatalytique en se servant de la PrPc endogène comme matrice de conversion. Les mécanismes moléculaires régissant ce processus sont encore mal connus. Cependant ce phénomène de conversion apparaît comme l'évènement central contrôlant l'infection et sa propagation vers le système nerveux central. Ces processus nécessitent la présence de la PrPc endogène, puisqu'il a été montré que des souris invalidées pour la protéine prion résistent à l'infection et sont viables. Ces observations ouvrent de nouvelles perspectives en terme d'approches thérapeutiques théoriquement envisageables dans le domaine des EST. La PrPc, après une étape de maturation, subit un clivage physiologique à la membrane plasmique en position 111/112 qui conduit à la formation d'un fragment sécrété appelé N1. Des travaux effectués dans notre laboratoire ont montré que ce clivage est constitutif et régulé par la PKC et nécessite l'activité des disintégrines ADAM10 et ADAM17, respectivement. Mon travail de thèse à consisté à étudier ce clivage en identifiant les isoformes de la PKC impliquées, et à démontrer sa régulation par les récepteurs muscariniques.

INTRODUCCIÓN: Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) o enfermedades por priones son un grupo de enfermedades neurodegenerativas letales que afectan al ser humano y a otros mamíferos. El agente causal de estas enfermedades es el prión, que es una isoforma anómala de una proteína celular normal codificada en el gen PRNP. La Organización Mundial de la Salud, en 1998, estableció, para el diagnóstico de las enfermedades priónicas humanas, las categorías de definitivo, probable y posible. El diagnóstico se confirma en el estudio neuropatológico, o, en el caso de las formas genéticas, en el análisis genético si este demuestra la presencia de una mutación patogénica en el gen de PRNP. El diagnóstico de ECJ in vivo, con categoría de probable, se realiza cuando a una serie de criterios clínicos se añade la presencia de complejos periódicos en el EEG o la prueba de proteína 14-3-3 positiva en el caso de las formas esporádicas. Con el nombre de proteína 14-3-3 se denomina a una familia de proteínas especialmente abundante en sistema nervioso central y su detección a través de un método de inmunoblot, se demostró que se asociaba al diagnóstico de ECJ esporádica.OBJETIVOS: O1: Estudiar la evolución de la demanda y la validez de la prueba de proteína 14-3-3 durante el periodo 1997-2000 en España. O2: Mejorar la sensibilidad y especificidad de la prueba de la proteína 14-3-3 para el diagnóstico de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) y analizar los patrones atípicos en el resultado de la prueba. O3: Analizar el polimorfismo del exon 1 del gen Tau en enfermedades por priones y determinar si este modifica la predisposición a padecer enfermedades priónicas o la expresión clínica de estas. O4: Caracterizar clínica y genéticamente las enfermedades por priones humanas en Cataluña en el periodo 1993-2001 TRABAJOS que conforman esta tesis doctoral: T1: Utilización y validez de la prueba de la proteína de 14-3-3 en el diagnóstico de enfermedades priónicas: estudio prospectivo de 4 años. Medicina Clínica 2003 (en prensa). T2: Isoformas de la proteína 14-3-3 y patrones atípicos en la prueba de la 14-3-3 en el diagnóstico de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Neuroscience Letters 2002; 320: 69-72. T3: Análisis del polimorfismo del exon 1 del gen Tau en las encefalopatías espongiformes transmisibles. Journal of Neurology 2002; 249: 938-939. T4: Características clínicas y genéticas de las enfermedades priónicas humanas en Cataluña (1993-2001). CONCLUSIONES: C1. El número de pruebas de proteína 14-3-3 en LCR solicitadas a nuestro laboratorio se ha incrementado a lo largo del periodo 1997-2000. Paralelamente, han aumentado el número de falsos positivos y disminuido el valor predictivo positivo de la prueba . Las causas más frecuentes de FP pueden y deben ser excluidas por la evaluación clínica y las pruebas complementarias apropiadas. Un resultado negativo es altamente predictivo de ausencia de la enfermedad en nuestro medio. C2. Los anticuerpos frente a las diferentes isoformas de proteína 14-3-3 no aumentan la sensibilidad ni la especificidad obtenida con el anticuerpo estándar para el diagnóstico de ECJ. La banda inferior característica de patrones de positividad atípicos de la prueba de 14-3-3, se origina por una reacción cruzada del anticuerpo anti-proteína 14-3-3 con las cadenas ligeras de immunoglobulinas libres presentes en el LCR. C3. No existe evidencia, en nuestra población, de asociación entre el polimorfismo del exón 1 del gen Tau y la predisposición a padecer enfermedades priónicas, o el perfil de expresión clínico de la enfermedad. C4. La distribución de los subtipos etiológicos y de las características genéticas y clínicas de los pacientes catalanes con enfermedades priónicas es similar a lo descrito en otras poblaciones europeas. Hasta un tercio de las formas genéticas diagnosticadas carecían de antecedentes familiares conocidos. Las formas valina-valina de ECJ esporádica y las formas genéticas presentan con más frecuencias manifestaciones clínicamente atípicas. No se ha detectado ningún caso de variante de ECJ en Cataluña en el periodo estudiado.

Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) is the commonest form of human prion disease and occurs in sporadic, genetic and acquired forms. The causative agents (prions) appear to be composed entirely of a modified host protein, the prion protein, which undergoes misfolding to a disease-associated isoform closely associated with infectivity that is resistant to conventional methods of decontamination. Prions can be transmitted from one individual to another by medical and surgical procedures, resulting in iatrogenic CJD (iCJD). The commonest cause of iCJD is the inoculation of cadaveric pituitary-derived human growth hormone (hGH) to treat growth hormone deficiency in children; this form of treatment was abandoned in 1985 after the first UK case of iCJD in a hGH recipient was identified. Seventy-eight cases of iCJD have since occurred in the UK cohort of 1849 hGH recipients, including a case in 2016. This thesis describes a comprehensive tissue-based and molecular genetic analysis of the largest series (35 cases) of UK hGH-iCJD cases reported to date, including in vitro kinetic molecular modelling of genotypic factors influencing prion transmission. The results show that the polymorphism at codon 129 of the prion protein gene strongly influences the disease incubation period in hGH-iCJD (from 7.8-32.3 years in this series) and interacts with the infectious prion strain to govern the molecular and pathological characteristics of iCJD. The findings are consistent with the hypothesis that the UK hGH-iCJD epidemic resulted from transmission of the V2 human prion strain, which is found in the second most common form of sporadic CJD. The investigation also found accumulation of the amyloid beta (Aβ) protein associated with Alzheimer’s disease (AD) in the brains and cerebral blood vessels in 18/35 hGH-iCJD patients and 5/12 control patients who had been treated with hGH, but died from causes other than iCJD. In contrast, Aβ accumulation was markedly less prevalent in age-matched patients who died from sporadic CJD (1/15 cases) and variant CJD (2/33 cases). These results are consistent with the hypothesis that Aβ, which can accumulate in the pituitary gland, was present in the inoculated hGH preparations and seeded into the brains of around 50% of all hGH recipients, producing AD-like neuropathology and cerebral amyloid angiopathy (CAA). This provides further evidence of the prion-like properties of Aβ and gives insight into the potential for possible transmission of AD/CAA. It is uncertain whether any Aβ seeding within the brains of surviving patients in the UK hGH recipient cohort will ultimately result in clinical AD; however, the CAA in these patients may be complicated by intracerebral haemorrhage resulting from rupture of the blood vessels damaged by Aβ accumulation within their walls.

One of the key molecular events in the transmissible spongiform encephalopathies or prion diseases is the conformational conversion of the cellular prion protein PrPC into the misfolded and pathogenic isoform, PrPSc. Prion diseases are fatal neurodegenerative conditions affecting humans and other animal species, which present with diverse clinical and neuropathological phenotypes. In humans, prion diseases can occur as sporadic, familial or acquired forms. Sporadic Creutzfeldt–Jakob disease (sCJD) accounts for the majority of cases. The current classification system of human prion diseases recognizes several distinct clinico-pathological entities including sCJD, variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD), Gerstmann–Straussler–Scheinker syndrome, fatal familial insomnia and variably protease-sensitive proteinopathy. Prion protein gene (PRNP) mutations and polymorphisms, and PrPSc types have a profound effect on these clinico-pathological phenotypes. Prion diseases of sheep and goats, cattle, and cervids are all actual animal health problems and present potential risks to human health. Thus far the only known zoonotic prion disease is bovine spongiform encephalopathy, which has resulted in vCJD in humans. The recognition of new forms of prion diseases in animal and humans has generated increased awareness of the animal and public health risks associated with prion disease. However the mechanisms involved in prion replication, transmission, and neurodegeneration remain poorly understood. This thesis uses in vitro PrP conversion assays (protein misfolding cyclic amplification and real time quaking-induced conversion) to model different aspects of human prion replication: Molecular susceptibility, genetic compatibility, spontaneous formation and the effect of molecules that might enhance or prevent conversion were each investigated in order to obtain a better understanding of the molecular mechanism of the prion replication. I have addressed the hypothesis that the major determinant factors in prion disease pathogenesis (PRNP genetics, PrPSc types and species barriers) are intrinsic to the prion protein conversion process and their effects can be faithfully recapitulated by in vitro conversion assays. The results shows that in vitro conversion assays used in this thesis can model the combined effects of different PrP type and genotypes, can replicate aspects of cross-species transmission potential and provide information about molecular barrier to zoonotic transmission, can model de novo PrPSc formation, and can assess the potential impact of chaperones on conversion of the human prion protein. In summary, this work provides evidence that the origin, propagation and transmission of prions can be meaningfully investigated in cell-free systems.

Prionkrankheiten sind übertragbare, tödliche neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen und bei Tieren. Sie basieren auf der Konversion des zellulären Prion-Proteins (PrPC) in seine pathogene Form (PrPSc). Durch diese Konversion sind Prionkrankheiten pathogen und übertragbar. Bis heute ist weder der dem zugrunde liegende Mechanismus verstanden noch eine Behandlung gefunden worden. Die sichere Diagnose einer sporadischen Prionkrankheit ist ausschließlich mittels Gehirnbiopsie möglich, weswegen zu Lebzeiten des Patienten häufig nur die Diagnose einer wahrscheinlichen Prionkrankheit erfolgt. Zusammen mit der klinischen Heterogenität der Prionkrankheiten weisen neueste Erkenntnisse auf das Vorhandensein mehrerer humaner Prionstämme hin. Für die Suche nach Medikamenten fehlt ein geeigneter Wirkstoff-Suchtest, der auf der humanen Pathogenese basiert, für einen hohen Durchsatz geeignet und gut reproduzierbar ist. Die real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC), eine neu entwickelte in vitro-Methode, erlaubt den Nachweis von bisher nicht messbaren Mengen an PrPSc in humanem Liquor cerebrospinalis (Liquor). Dazu werden die selbst-replizierenden Eigenschaften des PrPSc genutzt. Erste Untersuchungen weisen auf distinkte Eigenschaften humaner Prionkrankheiten in der RT-QuIC hin. Zum Einsatz in Diagnostik und Forschung bedarf es jedoch einer umfassenden Validierung der Methode für die Anwendung mit humanem Liquor. In dieser Arbeit beträgt die Sensitivität der RT-QuIC 85,5 % und die Spezifität 99,5 % für humane Prionkrankheiten. Die Reproduzierbarkeit im Ringversuch ist gut bis exzellent. Die Kurzzeitlagerungen der Liquorproben bei Raumtemperatur und +4°C sowie die Langzeitlagerung bei −80°C und das wiederholte Einfrieren und Auftauen haben keinen Einfluss auf die Testergebnisse. Jedoch führt die Kontamination mit Blut zu falsch-negativen Resultaten. Diese Ergebnisse weisen auf eine Eignung der RT-QuIC zur sicheren Diagnose von Prionkrankheiten zu Lebzeiten der Patienten hin. Zur Charakterisierung des Reaktionspotentials möglicher humaner Prionstämme wurden Liquorproben von verschiedenen humanen Prionkrankheiten wie bspw. der sporadischen und der genetischen Form mittels RT-QuIC untersucht. Die Auswertung der Daten zeigt distinkte Eigenschaften des PrPSc im Liquor, die moduliert werden durch die Form der Prionkrankheit, den Prnp Codon 129-Genotyp und die Krankheitsdauer. Diese Ergebnisse zeigen das Potential der RT-QuIC, die selbst-replizierenden Eigenschaften des PrPSc im Liquor zu untersuchen, womit erstmals eine Methode zur Verfügung steht, um diese Effekte in Patienten während der symptomatischen Phase zu studieren. Zur Nutzung der RT-QuIC als neuartige Methode zur Wirkstoffsuche wurde die Wirkung mehrerer Stoffe auf die RT-QuIC-Reaktion untersucht. Doxyzyklin inhibiert diese Reaktion sowohl in Korrelation mit der Dosis als auch mit dem Zeitpunkt der Zugabe. Diese Ergebnisse weisen auf eine Eignung der RT-QuIC zur Suche von Stoffen hin, die den PrP-Konversionsprozess inhibieren und zeigen die inhibierende Wirkung von Doxyzyklin auf die in-vitro-Amplifikation von PrPSc.

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