Contexte : La transmission du paludisme à Plasmodium falciparum repose sur le développement intra-érythrocytaire de parasites sexués (les gamétocytes) et leur ingestion par un moustique vecteur. Par filtration au travers d’une matrice de microsphères (microsphiltration), nous avons montré que les gamétocytes matures -normalement présents dans la circulation des sujets transmetteurs- sont déformables. Leur capacité à se déformer pour traverser la rate est essentielle à leur présence en circulation. Objectifs : Ce projet vise à découvrir des composés rigidifiant les érythrocytes contenant des gamétocytes pour bloquer la transmission du paludisme. En quelques heures, les gamétocytes rigidifiés seront exclus de la circulation sanguine -donc du cycle de transmission- par la rate. Méthodes et résultats: La microsphiltration a été miniaturisée au format microplaque et couplée à la microscopie à haut débit pour quantifier le nombre de gamétocytes retenus par les filtres. En utilisant la calyculine comme contrôle, l’activité rigidifiante d’antipaludiques de référence a été évaluée par microsphiltration. Les gamétocytes rigidifiés par la calyculine ont également été piégés dans des puces microfluidiques spléno-mimétiques. Leur clairance mécanique splénique a été confirmée dans un modèle murin adapté à la circulation transitoire des globules rouges humains parasités ou non. Conclusions: Un criblage par microsphiltration permet de sélectionner des molécules induisant la rétention mécanique splénique des gamétocytes pour bloquer la transmission du paludisme. Un post-criblage in vitro-in vivo permet de valider l’activité rigidifiante des actifs découverts par microsphiltration. / Background: Human-to-human transmission of Plasmodium falciparum malaria requires the development, within red blood cells (RBC), of sexual parasites termed gametocytes and their ingestion by Anopheles mosquito vector during a blood meal. Using filtration of RBC through microsphere layers (microsphiltration), we had shown that mature gametocytes present in the circulation of infective individuals are deformable. This deformability is a prerequisite for gametocytes circulation as they have (as any other uninfected RBC) to repeatedly cross narrow interendothelial slits in the human spleen. Objectives : This project aims at discovering compounds stiffening RBC harboring mature gametocytes, inducing their mechanical retention into the spleen, thereby removing them from the human bloodstream and interrupting malaria transmission. Methods & Results: Microsphiltration has been miniaturized to the microplate format, then coupled to high content imaging to quantify gametocyte retention in microsphere filters. Using calyculin as positive control, the gametocyte-stiffening activity of a panel of reference antimalarials was evaluated with the microsphiltration assay. Calyculin-stiffened mature gametocytes were held into spleno-mimetic microfluidic chips and were cleared from the circulation of macrophage depleted mice as rapidly as heat-stiffened control RBC, validating the outcomes of the microsphiltration assay. Conclusions: We have developped a microsphiltration assay compatible with screening. The screening/post-screening cascade has the potential to yield potent pharmacological agents blocking malaria transmission based on gametocytes deformability.

La découverte de nouveaux médicaments par le criblage biomoléculaire est au centre de la recherche pharmaceutique actuelle. La spectrométrie de masse, en tant que technique d’analyse fiable, reproductible, sensible, spécifique, compatible avec de nombreux types d’échantillons et permettant un débit d’analyse conséquent, trouve ainsi sa place dans les stratégies de recherche et développement de nouveaux médicaments. Le but de ce travail était de mettre en place et de valider une stratégie originale, impliquant la désorption/ionisation laser assistée par matrice couplée à la spectrométrie de masse (MALDI-MS) comme technique de détection, en vue du criblage de la liaison de composés à des cibles moléculaires applicable directement à des extraits de plantes. Le protocole que nous avons développé s’articule en trois étapes successives qui sont l’incubation des molécules à tester avec la cible moléculaire choisie (la tubuline ou la DHFR), l’élimination des composés non liés et enfin l’analyse par MALDI-TOFMS des composés liés. Notre démarche a fait l’objet d’une démarche de validation et les résultats pouvant être obtenus ont été discutés. Le débit pouvant être évalué à 60 échantillons en 1h50 à 3h30 soit de 18 à 32 échantillons à l’heure. Enfin, une démarche innovante nous a permis de prouver que notre approche pouvait être utile également en criblage secondaire. L’application de notre approche à des extraits bruts de plantes (Colchique d’Automne, Pervenche de Madagascar et Thé vert) à permis de mettre en évidence 20 molécules actives se liant à l’une ou l’autre des cibles moléculaires utilisées et d’évaluer l’affinité relative de l’une d’entre elles / Discovering new drugs by biomolecular screening is a central task of pharmaceutical research. Mass spectrometry, as a reliable, reproducible, sensitive and specific technique, compatible with a wide range of samples and offering an excellent throughput, shows its potential in different strategies of research and development. The aim of this work was to develop and validate a new strategy, involving matrix assisted laser desorption/ionization coupled to time of flight mass spectrometry (MALDI-TOFMS) to screen the ability of different compounds, including plant extracts, to bind to two biological targets (tubulin and DHFR). The protocol is therefore divided into three main steps : an incubation of the compounds to be tested with target, an elimination of all unbound compounds and the MALDI-TOFMS detection of target-bound compounds. Our protocol was validated and the results that can be obtained were discussed. The throughput offered by this technique was evaluated as 60 samples in 1h50 to 3h30, or 18 to 32 samples per hour. Finally, we developed a new approach to perform a secondary screening of active compounds. The protocol was applied to screen crude plants extracts (colchicum autumnale, catharanthus roseus and green tea) and allowed to find 20 tubulin-binding or DHFR-binding molecules, and the relative affinity of one of these was also evaluated

La barrière hémato-encéphalique (BHE), localisée au niveau des capillaires cérébraux, est une composante cruciale de l’unité neuro-glio-vasculaire car elle est responsable du maintien de l’homéostasie cérébrale. En limitant l’accès de nombreuses molécules au parenchyme cérébral, cette structure protège efficacement le système nerveux central (SNC) de composés toxiques, mais empêche ainsi de nombreux médicaments d’atteindre leur cible. La difficulté à étudier les caractéristiques et la perméabilité de la BHE in vivo a mené lesscientifiques à développer différents modèles in vitro de BHE. Notre modèle, qui consiste en une coculture decellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales, a été largement caractérisé : il exprime les caractéristiques de la BHE in vivo et s’est avéré utile dans l’étude des interactions cellulaires au sein de la BHEen conditions physiologiques et pathologiques. Le modèle de coculture initialement développé a été complété par l’addition de péricytes cérébraux afin de former des tricultures. En effet, les péricytes apparaissent aujourd’hui comme des acteurs importants de la BHE, mais sont souvent absents des modèles in vitro. Réunir les trois principales populations cellulaires formant la BHE (cellules endothéliales, cellules gliales et péricytes cérébraux) semble nécessaire afin de reproduire encore plus finement la configuration retrouvée in vivo, dans le but de comprendre les interactions cellulaires ayant cours au sein de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques. Sur la base de notre coculture originelle, deux tricultures ont été mises en place : alors que dans la première les péricytes sont cultivés à distance des cellules endothéliales, ces deux types cellulaires sont étroitement associés dans le second. Les deux modèles ont été caractérisés en terme de morphologie et d’expression de marqueurs endothéliaux, de perméabilité paracellulaire et d’expression de pompes d’efflux, démontrant qu’ils représentent tous deux des modèles pertinents de BHE. Ils permettront d’étudier la contribution des péricytes au phénotype de BHE et à sa réponse en conditions pathologiques, prenant en considération la composante glio-vasculaire. Dans la majorité des cas, l’utilisation des modèles in vitro de BHE au cours des processus de découverte de médicaments vise à prédire si de potentielles molécules thérapeutiques à visée cérébrale peuvent atteindre le SNC, permettant leur effet pharmacologique au niveau de leur cible centrale. Cependant, ces modèles neprésentent généralement pas un débit suffisant pour évaluer rapidement la perméabilité du grand nombre de composés générés par l’industrie pharmaceutique lors des étapes précoces de la découverte de médicaments. / The blood-brain barrier (BBB), located at the level of brain capillaries, is a crucial component of the neurogliovascular unit where it is responsible for brain homeostasis maintenance. By limiting the access of molecules to the brain parenchyma, it effectively protects the central nervous system (CNS) from harmful substances, but at the same time represents a major hurdle for potential neuropharmaceuticals to reach their central target. The difficulty to study BBB features and permeability in vivo led to the development of different in vitro BBB models. Our model, consisting of a coculture of brain capillary endothelial cells and glial cells, has been extensively characterized: it provides a robust model exhibiting in vivo BBB characteristics and hasproved useful in elucidating the cellular interactions at the level of the BBB in physiological and pathological conditions.The initially developed coculture model was completed by the addition of brain pericytes to design threecell culture models. Indeed, pericytes now appear as important actors of BBB formation and maintenance, but are often absent of in vitro BBB models. Gathering the three major cell populations forming the BBB – endothelial cells, glial cells and pericytes – seems important to more accurately reproduce in vivo configuration, with the aim of understanding cellular interactions in physiological and pathological conditions. On the basis of our original coculture model, two different three-cell culture models were designed: while pericytes were cultured distant from endothelial cells in the first model, both were closely associated in the second one. Both models were characterized in terms of endothelial marker expression and morphology, paracellular permeability and expression of efflux pumps, demonstrating that they provide reliable in vitro BBB models. They maybe useful in deciphering the contribution of pericytes to the BBB phenotype and in the response of BBB to injury, taking into account the gliovascular component. In most cases, the intended use of in vitro BBB models in drug discovery is to predict whether investigational drugs are likely to achieve relevant CNS exposure to elicit the desired pharmacological effect. However, in vitro BBB models usually do not allow high enough through put to efficiently evaluate the large number of compounds generated by pharmaceutical companies in early drug discovery stages.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le développement récent des prime editors (PE) a introduit un nouvel outil de modification génomique précis, qui permet un large éventail de modifications génétiques ciblées sans nécessité de modèles d'ADN donneur. L'édition primaire utilise la transcription inverse amorcée par la cible pour inscrire des séquences modifiées dans le génome. Cette approche permet l'installation de toutes les variantes de nucléotides uniques ainsi que de courtes insertions et délétions, offrant la méthode la plus polyvalente et précise d'édition génomique à ce jour. Cependant, les PE sont actuellement limités par une faible efficacité. Dans le cadre du premier chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode à haut débit, l'essai de séquençage Peptide Self-Editing sequencing assay (PepSEq), pour mesurer comment la fusion de 12 000 peptides de 85 acides aminés influence l'efficacité de PE. Nos résultats démontrent que l'intégration de la fusion de peptides augmente significativement les capacités de PE. Spécifiquement, nous avons identifié que les peptides améliorant l'édition, lorsqu'ils sont combinés de manière synergique, conduisent à des améliorations substantielles de l'édition dans une variété de lignées cellulaires et sur de nombreux sites cibles génomiques. Notamment, la configuration la plus efficace de double peptide-éditeur primaire a considérablement augmenté l'efficacité de PE. Le mécanisme sous-jacent de cette construction semble être une amélioration de l'efficacité de la traduction, les établissant comme des outils universellement applicables pour optimiser l'édition primaire. Dans le cadre du deuxième chapitre de cette thèse, nous avons décrit une approche de mutagenèse saturante utilisant les PE. Nous exploitons le système PE en conjonction avec une plateforme de criblage à haut débit qui incorpore un rapporteur intégré pour mesurer les résultats d'édition et leurs ramifications phénotypiques afin d'évaluer efficacement les variants associés aux maladies. Ensuite, nous appliquons cette stratégie dans un essai de captation de LDL fluorescent, pour une interprétation fonctionnelle précise de variants complexes, tels que ceux affectant la captation de LDL. Ce travail établit un nouveau référentiel pour l'évaluation fonctionnelle des variants génétiques en fournissant une compréhension plus nuancée de la pathogénicité des variants et de ses mécanismes structurels. / The recent development of prime editors (PE) has introduced a novel, precise genome editing tool that enables a broad array of targeted genetic modifications without the need for donor DNA templates. Prime editing uses target-primed reverse transcription to write altered sequences into the genome. This approach allows for the installation of all single-nucleotide variants as well as short insertions and deletions, offering the most versatile and precise method for genome editing to date. However, PEs are currently limited by low efficiency. As part of the first chapter of this thesis, we developed a high-throughput method, Peptide Self-Editing sequencing assay (PepSEq), to measure how fusion of 12,000 85-amino acid peptides influences prime editing efficiency. Our findings demonstrate that the integration of peptide fusion significantly augments prime editing capabilities. We identified that prime-enhancing peptides, when synergistically combined, lead to substantial improvements in prime editing across a variety of cell lines and at numerous genomic target sites. Notably, the most effective dual peptide-prime editor configuration substantially elevated prime editing efficiency. The underlying mechanism of this construct appears to be an enhancement of translation efficiency, establishing them as universally applicable tools for optimizing prime editing. As part of the second chapter of this thesis, we describe a saturation mutagenesis approach using PEs. We leverage the PE system in conjunction with a high-throughput screening platform that incorporates an integrated reporter for measuring editing outcomes and their phenotypic ramifications to efficiently evaluate disease-associated variants. Then, we apply this strategy in a fluorescent LDL uptake assay for precise functional interpretation of complex variants, such as those affecting LDL uptake. This work sets a new benchmark for the functional assessment of genetic variants by providing a more nuanced understanding of variant pathogenicity and its structural mechanisms.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / La leishmaniose est la maladie parasitaire la plus mortelle après le paludisme et il n'existe pas de vaccin chez l'homme. Des traitements sont actuellement disponibles, mais ils sont coûteux, présentent des effets secondaires non négligeables, sont peu spécifiques et des résistances émergent. Les principales molécules utilisées sont les dérivés d'antimoine pentavalent, l'amphotéricine B, la miltefosine et la paromomycine. Découvrir de nouvelles molécules, préciser le mécanisme d'action des molécules anti-leishmania connues et plus généralement étudier la résistance est donc essentiel dans la lutte contre la leishmaniose. Ceci permettra d'améliorer l'utilisation des drogues, de minimiser l'apparition de résistances et de préciser les mécanismes employés par les parasites. Dans la cadre de cette thèse, mes objectifs étaient de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules en développement ainsi que d'élucider les mécanismes de résistance et les cibles de médicaments connus ou en développement chez Leishmania. Dans le Chapitre 1 j'ai étudié le potentiel thérapeutique de trente-huit nouveaux composés thiophène. Une sélection de mutants couplée au séquençage haut débit (Sel-seq) criblée avec le candidat GC1-19, ayant une activité plus spécifique contre L. infantum JPCM5, a permis de mettre en évidence une conversion génique au niveau du locus ABCG2, impliquée dans la résistance. L'étude de cette molécule par clonage fonctionnel couplé au séquençage haut débit (Cos-seq) a démontré que la surexpression d'une tryparédoxine peroxydase est responsable d'une faible résistance au composé GC1-19. Les dérivés thiophènes sont donc des constructions d'intérêt pour le développement de médicaments contre la leishmaniose et les criblages Sel-seq et Cos-seq sont efficaces pour déterminer quels sont les gènes impliqués dans la résistance. Afin de mieux comprendre le métabolisme des folates, j'ai réalisé une mutagenèse chimique couplée au séquençage haut débit (Mut-seq) de L. major Friedlin avec une sélection au méthotrexate (MTX) (Chapitre 2). Vingt clones ayant une diminution de la susceptibilité au MTX de 2 à 400 fois ont été séquencés. Des mutations récurrentes ont été observés dans des gènes connus pour être impliqués dans le métabolisme des folates, dont les gènes FT1, DHFR-TS et PTR1, ou dans des gènes qui n'avaient jamais été associés au métabolisme des folates comme la L-galactolactone oxidase et une méthyltransférase. Pour la première fois, j'ai mis en évidence des mutations ponctuelles et des évènements de conversion géniques dans FT1, ainsi que des mutations ponctuelles dans DHFR-TS qui confèrent de la résistance au MTX. J'ai également démontré un effet dominant positif de deux mutations dans PTR1 ainsi que d'une mutation dans DHFR-TS. La sur-expression des versions sauvages de la L-galactolactone oxidase et d'une méthyltransférase dans les mutants appropriés les resensibilise au MTX. Le Mut-seq a également montré son efficacité lorsqu'il est couplé à une sélection avec du SbIII (Chapitre 4). Il a permis de mettre en évidence la kinase CDPK1, impliquée à la fois dans la résistance à la PMM et au SbIII. Son inactivation partielle confère de la résistance au SbIII et il reste à déterminer si les mutations ponctuelles retrouvées sont responsables de la résistance observée. Ces études montrent l'importance de l'utilisation de nouveaux criblages fonctionnels, ici le Mut-seq, pour découvrir de nouveaux gènes ayant un lien avec la résistance ainsi que de nouveaux mécanismes employés par le parasite au niveau de gènes déjà associés à la résistance. Le transporteur AdoMet et les transporteurs de folate FT1 et FT5, des transporteurs membranaires de la famille des FBTs localisés sur le chromosome 10, ont été caractérisé fonctionnellement. Dans le Chapitre 3, la totalité de ce locus ainsi qu'un FBT sur le chromosome 19 ont été étudié par délétion génique et expériences de localisation cellulaire. La délétion du locus du chromosome 10, contenant 7 gènes FBT, confère de la résistance à la sinefungine et au MTX. Six de ces protéines sont situées au niveau de la membrane plasmique, tout comme le FBT présent sur le chromosome 19. La délétion de ce dernier n'impacte pas la susceptibilité au MTX. Ensemble, ces travaux de recherche montrent l'efficacité et la complémentarité des criblages génomiques Sel-seq, Mut-seq et Cos-seq pour découvrir de nouveaux mécanismes de résistance et des cibles cellulaires. Ces criblages ont montré leur utilité aussi bien en réalisant la sélection avec un médicament utilisé contre la leishmaniose en thérapie, les antimoniés, mais aussi avec un médicament utilisé contre d'autres maladies, le MTX, ou encore lors de sélections avec des composés en développement comme les dérivés thiophènes. / Leishmaniasis is the deadliest parasitic disease after malaria and there is no vaccine for humans. Treatments are currently available, but they are expensive, have significant side effects, are not very specific, and resistance is emerging. The main molecules used are pentavalent antimony derivatives, amphotericin B, miltefosine and paromomycin. Discovering new molecules, clarifying the mechanism of action of known anti-leishmanial molecules and more generally studying resistance are therefore essential in the fight against leishmaniasis. This will make it possible to improve the use of drugs, reduce the appearance of resistance and clarify the mechanisms deployed by the parasites. As part of this thesis, my objectives were to determine the therapeutic potential of molecules in development as well as to elucidate the resistance mechanisms and targets of drugs known or in development against Leishmania. In Chapter 1, I studied the therapeutic potential of thirty-eight new thiophene compounds. A Sel-seq screen with the candidate GC1-19, being more active against L. infantum JPCM5, made it possible to highlight a gene conversion event at the ABCG2 locus, involved in resistance. The study of this molecule by Cos-seq screening demonstrated that the overexpression of a tryparedoxin peroxidase is responsible for low resistance to the compound GC1-19. Thiophene derivatives are therefore scaffolds of interest for the development of drugs against leishmaniasis and Sel-seq and Cos-seq screens are effective in determining which genes are involved in resistance. In order to better understand folate metabolism, I performed a Mut-seq screen coupled with methotrexate (MTX) selection in L. major Friedlin (Chapter 2). Twenty clones with a 2- to 400-fold decrease in MTX susceptibility were sequenced. Recurrent mutations have been observed in genes known to be involved in folate metabolism, including the FT1, DHFR-TS and PTR1 genes, or in genes previously not associated with folate metabolism such as L-galactolactone oxidase and a methyltransferase. For the first time, I demonstrated point mutations and gene conversion events in FT1, as well as point mutations in DHFR-TS that confer resistance to MTX. I also demonstrated a dominant positive effect of two mutations in PTR1 as well as one mutation in DHFR-TS. Overexpression of wild-type versions of L-galactolactone oxidase and a methyltransferase in the appropriate mutants resensitize them to MTX. Mut-seq has also shown its effectiveness when coupled with selection with SbIII (Chapter 4). It made it possible to highlight the CDPK1 kinase, involved in both resistance to paromomycin and SbIII. Its partial inactivation confers resistance to SbIII and it remains to be determined whether the point mutations found are responsible for the observed phenotype. These studies show the importance of using new functional screens, here Mut-seq, to discover new genes linked to resistance as well as new mechanisms used by the parasite at the level of genes already associated with resistance. The AdoMet transporter and the folate transporters FT1 and FT5, as well as other membrane transporters of the FBT family located on chromosome 10, were functionally characterized. In Chapter 3, this entire locus as well as an FBT on chromosome 19 were studied by gene deletion and cellular localization experiments. Deletion of the chromosome 10 locus, containing 7 FBT genes, confers resistance to sinefungin and MTX. Six of these proteins are located at the plasma membrane, similarly to the FBT gene product encoded on chromosome 19. Deletion of the latter does not impact susceptibility to MTX. Together, this research shows the effectiveness and complementarity of Sel-seq, Mut-seq and Cos-seq genomic screens to discover new resistance mechanisms and cellular targets. These screenings have shown their usefulness both by carrying out selection with a drug used against leishmaniasis in therapy, antimonials, but also with a drug used against other diseases, MTX, or even during selections with compounds in development such as thiophene derivatives.

La plupart des virus ont développé des mécanismes de résistance ou de suppression du système immunitaire pour parvenir à infecter durablement leur hôte. Ces mécanismes demeurent encore imparfaitement connus. Un domaine immunosuppresseur (IS) a été identifié au niveau de la région transmembranaire des protéines d’enveloppe des rétrovirus endogènes ou infectieux. Ce domaine hautement conservé a été décrit par exemple comme inhibant l’activation lymphocytaire. Dans le laboratoire, il a été caractérisé en particulier via des expériences de rejet de cellules tumorales in vivo, ce qui a permis de définir des mutations inactivatrices. Afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance des rétrovirus au système immunitaire, mes travaux de thèse ont porté sur l’identification de la ou des protéines capables d’interagir avec le domaine IS. Plusieurs approches cellulaires et moléculaires ont été développées, basées pour la plupart sur l’utilisation de sondes fluorescentes obtenues par synthèse chimique, constituées des domaines IS provenant de différents rétrovirus. Dans un premier temps, les cellules du système immunitaire qui lient les protéines virales ont été identifiées : les lymphocytes B et les cellules myéloïdes (monocytes, cellules dendritiques et macrophages). Dans un second temps, des expériences de co-immunoprécipitation et de chromatographie d’affinité couplées à la spectrométrie de masse ont été réalisées dans le but d’identifier sur ces cellules les protéines membranaires responsables de ces liaisons. Plusieurs agents de couplages chimiques ont été utilisés afin de maintenir les liaisons domaine IS - protéine de faibles affinités. En raison de résultats non-reproductibles obtenus au cours de ces expériences, des tests de liaison du domaine IS sur des cellules transfectées avec des banques d’ADNc, ou lors d’expériences de double hybride ont été réalisées. Ces deux approches ont permis d’identifier des protéines membranaires potentiellement impliquées dans la liaison du domaine IS : les protéines X1 et X2. Les co-transfections de vecteurs d’expression du domaine IS et de X2 ont mis en évidence des interactions protéiques au cours d’expériences de co-immunoprécipitation et de microscopie confocale, en particulier avec le domaine IS du rétrovirus HIV-1. Concernant X1, sa transfection induit la liaison cellulaire des domaines IS de HERV-W et MLV. En revanche, aucune interaction directe entre X1 et le domaine IS n’a pu être démontrée, notamment dans des expériences de co-immunoprécipitation et de microscopie confocale.La découverte des protéines membranaires qui interagissent avec le domaine IS demeure un enjeu critique pour la compréhension des voies de signalisation et de transcription qui permettent aux rétrovirus d’exercer leur effet sur le système immunitaire, l’objectif de ces travaux étant d’identifier à terme des nouvelles cibles thérapeutiques.En conclusion, même si des travaux complémentaires demeurent nécessaires, les protéines X1 et X2 pourraient contribuer à l’immunosuppression rétrovirale. / Most viruses have developed mechanisms of resistance or suppression of the immune system to achieve lasting infection of their host. These mechanisms are still imperfectly known. An immunosuppressive (IS) domain has been identified in the transmembrane region of envelope proteins of endogenous or infectious retroviruses. This highly conserved domain has been described, for example, as inhibiting lymphocyte activation. In the laboratory, it has been characterized by tumor cell rejection experiments in vivo, which has made it possible to define inactivating mutations. In order to better understand the mechanisms of resistance of retroviruses to the immune system, my thesis focused on the identification of the protein(s) interacting with the IS domain. Several cellular and molecular approaches have been developed, based for the most part on the use of fluorescent probes obtained by chemical synthesis, consisting of IS domains from different retroviruses. At first, immune system cells that bind viral proteins have been identified: B cells and myeloid cells (monocytes, dendritic cells and macrophages). In a second step, co-immunoprecipitation and affinity chromatography coupled to mass spectrometry were performed to identify on these cells the membrane proteins responsible for these bonds. Several chemical coupling agents have been used to prevent detachment of low affinity binding between proteins and the IS domain. Due to non-reproducible results obtained during these experiments, IS domain binding assays on cells transfected with cDNA libraries, or in double hybrid experiments were performed. These two approaches made it possible to identify membrane proteins potentially involved in the binding of the IS domain: the X1 and X2 proteins. Co-transfections of IS domain and X2 expression vectors demonstrated protein interactions in co-immunoprecipitation and confocal microscopy experiments, particularly with the IS domain of the HIV-1 retrovirus. Concerning X1, its transfection induces binding of the IS domains of HERV-W and MLV on cells membrane. On the other hand, no direct interaction between X1 and the IS domain could be demonstrated, especially in co-immunoprecipitation and confocal microscopy experiments.The discovery of membrane proteins that interact with the IS domain remains a critical issue for understanding the signaling and transcription pathways that allow retroviruses to exert their effect on the immune system, the aim of this work being to identify new therapeutic targets.In conclusion, although further work is still needed, the X1 and X2 proteins may contribute to retroviral immunosuppression.

Le criblage virtuel est une technique permettant d'extraire, d'une chimiothèque donnée, des produits actifs ou affin pour une cible ou un profil pharmacologique donné. Nous avons développé une méthodologie impliquant les données tridimensionnelles des protéines COX2 et PPARγ. Tout d'abord, nous avons comparé les différentes structures entre elles mais également les fonctions de scoring utilisées pour prédire l'affinité de molécules pour ces cibles. Par ailleurs, nous avons étudié des méthodes de consensus et d'analyse de données multivariée pour interpréter les fonctions de scoring. De plus, l'incorporation de techniques originales au protocole de docking-scoring a été testée. Plus précisément, un modèle pharmacophore, agissant comme filtre de composés indésirables, a été évalué pour diminuer les temps de calcul mais également pour améliorer le choix de la première pose. Par ailleurs, le couplage de la dynamique moléculaire, en amont du docking, nous a permis de prendre en compte la flexibilité du site actif. Nous avons montré l'utilité d'une telle stratégie pour améliorer les prédictions. Enfin, nous avons appliqué les méthodes de consensus et d'analyse de données multivariées (normalement employées pour les fonctions de scoring) aux données provenant des conformères issus de la dynamique moléculaire.

Actinobacillus pleuropneumoniae (App) est l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, une infection pulmonaire contagieuse chez les porcs. Parmi les nombreux mécanismes de virulence retrouvés chez les bactéries, la formation de biofilms joue souvent un rôle important dans la pathogenèse. Il a été récemment démontré qu’App avait la capacité de former des biofilms in vitro. Dans notre laboratoire, la formation de biofilms par App a été évaluée en microplaques dans différents milieux de culture. Nous avons démontré que la souche de référence de sérotype 1 est capable de former des biofilms. Le but de ce travail est d’identifier des gènes impliqués dans la biosynthèse et dans la régulation de l’expression des biofilms chez App. L’objectif de cette étude était de générer une banque de mutants d’App 4074NalR à l’aide du transposon mini-Tn10. Cette banque de 1200 mutants a été criblée à l’aide du modèle in vitro de formation de biofilms en microplaques et en tubes : 24 mutants démontrant une formation de biofilms modifiée par rapport à la souche mère App 4074NalR ont été sélectionnés et identifiés, nous permettant ainsi de localiser le site d’insertion du transposon. Une analyse a permis d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la biosynthèse et dans la régulation de l’expression des biofilms chez App. Notre criblage a permis d’identifier 16 gènes connus impliqués dans la formation de biofilms chez App (hns) ou chez d’autres pathogènes (potD2, ptsI, tig and rpmF) mais également de nouveaux gènes impliqués dans la formation de biofilm (APL_0049, APL_0637 and APL_1572). Une caractérisation plus poussée de ces gènes nous permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la formation de biofilm chez App. / A. pleuropneumoniae (App) is the causative agent of porcine pleuropneumonia, a contagious pulmonary infection in swine. Among the numerous virulence mechanisms found in bacteria, the formation of biofilms often plays an important role in pathogenesis. It has been recently demonstrated that App has the ability to form biofilms in vitro. In our laboratory, the formation of biofilms by App has been evaluated in microplates under different growth conditions. We showed that the reference strain of serotype 1 is capable of forming biofilms when cultured in a specific growth medium. The objective of this work is to identifiy genes implicated in the biosynthesis and regulation of biofilm formation in App. The objective of this study was to generate a mutant library of App using the mini-Tn10 transposon. A total of 1200 mutants has been screened with the help of in vitro models for biofilm formation which use microtiter plates or test tubes; 24 mutants exhibited modified biofilm formation when compared to the parental strain 4074NalR. The selection and identification of these mutants allowed the identification of the insertion site of the transposon. Analysis revealed novel genes implicated in biosynthesis and regulation of the biofilm formation in App. Our screen allowed the identification of genes already associated in biofilm formation of App (hns) or other pathogens (potD2, ptsI, tig and rpmF). Genes (APL_0049, APL_0637 and APL_1573) that have not yet been associated with biofilm formation were also identified. Further characterization of the genes mentioned above would permit a greater understanding of the mechanisms implicated in biofilm formation of App.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.