CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A criptococose à a infecÃÃo causada a partir da inalaÃÃo de leveduras do gÃnero Cryptococcus. A doenÃa costuma acometer mais freqÃentemente pacientes com alguma imunodepressÃo e evoluir de forma subaguda ou crÃnica. Tem predileÃÃo por sistema nervoso central, manifestando-se como meningite, mas tambÃm pode apresentar-se como doenÃa pulmonar ou de forma disseminada, com envolvimento de outros ÃrgÃos. A atividade proteolÃtica em leveduras do gÃnero Cryptococcus tem sido associada a sua patogenicidade. A atividade da enzima fosfolipase tambÃm se faz importante para este gÃnero, uma vez que està relacionada à nutriÃÃo e à capacidade invasiva do microrganismo. Outro mecanismo de virulÃncia de maior relevÃncia para a patogenicidade de Cryptococcus spp. à a cÃpsula polissacarÃdica presente em sua superfÃcie, responsÃvel principal pelo escape aos mecanismos de defesa do hospedeiro. Esta pesquisa teve como objetivo traÃar um perfil clÃnico, epidemiolÃgico e laboratorial dos pacientes com criptococose entre os anos de 1985 e 2010, bem como investigar os efeitos dos inibidores de protease Saquinavir, Darunavir, Ritonavir e Indinavir sobre o crescimento, espessura da cÃpsula, atividade de protease e expressÃo de fosfolipase em cepas de Cryptococcus neoformans isoladas de humanos. A comparaÃÃo entre grupo soropositivo para o HIV com grupo soronegativo mostrou que o primeiro apresenta maiores mÃdias de idade e maior freqÃÃncia de sexo masculino acometido; por outro lado, o grupo soropositivo demonstra menores proteinorraquia e celularidade no lÃquor, bem como menores valores de leucometria e plaquetometria em sangue perifÃrico. ApÃs a realizaÃÃo do teste de sensibilidade por microdiluiÃÃo em caldo, os fungos foram expostos a trÃs concentraÃÃes distintas dos fÃrmacos e avaliados com relaÃÃo à expressÃo das duas enzimas e espessura da cÃpsula. Os resultados mostraram inibiÃÃo significativa (p<0,05) da atividade de protease pelo menos na maior concentraÃÃo testada para todas as drogas, bem como estreitamento da cÃpsula em algumas combinaÃÃes de drogas e cepas. Por outro lado, quanto à atividade de fosfolipase, observou-se um aumento na expressÃo dessa enzima, especialmente nas concentraÃÃes mais elevadas das quatro drogas. Conclui-se, portanto, que apesar de estes antirretrovirais nÃo inibirem o crescimento de Cryptococcus neoformans, sÃo capazes de alterar mecanismos de virulÃncia destas leveduras.

Cryptococcus neoformans é uma levedura basidiomicética e patógeno humano oportunista, que causa infecção tanto em indivíduos imunocomprometidos quanto em imunocompetentes. A habilidade de sobrevivência e proliferação na temperatura do corpo humano é um fator de virulência essencial deste microrganismo. Análise da Diferença Representacional (RDA) foi aplicada com o intuito de delinear o perfil de expressão gênica durante desenvolvimento de C. neoformans a 37ºC ou 25ºC. Análises de 300 seqüências de cDNA permitiram a identificação de proteínas que podem ser críticas para processos de interação patógeno-hospedeiro. Produtos gênicos envolvidos em integridade da parede celular, resposta ao estresse, filamentação e metabolismo oxidativo são induzidos a 37ºC. Genes relacionados à silenciamento de cromatina e transporte de fosfolipídios possuem maior expressão em cultivo de C. neoformans a 25ºC. A metodologia de RDA mostrou-se viável no intuito de identificar genes regulados pela temperatura neste organismo, os quais podem representar alvos potenciais para estudos de inibição do desenvolvimento de C. neoformans no hospedeiro.

Resumo não disponível.

A expressão de determinantes de virulência por um patógeno é amplamente controlada pelo ambiente encontrado no hospedeiro. Neste contexto, a descrição de genes essenciais para o processo de interação patógeno-hospedeiro é fundamental para o melhor entendimento dos mecanismos de virulência utilizados durante a infecção. Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada que causa meningite em pacientes imunocomprometidos. A pandemia de AIDS contribuiu significativamente para o aumento das pesquisas científicas relacionadas à biologia de C. neoformans. Estudos funcionais de três genes deste patógeno, VCX1, GAT1, e GRASP, envolvidos, respectivamente, no transporte de cálcio (Ca2+), no metabolismo de nitrogênio e no processo de secreção não convencional são apresentados e discutidos na presente Tese. A habilidade de desevolvimento a 37°C é um fator de virulência essencial de C. neoformans, o qual é controlado por uma via de sinalização regulada por Ca2+ e calcineurina. O gene VCX1 de C. neoformans codifica um transportador de cálcio vacuolar, requerido para o desenvolvimento intracelular em macrófagos e para a virulência em camundongos. O fator de transcrição Gat1 de C. neoformans regula a expressão de genes sensíveis ao processo de repressão catabólica por nitrogênio (NCR). Genes envolvidos na biossíntese de ergosterol, metabolismo de ferro, integridade da parede celular e síntese da cápsula também são regulados por Gat1. Entretanto, este fator de transcrição não é necessário para a sobrevivência durante a interação com macrófagos e para a virulência em modelo de infecção experimental. Uma estratégia de virulência essencial de C. neoformans é a secreção de glicuronoxilomanana (GXM), um polissacarídeo capsular com propriedades imuno-modulatórias. Nossos resultados demonstram que GRASP (golgi reassembly and stacking protein) está envolvida na secreção de GXM, formação da cápsula e virulência em C. neoformans. É importante ressaltar que o transportador de cálcio Vcx1 e o fator de transcrição Gat1 também participam do processo de secreção deste polissacarídeo, o que representa a sua complexidade em C. neoformans. / The expression of pathogen virulence determinants is highly controlled by the host milieu. In this context, the description of crucial genes for hostpathogen interaction is fundamental to better understand the virulence mechanisms utilized during infection. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast, that causes a life-threatening meningoencephalitis in immunocompromised individuals. The AIDS pandemic has contributed significantly to the increase of scientific research concerning the C. neoformans biology. Functional analyses of three genes, VCX1, GAT1, and GRASP, related to calcium (Ca2+) transport, nitrogen metabolism and unconventional secretion in C. neoformans, respectively, are presented and discussed in this thesis. The ability to survive and proliferate at the human body temperature is an essential virulence attribute of this pathogen. This trait is controlled in part by the Ca2+- calcineurin pathway, which senses and utilizes cytosolic calcium for signaling. C. neoformans VCX1 gene encodes a vacuolar calcium exchanger, which is required for intracellular growth in macrophages and for full virulence in mice. The C. neoformans transcription factor Gat1 regulates the expression of Nitrogen Catabolite Repression (NCR) sensitive genes. Genes involved in ergosterol biosynthesis, iron uptake, cell wall organization and capsule biosynthesis are also Gat1-regulated in C. neoformans. However, Gat1 is not required for survival during macrophage infection and for virulence in a mice model of cryptococcosis. One essential virulence strategy of C. neoformans is the release of glucuronoxylomannan (GXM), a capsular immune-modulatory polysaccharide. Our results demonstrate that GRASP, a golgi reassembly and stacking protein, is involved in GXM secretion, capsule formation and virulence in C. neoformans. Interestingly, the vacuolar calcium exchanger Vcx1 and the transcription factor Gat1 are also involved in GXM secretion, which represents the complexity of this important process in C. neoformans.

A criptococose acomete pacientes imunocomprometidos, principalmente pacientes com a resposta imune mediada por células T debilitada, sendo portanto, suscetíveis a patógenos oportunistas. C. neoformans possui um repertório de fatores de virulência que permitem o estabelecimento da infecção e sua disseminação para o sistema nervoso central, causando meningoencefalite. O tratamento da criptococose é baseado apenas na utilização prolongada de antifúngicos e provoca muitos efeitos colaterais nos pacientes. Por estes motivos, novas terapias estão sendo abordadas, com o intuito de promover a ativação do sistema imune do hospedeiro para debelar a infecção. Para que tais terapias possam ser desenvolvidas se faz necessário identificar moléculas que estimulem a resposta imune celular. Proteínas de choque térmico de patógenos têm sido utilizadas como alvo no tratamento de muitas doenças infecciosas em seres humanos. Estas proteínas estimulam a resposta imune mediada por células T e apresentam resultados promissores em tratamentos contra infecções fúngicas. Da mesma forma, proteínas que fazem parte do sistema de defesa antioxidante, como as catalases, por exemplo, desempenham um papel importante no combate a radicais livres produzidos pelo hospedeiro e parecem ter outras funções no processo da infecção. O entendimento da biologia destas proteínas bem como a sua participação na interação com células do sistema imune do hospedeiro é fundamental para a validação da sua aplicabilidade no tratamento da criptococose. Nesse contexto, apresentamos aqui um estudo das funções biológicas de uma das proteínas de choque térmico (Hsp70) e de uma das enzimas envolvidas na detoxificação de espécies reativas de oxigênio (catalase 2) do fungo C. neoformans. Também foram avaliados os efeitos terapêuticos destas proteínas no tratamento da criptococose. Demonstramos que a proteína Hsp70 de C. neoformans está localizada na cápsula polissacarídica, sendo importante no processo de adesão da levedura a células epiteliais A549. Demonstramos também que Cn_rHsp70 co-localiza com o principal componente da cápsula polissacarídica a glucuronoxilomanana (GXM) na superfície de macrófagos. A Cn_rHsp70 quando em contato com células do fungo, diminui sua viabilidade celular e não altera o tamanho da cápsula, mas interfere na secreção de GXM. Em relação à catalase 2, foi demonstrado que a proteína é localizada na parede celular do fungo e possui atividade de degradação de peróxido de hidrogênio quando associada à superfície celular. Em ensaios de infecção experimental em animais imunizados com construções de DNA contendo as sequências de Hsp70 e catalase 2, nenhuma das proteínas conferiu proteção, mas ocorreu estímulo da resposta mediada por células Th1 e Th2. O mecanismo pelo qual estas proteínas estimulam o sistema imune ainda precisa ser elucidado. / Cryptococcus neoformans affects immunocompromised patients, especially patients with impaired T cell-mediated immune response, and therefore are susceptible to opportunistic pathogens. C. neoformans has a repertoire of virulence factors that allows the establishment and dissemination of the infection in the central nervous system, causing meningoencephalitis. The virulence factors of Cryptococcus has been subject of many studies that have showed the involvement of gene products in the infection process. However, the treatment of cryptococcal meningoencephalitis consists of antifungal therapy and displays many side effects. For these reasons, new therapies are being addressed, in order to promote the activation of the host immune system to overcome the infection. To develop these therapies, it is necessary to identify molecules that stimulate cell-mediated immune response. Heat shock proteins from many pathogens have been used as a target for the treatment of many humans infectious diseases. These proteins stimulate the T cell-mediated immune response and show promising results in treatment against fungal infections. Similarly, proteins from antioxidant system such as catalase for example, play an important role against free radicals produced by the host and appear to have other functions in the infection process. The understanding of these proteins biology and their involvement with host immune system cells is essential for the validation of its applicability in the treatment of cryptococcosis. In this context, we present here a study of the biological function of a heat shock protein (Hsp70) and one of the enzymes involved in detoxification of reactive oxygen species (catalase 2) of the fungus C. neoformans. We evaluated the therapeutic effects of these proteins in the treatment of cryptococcosis. We have demonstrated that the protein Hsp70 from C. neoformans is located in the polysaccharide capsule, and it is important in the adhesion process of the yeast to epithelial cells A549. Also demonstrated that Cn_rHsp70 co-localizes with the main component of the polysaccharide capsule, glucuronoxilomanana (GXM), on the surface of macrophages. When Cn_rHsp70 are in contact with fungal cells, the cellular viability decreased and does not change the capsule size however, interferes with the GXM secretion. Catalase 2 is deposited on the fungal cell wall and showed activity by hydrogen peroxide degradation. In vivo experiments using animals infected and treated with Hsp70 DNA vaccines and catalase 2, no protection were observed, but there are immune response mediated by Th1 and Th2 cells. The mechanism by which these proteins stimulate the immune system has yet to be elucidated.

Thesis (Ph.D.)--Boston University / PLEASE NOTE: Boston University Libraries did not receive an Authorization To Manage form for this thesis or dissertation. It is therefore not openly accessible, though it may be available by request. If you are the author or principal advisor of this work and would like to request open access for it, please contact us at open-help@bu.edu. Thank you. / The pathogenic yeast, Cryptococcus neoformans , is a leading cause of death among individuals with compromised T cell function. Mannoproteins (MP) are a set of functionally heterogeneous, heavily mannosylated glycoforms found in many fungal species including C. neoformans. Cryptococcal MP have been shown to stimulate cell-mediated immunity and pro-inflammatory cytokines, both vital for the clearance of this yeast. As it is unclear how MP elicit immunity, it was hypothesized that the extensive conjugated carbohydrate backbone present on MP plays an essential role in immune stimulation. Mannose receptors (MR), including the macrophage mannose receptor (MMR) and dendritic cell-specific ICAM-3-grabing nonintegrin (DC-SIGN), both present on antigen-presenting cells (APC) and known to recognize mannosylated pathogens were shown to bind MP. Deglycosylation of MP or MR blockade with competitive mannosylated ligands inhibited T-cell activation. The immunodominant APC responsible for immune stimulation was determined by incubating T cells with purified splenic dendritic cells (DC), B cells, and peritoneal macrophages. T cells responded to MP only in the presence of DC. In addition, whole splenocyte populations, but not DC-depleted splenocytes, stimulated MP-specific T cells. Comparing APC populations, only DC captured fluorescent MP in a MR-dependent process. The kinetics of MP capture appear to involve 2 processes, a major, rapid, saturable receptor-mediated process that is inhibited with mannan, and minor pinocytic uptake. Impressively, DC pulsed for short periods with MP were still able to functionally stimulate T cells in a MR-dependent mechanism. Confocal microscopy of MP in DC at early time points indicated co-localization with transferrin, MMR and DC-SIGN suggesting MP enters early endosomes via MR. Subsequently, MP enter degradative perinuclear compartments. In vivo, MP-immunization resulted in increased survival, as well as a decrease in organ fungal load in response to live C. neoformans challenge. This partial protection was dependent on T cells, and not B cells. Moreover, analysis of tissue pro-inflammatory cytokine levels showed an increase in tumor necrosis factor-α and interferon-γ in infected MP-immunized mice. Collectively, these studies begin to provide both a molecular and cellular basis for the immunogenicity of cryptococcal MP and support T cell vaccination strategies that target MR and DCs. / 2031-01-01

Cryptococcus neoformans is a basidiomycetous yeast capable of causing fatal meningoencephalitis in immunocompromised individuals. Naturally found worldwide in association with pigeon droppings, C. neoformans produces melanin pigments that play a protective role in both natural and physiological settings. Significant variation in the level of melanin production has been observed among natural populations of C. neoformans, although the factors behind this phenotypic variation remain unclear. In my project, I quantified the level of melanin production in 54 strains of C. neoformans and characterized the change in melanin response to three common stressors encountered by C. neoformans in natural and clinical environments: thermal, oxidative and nitrosative stresses. Using this data, I assessed the contribution of genetic factors, environmental factors and genotype-environmental interactions to the observed variance in melanin. The analysis revealed that over 50% of the variance in melanin was attributable to genetic differences among the strains. I identified three single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the LAC1 gene, which is essential for melanin synthesis, to be significantly associated with melanin production in thermal and oxidative stresses. One of the SNPs is predicted to cause an amino acid change (P182A/T) in a putative catalytic domain of the Lac1 protein. The genotype-environment interactions were also found to contribute to a significant proportion of the variance in phenotype. In the majority of tested stress conditions, environmental factors only contributed to a small amount of variance ranging from 5-15%. These results highlight the complex interplay of genetic, environmental and interaction factors that contribute to an observable phenotype. C. neoformans is a model fungal pathogen whose ability to produce melanin is a well-established virulence factor. The results from this project contribute to our understanding of the evolutionary trajectory and regulation of melanin production in C. neoformans. / Thesis / Master of Science (MSc) / The yeast, Cryptococcus neoformans, is naturally found worldwide in soil and pigeon droppings, and causes fatal infections in people with a weakened immune system. It produces dark melanin pigments that aid the yeast in neutralizing the immune response of the infected host. My project sought to characterize the variation in melanin levels found among natural populations of C. neoformans and to determine the factors that contribute to this variation. I identified genetic differences between the strains to be the biggest cause of variation in melanin levels. Changes in the LAC1 gene which is essential for melanin synthesis, were found to shape the melanin production significantly when the yeast is exposed to stressful conditions. Interactions between genes and the environment were also revealed to be a significant contribution to the observed differences in melanin levels. These results highlight the complex interplay of factors that shape the expression of observable traits.

Interações patógeno-hospedeiro geram alterações em diversos mecanismos, tanto no hospedeiro quanto no patógeno. Neste contexto, nas células do sistema imune do hospedeiro ocorre modulação para impedir o desenvolvimento de patógenos, culminado em sua eliminação, como no caso de infecções por Cryptococcus neoformans. Macrófagos alveolares constituem o primeiro tipo celular a responder à levedura, a qual, após a fagocitose, é capaz de se proliferar e disseminar no hospedeiro. Como mecanismo de defesa, células hospedeiras podem reduzir a concentração de micronutrientes essenciais para o patógeno, mecanismo conhecido por imunidade nutricional. Zinco (Zn) é o segundo metal de transição mais abundante e um micronutriente essencial para todos os organismos e, com isto, macrófagos podem responder a patógenos com redução dos níveis de Zn para auxiliar na eliminação de patógenos. A fim de avaliar se macrófagos respondem com privação de Zn a a fungos, a alteração na homeostase de Zn em macrófagos infectados por C. neoformans foi avaliada bem como a influência da ativação celular nesta resposta. Demonstramos que macrófagos respondem com privação de Zn à infecção por C. neoformans uma vez que ocorreu (i) diminuição nos níveis intracelulares de Zn livre em macrófagos infectados com a levedura viável, (ii) redução na expressão de importadores do metal, (iii) redução nos níveis de Zn livre em leveduras após exposição a macrófagos, (iv) aumento na proliferação no interior de macrófagos e diminuição da taxa de exocitose de C. neoformans em condições de disponibilidade de Zn. Tal modulação de Zn na resposta a C. neoformans foi exercida por alguns transportadores de Zn que respondem significativamente a condições de privação de Zn, principalmente os da família ZnT, e a privação de Zn como mecanismo de imunidade nutricional foi evidente em macrófagos ativados com IFN- e LPS. Macrófagos ativados com PMA não mostraram redução nos níveis intracelulares de Zn em reposta a C. neoformans ou modulação significativa nos níveis de transcritos de transportadores de Zn, como ZIP2 e ZnT7, em comparação a macrófagos ativados com IFN- e LPS. Além disso, de forma geral, macrófagos ativados continham maiores níveis intracelulares de Zn livre em comparação a macrófagos não ativados, sugerindo modulação do processo de ativação na homeostase de Zn em macrófagos J774.A1. / Host-pathogen interactions cause alterations on several mechanisms in both host and pathogen. In this context, host immune system cells are modulated to prevent pathogens growth, aiding in their elimination, as it occurs during Cryptococcus neoformans infections. Alveolar macrophages are the first cell type to respond to yeast infection. Once phagocytosed, cryptococcal cells are capable to proliferate and disseminate in the host. As a defense mechanism, host cells can reduce essential micronutrients concentration to the pathogen, a mechanism known as nutritional immunity. Zinc (Zn) is the second most abundant transition metal and an essential micronutrient for all organisms and thus, macrophages may respond to pathogens with reduced levels of Zn to aid pathogens elimination. In order to evaluate whether macrophages respond with Zn deprivation to fungi, alterations on Zn homeostasis in C. neoformans-infected macrophages was evaluated as well as the influence of cellular activation in this response. We demonstrate that macrophages respond with Zn deprivation to C. neoformans infection, as we could observe (i) a reduction of free intracellular Zn levels in macrophages infected with viable yeast, (ii) a reduced expression of Zn importers, (iii) a decreased free Zn concentration in yeasts exposed to macrophages, (iv) increased yeast proliferation within macrophages and decreased yeast exocytosis under Zn rich conditions. This Zn modulation in response to C. neoformans was exerted by some Zn transporters which respond significantly to Zn deprivation conditions, especially those of the ZnT family, and Zn deprivation as a nutritional immunity mechanism was evident in IFN- and LPS-activated macrophages. PMA-activated macrophages showed no reduction in intracellular Zn levels in response to C. neoformans or a significant modulation in Zn transporters transcript levels, such as ZIP2 and ZnT7, in comparision to IFN-- LPS-activated macrophages. In addition, in general, activated macrophages contained increased free intracellular Zn levels in comparision to non-activated macrophages, suggesting activation process modulation on Zn homeostasis in J774.A1 macrophages.

Thesis (MSc (Paravet. Studies))--University of Pretoria, 2007. / Includes bibliographical references. Also available as hard copy.

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Márcia de Souza Carvalho Melhem / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Regina Célia Candido / Resumo: Cryptococcus neoformans é levedura capsulada saprobiota que acomete principalmente indivíduos com o sistema imunológico comprometido. Seu habitat está relacionado com algumas espécies de árvores, madeira em decomposição e fezes de pássaros, em especial de pombos do gênero Columba livia. Nas grandes cidades estas aves vêm causando diversos problemas devido a sua multiplicação intensa. Desta maneira, medidas saneantes serão de grande auxílio para controlar a população desta levedura. Assim, este estudo teve como objetivo reidentificar 67 isolados de C. neoformans de fontes ambientais e caracterizá-los quanto ao seu genótipo e perfil de sensibilidade aos antifúngicos anfotericina B, cetoconazol, itraconazol e fluconazol, utilizando o método da difusão em ágar seguindo o documento M44A e determinando a concentação inibitória mínima frente a fluconazol pelo método M27-A2, ambos preconizados pelo CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute). Por outro lado, verificar o efeito antifúngico de extratos de plantas e sua atividade saneante em fezes de pombos comprovadamente contaminadas com isolado ATCC 90012 de C. neoformans. Todos isolados foram Mating Type α e tipo VNI. Pelo método de microdiluição, 21% (14/67) dos isolados ambientais apresentaram sensibilidade diminuída ao fluconazol com CIM de 16 μg/mL e mais de 50% (34/67) apresentaram CIM de 8 μg/mL.O extrato de Alibertia macrophylla apresentou efeito saneante com índice de eficiência de mais de 80% após 24 horas, na grande maioria dos isolados de C. neoformans. Este extrato foi estável... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cryptococcus neoformans is a saprobiote capsuled yeast that proliferates mainly in individuals who have the immunologic system compromised. It natural habitat is related to some species of trees, decaying wood and bird excrement, in special Columba livia doves. In big cities, these birds have caused many problems due to its intense proliferation and the cleaning measures will be of great help in controlling this yeast. The aim of this study was to re-identify 67 C. neoformans isolates and characterize them according to their genotype and susceptibility to antifungal amphotericin B, cetoconazole, itraconazole e fluconazole, using the method of agar diffusion following the M44A document and determining the minimum inhibitory concentration to fluconazole by method M27-A2, both recommended by the CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute). On the other hand, the verification of the effect of plant extracts e and their cleaning activity on dove excrement previously contaminated with isolate ATCC 90012 of C. neoformans. All the isolates were Mating Type α and VNI. For the microdilution method, 21% (14/67) of the environmental isolates showed decreased susceptibility to fluconazole with MIC of 16 mg/mL and more than 50% (34/67) had MICs of 8 mg/mL. The extract of Alibertia macrophylla presented clean effect with index of efficiency of 80% after 24 hours, in the great majority of C. neoformans isolates. This extract was stable to the light incidence, to the heat and variation of pH. Our results are of great use for the development and utilization of active natural compounds in the fight against C. neoformans from environmental and the study of other variables are necessary for the viability of its use as a domestic cleaner. / Doutor