A criptococose é uma doença invasiva capaz de apresentar-se de forma fatal podendo acometer pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos. Os agentes etiológicos Cryptococcus neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans apresentam distribuição cosmopolita, sendo as excretas de pombos o seu principal reservatório. Com o advento de terapias imunossupressoras e a pandemia de HIV, observou-se o aumento significativo de casos de pacientes com criptococose. Atualmente, o diagnóstico é baseado na apresentação clínica, na observação microscópica de líquor corado com tinta da Índia e/ou no isolamento em cultura. Neste trabalho desenvolveu-se um ELISA para detecção de anticorpos contra C. neoformans var. grubii em soro de pacientes utilizando como antígeno um extrato protéico total de uma linhagem clínica isolada de um paciente com criptococose (HC6). Foram testados através de ELISA 40 amostras de soros de pacientes com criptococose, sendo 67,5% positivos e 32,5% falsos negativos. Como controles negativos foram testados 82 amostras de soros de indivíduos hígidos, dos quais 26,82% apresentaram resultados positivos para os testes realizados. Para testar a reatividade cruzada, foram utilizadas 10 amostras de pacientes com histoplasmose (20% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com paracoccidioidomicose (66,6% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com candidose (13,3% de reatividade cruzada) e 7 amostras de pacientes com aspergilose (14,28% de reatividade cruzada). Visando solucionar o problema da reatividade cruzada, identificamos proteínas antigênicas de C. neoformans var. grubii por eletroforese bidimensional seguida por western blot e espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). Das 75 amostras analisadas, quatro foram identificadas: uma proteína hipotética, 2 isoformas de HSPs 70 e uma catalase-2. As proteínas identificadas apresentaram baixa similaridade com ortólogas de outros fungos patogênicos, sendo, dessa forma, possíveis alvos para a padronização do ELISA e diagnóstico da criptococose. / Cryptococosis is an invasive and potentially fatal disease. Cryptococcus neoformans is the etiological agent, which can affect both immunocompromised and immunocompetent individuals. C. neoformans var. grubii and C. neoformans var. neoformans are cosmopolitan and their major natural reservoir is the excrement from pigeons. With the advent of immunosupressor therapies and the pandemic HIV infection, a significant augmentation of cryptococosis cases in humans was observed. Nowadays cryptococcosis diagnosis is based on the clinical presentation, India ink sample preparation methods and/or in vitro culture isolation. In this work we had developed an ELISA to detect antibodies against C. neoformans var. grubii in serum from patients with cryptococcosis using as antigens a whole cell protein extract from a clinical cell line isolate (HC6). Sera from 40 patients with cryptococcosis were tested by ELISA. From these, 67.5% were positives and 32.5% were false-negatives. As a negative control 82 samples from health subjects were also tested, from these 26.82% were positives. To test cross-reactivity, samples from 10 patients with histoplasmosis (20% cross-reactivity), 9 from patients with paracoccidioidomicosis (66.6% cross-reactivity), 9 from patients with candidosis (13.3% cross-reactivity) and 7 from patients with aspergilosis (14.28% cross-reactivity) were tested. To solve the cross-reactivity problem, we searched immunogenic proteins which were specific to C. neoformans var. grubii applying two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE-PAGE) followed by western blot and mass spectrometry (MALDI-TOF MS). From the 75 sample analyzed, four were identified: one as a hypothetic protein, two HSPs 70 isoforms and the protein catalase 2. These proteins showed low similarity with orthologues from other pathogenic fungi, and are potential targets to further of the standardizing cryptococosis diagnosis by ELISA.

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras encapsuladas e agentes etiológicos da criptococose. Estes microrganismos são patogénos intracelulares facultativos os quais interagem com macrófagos do hospedeiro durante o processo de infecção. C. neoformans é capaz de se replicar no interior de células fagocíticas utilizando uma estratégia única que envolve permeabilização do fagolisossoma e produção de polissacarídeos. No presente trabalho, a metodolologia da Análise da Diferença Representacional (RDA) foi aplicada para identificar genes diferencialmente expressos por C. neoformans e C. gattii durante o desenvolvimento intracelular em macrófagos peritoneais de ratos. C. neoformans internalizados por macrófagos expressaram genes relacionados ao tráfego vesicular, transporte de membrana, atividade de chaperona, regulação da meiose, metabolismo de monossacarídeo e resposta ao estresse. Em C. gattii, foram induzidos transcritos relacionados à respiração aeróbica, endocitose, tráfego vesicular, metabolismo de monossacarídeo e nitrogênio, sinalização celular e resposta ao estresse. Nossos resultados revelaram novos genes envolvidos no parasitismo intracelular de C. neoformans e C. gattii.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-02-01T16:05:48Z No. of bitstreams: 1 2016_JorgeAntonioChamonJúnior.pdf: 2367299 bytes, checksum: 42dea312014c0ea857854aba2a361a7e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-27T17:39:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JorgeAntonioChamonJúnior.pdf: 2367299 bytes, checksum: 42dea312014c0ea857854aba2a361a7e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-27T17:39:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JorgeAntonioChamonJúnior.pdf: 2367299 bytes, checksum: 42dea312014c0ea857854aba2a361a7e (MD5) / Introdução: A criptococose vem assumindo um papel relevante dentre as infecções fúngicas oportunistas por ser considerada uma das micoses mais comuns nos indivíduos imunodeprimidos apresentando elevada morbidade e mortalidade, com cerca de 650.000 mortes por ano em todo mundo. Esta doença é causada pelos fungos leveduriformes encapsulados Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. O C. neoformans acomete pacientes imunocomprometidos, já o C. gattii, vem se tornando um grave problema de saúde pública, pois é capaz de acometer pacientes imunocompetentes. Fato que promove ainda mais preocupação é o fato de existir escassos medicamentos antifúngicos disponíveis, que possuem elevada toxicidade e já apresentam resistência por mecanismos pouco elucidados. Diante destas circunstâncias, estratégias farmacológicas vem sendo estudadas e desenvolvidas, inclusive empregando extratos de plantas com potencial terapêutico. Neste sentido, o estudo do efeito antifúngico do extrato aquoso das folhas de Eugenia dysenterica (Mart.) DC sobre isolados de Cryptococcus spp foi realizado. Objetivos: Identificar isolados clínicos de Cryptococcus spp. por métodos clássicos, bioquímicos, manuais e automatizados, moleculares e por espectrometria de massa, visando caracterizá-los fenotipicamente e genotipicamente, e avaliar o perfil de susceptibilidade aos agentes antifúngicos convencionais e ao extrato aquoso bruto de Eugenia dysenterica. Materiais e métodos: Neste estudo, 20 isolados clínicos contendo Cryptococcus spp. foram submetidos a identificações microscópicas (tinta nanquim e hidróxido de potássio), provas bioquímicas manuais (assimilação de glicina, produção de urease e melanina), provas bioquímicas automatizadas, PCR-RFLP e espectometria de massa (MALDI-TOF). Além disso, foi realizado teste de suscetibilidade a antifúngicos convencionais e microdiluição em placa para o extrato aquoso de folhas de E. dysenterica. Resultados: A partir da diversas metodologias empregadas obtivemos a caracterização das espécies (12 C. neoformans e 8 C. gattii) e variantes (12 VNI e 8 VGII), assim como a presença de resistência aos antifúngicos usuais (3 casos de resistência a Anfotericina B). Além da demonstração do efeito antifúngico do extrato de E. dysenterica. Conclusão: Neste estudo, visualizou-se o predomínio da espécie C. neoformans VNI frente a C. gattii VGII, em consonância com os estudos já realizados e as informações epidemiológicas existentes, e que esta caracterização é fundamental para fins terapêuticos e de saúde pública, diante do quadro de limitação de tratamento e iminentes casos de resistências a antifúngicos. Além disso, fornece subsídios para que o extrato aquoso de E. dysenterica seja considerado a um forte canditado na elaboração de novos fármacos antifúngicos. / Introduction: Cryptococcosis has been playing an important role among fungal opportunistic infections, being considered one of the most common mycoses in immunocompromised individuals presenting high morbidity and mortality, with around 650,000 deaths per year worldwide. This disease is caused by the encapsulated yeast Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. C. neoformans affects immunocompromised patients, and C. gattii has become a serious public health problem since it is capable of injuring immunocompetent patients. A fact that promotes even more concern is the fact that there are few antifungal drugs available, which present high toxicity and are already resistant by poorly elucidated mechanisms. Facing these circumstances, pharmacological strategies have been studied and developed, including using plants with therapeutic potential in their extracts. In this sense, the study of the antifungal effect of the aqueous extracts of Eugenia dysenterica (Mart.) DC leaves on Cryptococcus spp isolates was performed. Objectives: To identify clinical isolates of Cryptococcus spp. by classical, biochemical manual and automated, molecular and mass spectrometry methods, aiming to characterize them phenotypically and genotypically. Added to this is the assessment of the susceptibility profile to the conventional antifungal agents and to the crude aqueous extract of Eugenia dysenterica. Materials and methods: In this study, 20 clinical isolates containing Cryptococcus spp. (Glycine assimilation, urease and melanin production), automated biochemical tests, PCR-RFLP and mass spectrometry (MALDI-TOF) were performed. In addition, the antifungal susceptibility test and plaque microdilution for the aqueous extract of leaves of E. dysenterica were performed. Results: Based on the different methodologies used, we characterized the species (12 C. neoformans and 8 C. gattii) and variants (12 VNI and 8 VGII), as well as the presence of resistance to the usual antifungal agents (3 cases of resistance to Amphotericin B). In addition to demonstrating the antifungal effect of E. dysenterica extract. Conclusion: In this study, the prevalence of the C. neoformans VNI species in relation to C. gattii VGII was observed, in agreement with the studies already carried out and the existing epidemiological information, and that this characterization is fundamental for therapeutic and public health purposes, In view of the limitation of treatment and imminent cases of antifungal resistance. In addition, it provides subsidies for the aqueous extract of E. dysenterica to be considered a strong candidate in the development of new antifungal drugs.

A criptococose é uma doença fúngica invasiva causada majoritariamente pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que a infecção causada por C. gattii desenvolve mais frequentemente criptococomas pulmonares, enquanto que C. neoformans estabelece principalmente quadros de meningoencefalite. Embora ocorra essa associação, o mecanismo de disseminação dessas espécies não está completamente elucidado, instigando a utilização de diferentes abordagens na caracterização da infecção. O desenvolvimento de microrganismos bioluminescentes tem permitido o monitoramento em tempo real da infecção em modelos animais. No presente trabalho, diferentes estratégias foram utilizadas para a construção de linhagens de C. neoformans e de C. gattii expressando o gene repórter luciferase Renilla, sem sucesso. Paralelamente, em uma segunda abordagem, bactérias bioluminescentes (BL) foram isoladas de amostras de água marinha coletadas nas adjacências da zona estuarina do rio Tramandaí, com o objetivo de selecionar o cassete lux (CDABE) para a utilização como gene repórter. Todos os isolados apresentaram luminescência a 28°C, mas, quando incubados a 37°C, somente o isolado BL6 permaneceu com uma atividade luminescente consideravelmente reduzida. Portanto as bactérias bioluminescentes pertencentes aos gêneros Vibrio, Photobacterium e Enterovibrio isoladas do rio Tramandaí não apresentaram níveis de emissão de luminescência adequados à temperatura fisiológica humana para a utilização do cassete lux como gene repórter para monitoramento de infecções in vivo. / Cryptococcosis is an invasive fungal disease caused mainly by pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. Recent epidemiological studies have suggested that infection with C. gattii develops more frequently pulmonary cryptococcomas, while C. neoformans establishes mainly neurological damages. Although exists this association, the mechanism of dissemination of these species is not completely understood, instigating the use of different approaches for the characterization of the infections. Alternatively, the development of bioluminescent organisms has allowed the real-time monitoring of infection in animal models. In this study, different strategies were used to construct strains of C. neoformans and C. gattii expressing Renilla luciferase reporter gene without success. In a second approach, bioluminescent bacteria (BL) were isolated from seawater samples collected in the vicinity of the river Tramandaí estuarine zone, in order to select the lux cassette (CDABE) for use as a reporter gene. All isolates showed luminescence at 28°C, but when incubated at 37°C, only the isolate BL6 remained with a considerably reduced luminescent activity. Thus, bioluminescent bacteria belonging to the genera Vibrio, Photobacterium and Enterovibrio isolated from Tramandaí river estuary zone presented unsuitable luminescence emission levels at human physiological temperature, preventing the use of lux cassette as a reporter gene in experiments to monitoring cryptococcosis infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-14T21:29:48Z No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-15T13:24:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T13:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / As proteínas Velvet compreendem quatro membros altamente conservados entre ascomicetos e basidiomicetos, os quais compartilham o domínio Velvet. Eles regulam diferentes vias de sinalização em resposta a estímulos ambientais e também coordenam o metabolismo secundário e diferenciação assexual e sexual em diferentes espécies de fungos. Recentemente, as proteínas Velvet foram implicadas na virulência de alguns agentes patogênicos de plantas. Buscou-se avaliar o papel das proteínas Velvet no fungo patogênico humano Cryptococcus neoformans, causador da criptococose, importante micose sistêmica e a terceira doença mais prevalente em indivíduos portadores do vírus HIV. Entre as micoses sistêmicas, ela é classificada como tendo a maior incidência em pacientes imunocomprometidos. A infecção por C.neoformans ocorre pela inalação de células infecciosas e é considerada uma infecção pulmonar primária, o que pode levar a uma infecção disseminada e meningoencefalite. O objetivo geral do trabalho foi avaliar o papel do gene VELB na patogenidade e morfogênese de C. neoformans. O primeiro passo realizado no estudo foi a deleção do gene VELB em Cryptococcus neoformans. O cassete foi transformado em células leveduriformes haploides de C. neoformans diretamente através de biobalística. Confirmou-se a deleção por PCR e Southern Blot. Após confirmação, os transformantes foram submetidos a diferentes condições de crescimento para determinação de seus fenótipos e virulência. Foram realizados testes de estresse osmótico (NaCl), estresse na parede celular (CongoRed, SDS, cafeína) e estresse oxidativo com peróxido de hidrogênio. Foram avaliados os fatores de virulência de C. neoformans como fosfolipase, urease, melanina e cápsula. Os testes fenotípicos não apresentaram alterações entre a linhagem e mutante indicando que o gene VELB parece não ter nenhum envolvimento em virulência e resposta a agentes estressores. Para avaliação da capacidade de acasalamento foram realizados co-cultivos no escuro em diferentes meios de cultura (Filament, SLAD e MS), além disto foi testada a capacidade de fusão dos mutantes. Estes testes demonstraram que a deleção de VELB bloqueia a produção de hifas no acasalamento entre mutantes e que estes apresentam também defeito no processo de fusão celular. Estes resultados gerados neste trabalho sobre o papel de VELB corroboram os dados anteriormente obtidos pelo nosso grupo de pesquisa de que os membros da família velvet estão diretamente envolvidos na regulação do ciclo sexual de C. neoformans. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Velvet proteins consist of four highly conserved members in ascomycetes and basidiomycetes, sharing the Velvet domain. They regulate different signaling ways in response to environmental stimulation and also coordinate secondary metabolism and asexual to sexual differentiation in different species of fungi. Recently, Velvet proteins have been implicated in the virulence of some pathogenic agents of plants. It was evaluated the role of Velvet proteins in the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans that causes cryptococcosis, an important systemic mycosis and the third most prevalent disease in HIV positive individuals. Compared to other systemic mycoses, it is classified as having the highest incidence in immunocompromised patients. C.neoformans infection is by inhalation of infectious cells and is considered a primary pulmonary infection, which can lead to widespread infection and meningoencephalitis. The overall objective of this study was to evaluate the role of the VELB gene in morphogenesis and pathogenicity of C. neoformans. The first step was performed at study deletion of the gene VELB in Cryptococcus neoformans. The cassette was transformed into haploid yeast cells of C. neoformans directly through biolistic. The deletion was confirmed by PCR and Southern blot. After confirmation, the transformants were submitted to different growth conditions to determine their phenotypes and virulence. Tests of osmotic stress (KCl, NaCl, sorbitol), stress in the cell wall (Congo Red, Calcofluor, SDS, caffeine) and oxidative stress with hydrogen peroxide were performed. Virulence factors of C. neoformans as phospholipase, urease, melanin and capsule were evaluated. Phenotypic tests showed no change between the strain and mutant indicating that the VELB gene seems to have no involvement in virulence and response to stressors. To evaluate the ability of mating co-cultures were performed in the dark in different culture media (Filament, SLAD and MS), in addition it was tested the ability of fusion of mutants. These tests showed that the deletion of VELB blocks the production of hyphae in mating and that these mutants also exhibit defective cell fusion process. These results generated in this paper about the VELB function corroborate data previously 13 obtained by our research group that the members of the velvet family are directly involved in the regulation of the sexual cycle of C. neoformans.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-17T20:16:57Z No. of bitstreams: 1 2014_ThaísAmandadePinhoSilva.pdf: 4485973 bytes, checksum: 3c18aced7d776760ef9a8f71cdac3533 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-17T20:20:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThaísAmandadePinhoSilva.pdf: 4485973 bytes, checksum: 3c18aced7d776760ef9a8f71cdac3533 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-17T20:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThaísAmandadePinhoSilva.pdf: 4485973 bytes, checksum: 3c18aced7d776760ef9a8f71cdac3533 (MD5) / Granulócitos contribuem de forma significativa na resposta imunológica contra infecções. Dentre eles, os mais presentes na circulação sanguínea são os neutrófilos e eosinófilos. Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica adquirida pela inalação e pode causar desde pneumonia até meningoencefalite em indivíduos imunocomprometidos. Alguns fatores de virulência do fungo tornam possível a infecção, dentre eles o principal é a presença de uma cápsula polissacarídica. Durante a infecção, ocorre um recrutamento de neutrófilos, eosinófilos, macrófagos entre outras células. Esses fagócitos podem matar ou inibir o crescimento do fungo ao ativarem uma resposta inflamatória. Um dos marcadores de ativação celular durante a resposta inflamatória são os corpúsculos lipídicos (CLs). Estas organelas multifuncionais, são locais de síntese de importantes mediadores inflamatórios. Durante a resposta inflamatória, ocorre uma importante produção de eicosanóides, como os leucotrienos e as prostaglandinas. Dentre as prostaglandinas, a prostaglandina D2 é um dos principais mediadores lipídicos que medeia a resposta inflamatória de granulócitos. assim, o objetivo desse trabalho foi investigar os mecanismos inflamatórios envolvidos na ativação do metabolismo lipídico de granulócitos por C. neoformans, analisando o papel da cápsula nesse processo. Demonstramos que C. neoformans acapsular Cap67 induz o aumento do tamanho e granulosidade celular em granulócitos. Essa modificação não foi causada pelos componentes da cápsula ou lipídeos totais do fungo. A infecção por Cap67 também induziu o aumento de CLs, porém os lipídeos do fungo contribuíram para este processo. Esse aumento de CLs foi dependente da enzima COX (mediadora de prostaglandinas) e independente de 5-LO e 15-LO (mediadoras de leucotrienos). A infecção pelo sorotipo D B3501 induziu um aumento da expressão de PGD2 em granulócitos o qual foi revertido pelo mutante acapsular Cap67. A expressão do receptor nuclear PPARgamma foi aumentada e o fator de transcrição NFkB não foi translocado durante a infecção por Cap67. Os receptores de PGD2, DP1 e CRTH2, não interferem na biogênese de CLs, mas modulam a capacidade fagocítica e de eliminação dos fungos pelos granulócitos. Todos esses resultados mostram a importância da via das PG na biogênese de CL, na fagocitose e na eliminação de C. neoformans por granulócitos. Nesse trabalho foi proposta uma nova via de escape do patógeno C. neoformans. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Granulocytes significantly contribute to immune responses against infections. Among ganulocytes, the most common cell type in bloodstream is neutrophil and eosinophil. Cryptococcus neoformans is a pathogenic yeast acquired by inhalation and may cause pneumonia and even meningoencephalitis in immunocompromised individuals. Some fungal virulence factors, such as presence of polysaccharide capsule, make infection more feasible to occur. During infection, occurs a recruitment of neutrophils, eosinophils, and macrophages, among other cells. These phagocytes may kill or inhibit the fungal growth, activating an inflammatory response. One of the markers of cellular activation during the inflammatory response is an organelle called lipid body (LB). These multifunctional organelles are sites of important inflammatory mediators synthesis. During an inflammatory response, there is substantial production of eicosanoids such as leukotrienes and prostaglandins. Among the prostaglandins, Prostaglandin D2 is the key lipid mediator that mediates inflammatory response of granulocytes. Thus, the aim of this study was to investigate the inflammatory mechanisms involved in activation of lipid metabolism of granulocytes caused by C. neoformans infection, analyzing the role of the fungal capsule in this process. Here we demonstrate that C. neoformans acapsular Cap67 induced the increase of the cell size and granulosity in granulocytes. The fungal lipid extract or capsule components did not cause this modification. The infection by Cap67 also induced the increase of LBs, however the fungal total lipids may contribute to this process. This increase of LBs was dependent on COX (prostaglandin mediator) and independent on 5-LO and 15-LO (leukotriene mediator). The infection with serotype D B3501 induced an increased expression of PGD2 in granulocytes, which was reversed by the acapsular mutante Cap67. The expression of the nuclear receptor PPARgamma increased and the transcription factor NFkB did not translocated during the infection by Cap67. The PGD2 receptors, DP1 and CRTH2, did not interfere in the biogenesis of LBs, but modulated the phagocytic capacity and killing of fungi by granulocytes. All these results show the importance of the PG signaling pathway in the biogenesis of LBs, the phagocytosis and the killing of C. neoformans by granulocytes. In this work we have proposed a new escape pathway for the pathogen C. neoformans.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Tendo em vista que algumas propriedades terapÃuticas da curcumina jà sÃo bem descritas, dessa forma o presente estudo aponta para um efeito antifÃngico da curcumina frente a cepas de leveduras patogÃnicas resistentes ao fluconazol, cepas de Candida spp. e Cryptococcus neoformans. Todas as cepas estudadas foram inibidas pela curcumina, com diferentes graus de inibiÃÃo entre as espÃcies com CIMs variando entre 8-64 μg/mL. ApÃs a exposiÃÃo das cepas de C. albicans a curcumina, foi observado uma diminuiÃÃo no nÃmero de cÃlulas viÃveis, indicando assim danos Ãs membranas celulares, com possÃvel comprometimento de suas funÃÃes. Os nossos resultados revelaram que apÃs o tratamento com a curcumina, constatamos uma intensificaÃÃo na marcaÃÃo com PI (Iodeto de propÃdio), indicando alteraÃÃes nas membranas celulares. No presente trabalho, a funÃÃo mitocondrial das cÃlulas de C. albicans parece ter sido afetada apÃs exposiÃÃo à curcumina. O colapso no Δψm (Potencial Transmembrana Mitocondrial) pode conduzir a aberturas de poros transientes nas membranas mitocondriais. Em relaÃÃo aos diversos mecanismos de aÃÃo descritos para a curcumina, existem evidÃncias de que o DNA à um dos alvos celulares desta molÃcula. Nossos dados sugerem que apÃs a exposiÃÃo à curcumina, as cÃlulas de C. albicans, apresentaram quebras totais nas cadeias de DNA. Em conclusÃo, o composto curcumina apresenta atividade antifÃngica in vitro contra cepas de Candida spp. e Cryptococcus neo-formans resistentes ao fluconazol. AlÃm de promover danos ao DNA e externalizaÃÃo da fosfatidilserina, o respectivo composto parecem atuar em sÃtios especÃficos prÃximos a mitocÃndria das cÃlulas de C. albicans, levando à morte por apoptose. / Considering that some therapeutic properties of curcumin are well described, so the present study points to an antifungal effect of curcumin against strains of pathogenic yeasts resistant to fluconazole, strains of Candida spp. and Cryptococcus neoformans. All strains studied were inhibited by curcumin with different degrees of inhibition among species with MICs ranging from 8-64 mg / ml. After exposure strains of C. albicans, curcumin a decrease in the number of viable cells was observed, thus indicating damage to cell membranes, with possible compromise of their functions. Our results showed that after treatment with curcumin, found in more intense staining with PI (Propidium iodide), indicating changes in cell membranes. In this study, the mitochondrial function of C. albicans cells appears to have been affected after exposure to curcumin. The collapse in Δψm (Mitochondrial Transmembrane Potential) can lead to openings of transient pores in the mitochondrial membranes. In relation to the different mechanisms of action described for curcumin, there is evidence that DNA is one of the celular targets of this molecule. Our data suggest that after exposure to curcumin, cells of C. albicans showed total breaks in DNA strands. In conclusion, the compound curcumin has antifungal activity in vitro against strains of Candida spp. and Cryptococcus neoformans resistant to fluconazole. In addition to promoting DNA damage and externalization of phosphatidylserine, the respective compound seem to act at specific sites near mitochondria of C. albicans cells, leading to death by apoptosis.

A criptococose é uma doença fúngica invasiva causada majoritariamente pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que a infecção causada por C. gattii desenvolve mais frequentemente criptococomas pulmonares, enquanto que C. neoformans estabelece principalmente quadros de meningoencefalite. Embora ocorra essa associação, o mecanismo de disseminação dessas espécies não está completamente elucidado, instigando a utilização de diferentes abordagens na caracterização da infecção. O desenvolvimento de microrganismos bioluminescentes tem permitido o monitoramento em tempo real da infecção em modelos animais. No presente trabalho, diferentes estratégias foram utilizadas para a construção de linhagens de C. neoformans e de C. gattii expressando o gene repórter luciferase Renilla, sem sucesso. Paralelamente, em uma segunda abordagem, bactérias bioluminescentes (BL) foram isoladas de amostras de água marinha coletadas nas adjacências da zona estuarina do rio Tramandaí, com o objetivo de selecionar o cassete lux (CDABE) para a utilização como gene repórter. Todos os isolados apresentaram luminescência a 28°C, mas, quando incubados a 37°C, somente o isolado BL6 permaneceu com uma atividade luminescente consideravelmente reduzida. Portanto as bactérias bioluminescentes pertencentes aos gêneros Vibrio, Photobacterium e Enterovibrio isoladas do rio Tramandaí não apresentaram níveis de emissão de luminescência adequados à temperatura fisiológica humana para a utilização do cassete lux como gene repórter para monitoramento de infecções in vivo. / Cryptococcosis is an invasive fungal disease caused mainly by pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. Recent epidemiological studies have suggested that infection with C. gattii develops more frequently pulmonary cryptococcomas, while C. neoformans establishes mainly neurological damages. Although exists this association, the mechanism of dissemination of these species is not completely understood, instigating the use of different approaches for the characterization of the infections. Alternatively, the development of bioluminescent organisms has allowed the real-time monitoring of infection in animal models. In this study, different strategies were used to construct strains of C. neoformans and C. gattii expressing Renilla luciferase reporter gene without success. In a second approach, bioluminescent bacteria (BL) were isolated from seawater samples collected in the vicinity of the river Tramandaí estuarine zone, in order to select the lux cassette (CDABE) for use as a reporter gene. All isolates showed luminescence at 28°C, but when incubated at 37°C, only the isolate BL6 remained with a considerably reduced luminescent activity. Thus, bioluminescent bacteria belonging to the genera Vibrio, Photobacterium and Enterovibrio isolated from Tramandaí river estuary zone presented unsuitable luminescence emission levels at human physiological temperature, preventing the use of lux cassette as a reporter gene in experiments to monitoring cryptococcosis infection.

A criptococose é uma doença invasiva capaz de apresentar-se de forma fatal podendo acometer pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos. Os agentes etiológicos Cryptococcus neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans apresentam distribuição cosmopolita, sendo as excretas de pombos o seu principal reservatório. Com o advento de terapias imunossupressoras e a pandemia de HIV, observou-se o aumento significativo de casos de pacientes com criptococose. Atualmente, o diagnóstico é baseado na apresentação clínica, na observação microscópica de líquor corado com tinta da Índia e/ou no isolamento em cultura. Neste trabalho desenvolveu-se um ELISA para detecção de anticorpos contra C. neoformans var. grubii em soro de pacientes utilizando como antígeno um extrato protéico total de uma linhagem clínica isolada de um paciente com criptococose (HC6). Foram testados através de ELISA 40 amostras de soros de pacientes com criptococose, sendo 67,5% positivos e 32,5% falsos negativos. Como controles negativos foram testados 82 amostras de soros de indivíduos hígidos, dos quais 26,82% apresentaram resultados positivos para os testes realizados. Para testar a reatividade cruzada, foram utilizadas 10 amostras de pacientes com histoplasmose (20% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com paracoccidioidomicose (66,6% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com candidose (13,3% de reatividade cruzada) e 7 amostras de pacientes com aspergilose (14,28% de reatividade cruzada). Visando solucionar o problema da reatividade cruzada, identificamos proteínas antigênicas de C. neoformans var. grubii por eletroforese bidimensional seguida por western blot e espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). Das 75 amostras analisadas, quatro foram identificadas: uma proteína hipotética, 2 isoformas de HSPs 70 e uma catalase-2. As proteínas identificadas apresentaram baixa similaridade com ortólogas de outros fungos patogênicos, sendo, dessa forma, possíveis alvos para a padronização do ELISA e diagnóstico da criptococose. / Cryptococosis is an invasive and potentially fatal disease. Cryptococcus neoformans is the etiological agent, which can affect both immunocompromised and immunocompetent individuals. C. neoformans var. grubii and C. neoformans var. neoformans are cosmopolitan and their major natural reservoir is the excrement from pigeons. With the advent of immunosupressor therapies and the pandemic HIV infection, a significant augmentation of cryptococosis cases in humans was observed. Nowadays cryptococcosis diagnosis is based on the clinical presentation, India ink sample preparation methods and/or in vitro culture isolation. In this work we had developed an ELISA to detect antibodies against C. neoformans var. grubii in serum from patients with cryptococcosis using as antigens a whole cell protein extract from a clinical cell line isolate (HC6). Sera from 40 patients with cryptococcosis were tested by ELISA. From these, 67.5% were positives and 32.5% were false-negatives. As a negative control 82 samples from health subjects were also tested, from these 26.82% were positives. To test cross-reactivity, samples from 10 patients with histoplasmosis (20% cross-reactivity), 9 from patients with paracoccidioidomicosis (66.6% cross-reactivity), 9 from patients with candidosis (13.3% cross-reactivity) and 7 from patients with aspergilosis (14.28% cross-reactivity) were tested. To solve the cross-reactivity problem, we searched immunogenic proteins which were specific to C. neoformans var. grubii applying two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE-PAGE) followed by western blot and mass spectrometry (MALDI-TOF MS). From the 75 sample analyzed, four were identified: one as a hypothetic protein, two HSPs 70 isoforms and the protein catalase 2. These proteins showed low similarity with orthologues from other pathogenic fungi, and are potential targets to further of the standardizing cryptococosis diagnosis by ELISA.

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras encapsuladas e agentes etiológicos da criptococose. Estes microrganismos são patogénos intracelulares facultativos os quais interagem com macrófagos do hospedeiro durante o processo de infecção. C. neoformans é capaz de se replicar no interior de células fagocíticas utilizando uma estratégia única que envolve permeabilização do fagolisossoma e produção de polissacarídeos. No presente trabalho, a metodolologia da Análise da Diferença Representacional (RDA) foi aplicada para identificar genes diferencialmente expressos por C. neoformans e C. gattii durante o desenvolvimento intracelular em macrófagos peritoneais de ratos. C. neoformans internalizados por macrófagos expressaram genes relacionados ao tráfego vesicular, transporte de membrana, atividade de chaperona, regulação da meiose, metabolismo de monossacarídeo e resposta ao estresse. Em C. gattii, foram induzidos transcritos relacionados à respiração aeróbica, endocitose, tráfego vesicular, metabolismo de monossacarídeo e nitrogênio, sinalização celular e resposta ao estresse. Nossos resultados revelaram novos genes envolvidos no parasitismo intracelular de C. neoformans e C. gattii.