A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

O Complexo Cryptococcus neoformans compreende as espécies C. neoformans e C. gattii. Estas leveduras basidiomicéticas causam criptococose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Particularmente em fungos, proteínas ancoradas por Glicosilfosfatidilinositol (GPI-Ps) estão envolvidas em muitos aspectos da interação patógeno-hospedeiro, como adesão e invasão das células hospedeiras, modulação e evasão da resposta imune do hospedeiro e patogênese. Este trabalho tem por objetivo identificar proteínas ancoradas por GPI nas espécies do Complexo C. neoformans por análise in silico de suas sequências genômicas. Para isso, foi utilizado um conjunto de algorítimos para predição de GPI-Ps nas linhagens C. neoformans var. grubii (H99) e C. gattii (R265) através da análise de 6967 e 6210 seqüências de ORFs traduzidas, respectivamente. A classificação de uma proteína como sendo uma GPI-P seguiu o seguinte critério: a seqüência de aminoácidos apresentou (i) um peptídio sinal de secreção N-terminal; (ii) uma sequência sinal de ancoramento por GPI na extremidade C-terminal; (iii) ausência de domínios transmembrana internos. As seqüências foram obtidas no banco de dados genômicos do Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/science/data). Neste estudo, 63 proteínas foram identificadas como GPI-Ps em C. neoformans var. grubii (H99) e 47 em C. gattii (R265). Fosfolipase B1, Endo-1,3 -glucanases, Quitina desacetilases e Glioxaloxidases foram encontradas em ambas as espécies. Estas proteínas já foram previamente descritas como GPI-Ps, demonstrando que a metodologia empregada no estudo mostrou-se eficiente. As proteínas identificadas puderam ser, de maneira geral categorizadas funcionalmente, destacando-se aquelas envolvidas na biogênese e remodelamento da parede celular. Aproximadamente 70% das proteínas identificadas em ambas espécies não têm função conhecida, algumas tendo homólogas com outras proteínas fúngicas e outras sendo únicas da espécie. A identificação dessas proteínas será de extrema importância na elucidação de aspectos relacionados à patogênese e servirá de modelo para outras doenças causadas por fungos. / The Cryptococcus neoformans species Complex includes the Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii yeasts. These basidiomycete yeasts can cause disease in immunocompromised and immunocompetent patients, respectively. Notably in fungus, glicosylphosphatidilinositol-anchored proteins (GPI-Ps) are involved in different aspects of host-pathogen interaction, such as host cells adhesion and invasion, host immune response modulation and evasion and pathogenesis. In this work, we performed a systematic, genome-wide in silico identification of C. neoformans complex species GPI-Ps. A set of prediction tools was apllied for the screening of 6967 and 6210 predicted protein sequences from C. neoformans var. grubii (H99 strain) an C. gattii (R265 strain), respectively. The sequences were retrieved from the Broad Institute genome database (http://www.broadinstitute.org/science/data). The identification of putative GPI-Ps was based on the following criteria: i) the presence of an N-terminal signal peptide for secretion; ii) the presence of a C-terminal GPI-attachment site and iii) absence of internal transmembrane domains. A total of 63 putative GPI-Ps were identified in C. neoformans var. grubii and 47 proteins were identified as GPI-P in C. gattii. Proteins previously described as GPI-anchored, such as Phospholipase B1, Endo-1,3--glucanases, Chitin deacetylases and Glyoxaloxidases were identified in both species C. neoformans var grubii and C. gattii. The proteins identified could be classified in several functional categories, especially those involved in cell wall biogenesis and remodeling. About 70% of the GPI-Ps identified have unknown functions. Many of the putative GPI-Ps do not display conserved domains, but some possess have fungal orthologs homólogs while others are currently unique to specie. The GPI-P identification in Cryptococcus neoformans species complex is of extreme importance for elucidating aspects related to the pathogenesis and will serve as a model for others fungal diseases.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE ORIONALDA.pdf: 2127265 bytes, checksum: 6265bfc95f48ea602e76fd036eed1634 (MD5) Previous issue date: 2010-10-25 / Diferentes características fenotípicas como formação de cápsula polissacarídica, a expressão de lacase determinando a melanização em substratos fenólicos e produção de enzimas é prováveis fatores de virulência presentes nas espécies do complexo Cryptococcus neoformans. Neste trabalho foi avaliada a espessura da cápsula e da parede celular de isolados de C. neoformans. A atividade da fosfolipase e a suscetibilidade in vitro de C. neoformans à anfotericina B, voriconazol e ao extrato bruto da planta Pimenta pseudocaryophyllus foram também realizados para estes isolados. Os constituintes da célula como cápsula e parede celular foram ainda analisados quando sob a ação dos antifúngicose do extrato bruto da planta. A melanização das células foi obtida usando-se o meio mínimo adicionado de L-DOPA, a produção de fosfolipase foi feita em meio contendo gema de ovo, enquanto a suscetibilidade in vitro do microrganismo foi realizada pelo método de microdiluição em caldo seguindo o protococlo do CLSI. As células extraídas de um meio indutor de cápsula foram submetidas a uma concentração correspondente a 0,5 vezes da CIM obtida no teste de suscetibilidade in vitro, sendo medido o tamanho da cápsula e parede de 30 células de cada isolado e a média destes valores foi calculada. Os valores da espessura da cápsula de isolados de C. neoformans melanizados variaram de 1,20 a 1,90 &#956;m e de 2,63 a 5,12 &#956;m em não melanizados, quando submetidos ao meio de indução de cápsula. Com relação à parede, a variação foi de 0,80 a 1,09 &#956;m em células melanizadas e de 0,40 a 0,49 &#956;m em não melanizadas. A diferença para as medidas de cápsula, como de parede mostrou-se com valores estatisticamente significantes (p <0,05). Todos os isolados de C. neoformans foram capazes de produzir fosfolipase, sendo que os isolados melanizados apresentaram atividade desta enzima em 85,3%, enquanto nos não melanizados o percentual foi de 79,5%. A suscetibilidade do microrganismo melanizado ou não aos antifúngicos e ao extrato da planta mostrou-se equivalente, com a variação de CIM para voriconazol de 0,062-0,125 &#956;g/mL, 0,125-0,5 &#956;g/mL para anfotericina B e de 64 a 128 &#956;g/mL para o extrato bruto de P. pseudocaryophyllus. Os antifúngicos vorioconazol e anfotericina B e extrato bruto de P. pseudocaryophyllus, induziram redução de espessura da cápsula e parede celular de C. neoformans, quando comparados com o controle (ausência do fármaco ou da extrsto de planta) independente da presença ou não da melanina. As alterações verificadas na cápsula e parede celular de C. neoformans neste estudo poderão servir de guias para outras pesquisas direcionadas aos efeitos de antifúngicos na patogenia de criptococose.

La criptococosis es una micosis profunda que puede afectar al ser humano y a diversos animales. Tiene un curso crónico ó subagudo. El agente causal es una levadura capsulada llamada Cryptococcus neoformans. Este proceso puede presentarse en personas sanas, pero afecta sobre todo a sujetos inmunodeprimidos. La infección se inicia por la inhalación de las levaduras y diseminación por vía hematógena al sistema nervioso central.El objetivo principal de este trabajo ha sido de disponer de datos para conocer la epidemiología de la criptococosis en España.- Se han recopilado 184 cepas de 8 diferentes áreas geográficas de España, 128 de orígen clínico humano ( 95 % VIH + y ADVP), 13 de orígen animal, y 43 de muestras ambientales. - Se han estudiado muestras de polvo doméstico de 79 domicilios para comprobar si podían ser una fuente de infección. Seis muestras provenían de domicilios de pacientes con SIDA y criptococosis, 11 de pacientes VIH(+) sin criptococosis, y 62 de personas sanas. No se ha aislado C. neoformans en niguna muestra. El polvo doméstico no parece ser un reservorio de importancia para la transmisión de la criptococosis.- El estudio de las biovariedades mediante el crecimiento en medio de L-canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) junto con la asimilación de D-prolina y D-triptófano ha permitido demostrar por primera vez, la presencia en nuestro país de la variedad gattii de C. neoformans. Esta variedad produjo 5 brotes epidémicos de criptococosis en cabras en la provincia de Cáceres, con un alto porcentaje de animales afectados. Todas sufrían de síntomas respiratorios severos asociados a caquexia y síntomas neurológicos, y con un 100 % de mortalidad en los animales enfermos. Todas las cepas pertenecían al serotipo B.- Se obtuvieron sueros policlonales de los diferentes serotipos mediante inmunización de conejos. Se procedió por técnica de aglutinación al estudio del serotipado de todas las cepas. La distribución de los serotipos no es homogénea, varía según las regiones geográficas. El serotipo A es predominante, sin embargo hay una elevada tasa del serotipo D en las muestras clínicas y ambientales.- El estudio de las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) mediante la técnica de microdilución ha mostrado que el nivel global de resistencias es muy bajo. No se ha hallado ninguna cepa con CIM>1 mg/ml para anfotericina B. Las cepas del serotipo A mostraron menor sensibilidad. La 5-fluorocitosina ha resultado el antifúngico menos activo. El fluconazol ha mostrado menor actividad que el itraconazol. Tres cepas tenían CIM>64 mg/ml. El serotipo D mostró menor sensibilidad a los dos triazoles que el resto de los serotipos (P<0.00001). Las cepas de la var. gattii mostraron una sensibilidad uniformemente baja, y las ambientales tenían sensibilidades similares a las clínicas.- El método colorimétrico Sensititre utilizado para el estudio de las sensibilidades de 42 cepas de C. neoformans fué útil por su fácil ejecución y lectura de puntos de corte, sin embargo es un sistema que proporciona valores más bajos de CIM que el método de referencia.- Se determinaron las CIM de un nuevo antifúngico derivado de las sordarinas (GM 237354) en 190 cepas de C. neoformans. Se obtuvieron 5 cepas con valores de 2 mg/ml. La var. gattii es la que mostró menor sensibilidad. Se obtuvieron diferencias significativas entre los serotipos A y AD con respecto al serotipo B.- La aplicación de la técnica molecular del RAPD ha permitido demostrar que por lo menos coexisten 2 genotipos diferentes de la var. gattii aislada en cabras. Uno de los patrones parece ser el dominante, se ha hallado en todas los brotes epidémicos, mientras que el otro sólo se detectó en una zona. Con la misma técnica se ha podido discriminar entre diferentes aislamientos de un mismo paciente con criptococosis. / Cryptococcosis is a deep mycosis that can affect human beings and several types of animals. It can have either a chronic or a subacute course. Its causal agent is an encapsulated yeast called Cryptococcus neoformans. This process can appear in healthy humans although it mainly affects immunodepressed individuals. The infection begins by inhalation of the yeast and dissemination to the central nervous system by the haematogenous route.The main purpose of this study was to obtain information on the epidemiology of cryptococcosis in Spain.- One hundred and eighty-four strains were collected from eight different geographical areas in Spain. One hundred and twenty-eight strains were of human clinical origin (95% HIV + IDU), 13 of animal origin and 43 were environmental samples. - Samples of household dust proceeding from 79 homes were studied to check whether they could be a source of infection. Six samples proceeded from the homes of patients with AIDS and cryptococcosis, 11 from HIV(+) patients without cryptococcosis and 62 from healthy individuals. C. neoformans was not isolated in any of the samples. Domestic dust does not appear to be a reservoir of importance in the transmission of cryptococcosis.- The study of biovarieties using growth in L-canavanine-glycine-bromothymol blue (CGB) medium together with D-proline and D-tryptophan assimilation made it possible to prove, for the first time, the presence in our country of the Cryptococcus neoformans variety gattii. In the province of Cáceres, this variety produced five epidemic cryptococcosis outbreaks in goats, with a high percentage of affected animals. All the animals had severe respiratory symptoms associated with cachexia and neurological symptoms, with 100% mortality in sick animals. All were serotype-B strains.- Polyclonal serums of the various serotypes were obtained by immunisation of rabbits. The agglutination technique was used to carry out a serotyped study of all the strains. The distribution of the serotypes was not homogeneous but varied depending on the geographical regions. Serotype A was predominant although there was a high rate of serotype D in the clinical and environmental samples.- The study of the minimal inhibitory concentrations (MIC) using the microdilution technique proved that the global resistance level was very low. No strain with a MIC > 1 mg/ml was found for amphotericin B. Serotype-A strains showed less sensitivity. 5-fluorocytosine proved to be the least active antifungal agent. Fluconazol proved to be less active than itraconazole. Three strains had a MIC > 64 mg/ml. Serotype D showed less sensitivity to the two triazoles than the rest of the serotypes (P < 0.00001). All the strains of the gattii variety showed uniformly low sensitivity and the sensitivity of the environmental strains was similar to that of the clinical ones.- The colorimetric method Sensititre used for sensitivity testing in 42 strains of C. neoformans was useful because of its ease of implementation and breakpoint reading. However, this system gave lower values of MIC than the reference method. - The MICs of the new antifungal agent derived from sordarins (GM 237354) were determined in 190 strains of C. neoformans. Five strains with values of 2 mg/ml were obtained. The variety gattii is that which showed least sensitivity. Significant differences were obtained between serotypes A and D with respect to serotype B.- Application of the molecular technique RAPD demonstrated the coexistence of at least two different genotypes of the var. gattii isolated in goats. One of the patterns appears to be dominant, it is found in all epidemic outbreaks, whereas the other was only detected in one area. It was possible to distinguish between different isolations of a same patient with cryptococcosis using the same technique.

Thesis (Ph. D.)--University of Nevada, Reno, 1999. / Includes bibliographical references. Online version available on the World Wide Web.

Resumo: Nas últimas décadas, evidenciou-se aumento considerável de micoses de caráter invasivo e de difícil tratamento. A criptococose vem representando significativa causa de mortalidade, principalmente em indivíduos HIV positivos. É enfermidade causada por espécies de leveduras encapsuladas, Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, ambas as espécies constituindo-se nos agentes fúngicos mais frequentes a comprometer o sistema nervoso central (SNC). A disponibilidade de antifúngicos para a criptococose no mercado, atualmente é limitado, visto que em alguns casos, muitos deles são ineficientes e tóxicos. Além disso, adiciona-se também a diminuição de cepas sensíveis aos antifúngicos atuais, sendo um importante fator de complicação no tratamento dessas infecções. Neste estudo o gene ERG11 que codifica a proteína Lanosterol 14 C Desmetilase, alvo de fluconazol, de isolados clínicos seriados de C. neoformans recuperados de um paciente e um isolado de psitacídeo de C. gattii, que apresentaram valores de CIM elevadas (Concentração Inibitória Mínima) para o fluconazol, foi analisado. Para atingir este objetivo, os isolados clínicos sequenciais 26, 27 e 30 de um paciente do Rio de Janeiro, C. neoformans ATCC 90012 e o isolado do psitacídeo de C. gattii foram selecionados. O isolado C. gattii e os isolados 26, 27 e 30 de C. neoformans, caracterizados como sensível, intermediário e resistente in vitro a fluconazol, respectivamente, foram selecionados para análise de pontos de mutação na sequência do gene ERG11 através do sequenciamento dos produtos amplificados utilizando primers desenhados a partir da sequência do gene. A sequência do gene ERG11 do isolado 30 (resistente) apresentou um ponto de mutação e duas variações na sequência nucleotídica. A primeira, quando alinhada e comparada com a sequência do isolado 26 (sensível) e do gene de referência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the last decades, there was a considerable increase in invasive fungal infections of difficult treatment. Cryptococcosis has represented a significant cause of morbidity and mortality, especially among HIV positive individuals. It is a disease caused by encapsulated yeasts species, Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, both species becoming the most common fungal agents to compromise the central nervous system (CNS). The availability of commercial antifungals is currently restricted and many of them are ineffective and toxic. In addition, there was the emergence of resistant strains to the current antifungals and this is an important complicating factor in treating these infections. In this study, the ERG11 gene that encodes the protein alpha Lanosterol 14-demethylase, target of fluconazole of serial clinical isolates of C. neoformans recovered from a patient and an isolate of C. gattii of a parrot, which showed higher MIC values (Minimum Inhibitory Concentration) for fluconazole was analyzed. To achieve this goal, the sequential clinical isolates 26, 27 and 30 of a patient from Rio de Janeiro, C. neoformans ATCC 90012 and the isolate of C. gattii of the parrot were selected. Isolates 26, 27 and 30 susceptible (S), intermediate (I) and resistant (R) in vitro, respectively, and the isolation of C. gattii were selected for analysis of mutation points in the ERG11 gene sequence by sequencing of amplified products using primers designed from the sequence of the gene. The ERG11 gene sequence of isolate 30 (resistant) showed a mutation point and two variations in the nucleotide sequence. The first, when aligned and compared with the sequence of isolate 26 (susceptible) and the reference gene was significant and the other two changes were silent. When the sequence was translated into Lanosterol 14-alpha demethylase protein, we found that the mutation led to an amino acid exchange... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ana Marisa Fusco Almedia / Coorientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Marica de Souza Carvalho Melhem / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Mestre

A criptococose é uma doença invasiva capaz de apresentar-se de forma fatal podendo acometer pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos. Os agentes etiológicos Cryptococcus neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans apresentam distribuição cosmopolita, sendo as excretas de pombos o seu principal reservatório. Com o advento de terapias imunossupressoras e a pandemia de HIV, observou-se o aumento significativo de casos de pacientes com criptococose. Atualmente, o diagnóstico é baseado na apresentação clínica, na observação microscópica de líquor corado com tinta da Índia e/ou no isolamento em cultura. Neste trabalho desenvolveu-se um ELISA para detecção de anticorpos contra C. neoformans var. grubii em soro de pacientes utilizando como antígeno um extrato protéico total de uma linhagem clínica isolada de um paciente com criptococose (HC6). Foram testados através de ELISA 40 amostras de soros de pacientes com criptococose, sendo 67,5% positivos e 32,5% falsos negativos. Como controles negativos foram testados 82 amostras de soros de indivíduos hígidos, dos quais 26,82% apresentaram resultados positivos para os testes realizados. Para testar a reatividade cruzada, foram utilizadas 10 amostras de pacientes com histoplasmose (20% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com paracoccidioidomicose (66,6% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com candidose (13,3% de reatividade cruzada) e 7 amostras de pacientes com aspergilose (14,28% de reatividade cruzada). Visando solucionar o problema da reatividade cruzada, identificamos proteínas antigênicas de C. neoformans var. grubii por eletroforese bidimensional seguida por western blot e espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). Das 75 amostras analisadas, quatro foram identificadas: uma proteína hipotética, 2 isoformas de HSPs 70 e uma catalase-2. As proteínas identificadas apresentaram baixa similaridade com ortólogas de outros fungos patogênicos, sendo, dessa forma, possíveis alvos para a padronização do ELISA e diagnóstico da criptococose. / Cryptococosis is an invasive and potentially fatal disease. Cryptococcus neoformans is the etiological agent, which can affect both immunocompromised and immunocompetent individuals. C. neoformans var. grubii and C. neoformans var. neoformans are cosmopolitan and their major natural reservoir is the excrement from pigeons. With the advent of immunosupressor therapies and the pandemic HIV infection, a significant augmentation of cryptococosis cases in humans was observed. Nowadays cryptococcosis diagnosis is based on the clinical presentation, India ink sample preparation methods and/or in vitro culture isolation. In this work we had developed an ELISA to detect antibodies against C. neoformans var. grubii in serum from patients with cryptococcosis using as antigens a whole cell protein extract from a clinical cell line isolate (HC6). Sera from 40 patients with cryptococcosis were tested by ELISA. From these, 67.5% were positives and 32.5% were false-negatives. As a negative control 82 samples from health subjects were also tested, from these 26.82% were positives. To test cross-reactivity, samples from 10 patients with histoplasmosis (20% cross-reactivity), 9 from patients with paracoccidioidomicosis (66.6% cross-reactivity), 9 from patients with candidosis (13.3% cross-reactivity) and 7 from patients with aspergilosis (14.28% cross-reactivity) were tested. To solve the cross-reactivity problem, we searched immunogenic proteins which were specific to C. neoformans var. grubii applying two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE-PAGE) followed by western blot and mass spectrometry (MALDI-TOF MS). From the 75 sample analyzed, four were identified: one as a hypothetic protein, two HSPs 70 isoforms and the protein catalase 2. These proteins showed low similarity with orthologues from other pathogenic fungi, and are potential targets to further of the standardizing cryptococosis diagnosis by ELISA.

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras encapsuladas e agentes etiológicos da criptococose. Estes microrganismos são patogénos intracelulares facultativos os quais interagem com macrófagos do hospedeiro durante o processo de infecção. C. neoformans é capaz de se replicar no interior de células fagocíticas utilizando uma estratégia única que envolve permeabilização do fagolisossoma e produção de polissacarídeos. No presente trabalho, a metodolologia da Análise da Diferença Representacional (RDA) foi aplicada para identificar genes diferencialmente expressos por C. neoformans e C. gattii durante o desenvolvimento intracelular em macrófagos peritoneais de ratos. C. neoformans internalizados por macrófagos expressaram genes relacionados ao tráfego vesicular, transporte de membrana, atividade de chaperona, regulação da meiose, metabolismo de monossacarídeo e resposta ao estresse. Em C. gattii, foram induzidos transcritos relacionados à respiração aeróbica, endocitose, tráfego vesicular, metabolismo de monossacarídeo e nitrogênio, sinalização celular e resposta ao estresse. Nossos resultados revelaram novos genes envolvidos no parasitismo intracelular de C. neoformans e C. gattii.

A criptococose é uma doença fúngica invasiva causada majoritariamente pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que a infecção causada por C. gattii desenvolve mais frequentemente criptococomas pulmonares, enquanto que C. neoformans estabelece principalmente quadros de meningoencefalite. Embora ocorra essa associação, o mecanismo de disseminação dessas espécies não está completamente elucidado, instigando a utilização de diferentes abordagens na caracterização da infecção. O desenvolvimento de microrganismos bioluminescentes tem permitido o monitoramento em tempo real da infecção em modelos animais. No presente trabalho, diferentes estratégias foram utilizadas para a construção de linhagens de C. neoformans e de C. gattii expressando o gene repórter luciferase Renilla, sem sucesso. Paralelamente, em uma segunda abordagem, bactérias bioluminescentes (BL) foram isoladas de amostras de água marinha coletadas nas adjacências da zona estuarina do rio Tramandaí, com o objetivo de selecionar o cassete lux (CDABE) para a utilização como gene repórter. Todos os isolados apresentaram luminescência a 28°C, mas, quando incubados a 37°C, somente o isolado BL6 permaneceu com uma atividade luminescente consideravelmente reduzida. Portanto as bactérias bioluminescentes pertencentes aos gêneros Vibrio, Photobacterium e Enterovibrio isoladas do rio Tramandaí não apresentaram níveis de emissão de luminescência adequados à temperatura fisiológica humana para a utilização do cassete lux como gene repórter para monitoramento de infecções in vivo. / Cryptococcosis is an invasive fungal disease caused mainly by pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. Recent epidemiological studies have suggested that infection with C. gattii develops more frequently pulmonary cryptococcomas, while C. neoformans establishes mainly neurological damages. Although exists this association, the mechanism of dissemination of these species is not completely understood, instigating the use of different approaches for the characterization of the infections. Alternatively, the development of bioluminescent organisms has allowed the real-time monitoring of infection in animal models. In this study, different strategies were used to construct strains of C. neoformans and C. gattii expressing Renilla luciferase reporter gene without success. In a second approach, bioluminescent bacteria (BL) were isolated from seawater samples collected in the vicinity of the river Tramandaí estuarine zone, in order to select the lux cassette (CDABE) for use as a reporter gene. All isolates showed luminescence at 28°C, but when incubated at 37°C, only the isolate BL6 remained with a considerably reduced luminescent activity. Thus, bioluminescent bacteria belonging to the genera Vibrio, Photobacterium and Enterovibrio isolated from Tramandaí river estuary zone presented unsuitable luminescence emission levels at human physiological temperature, preventing the use of lux cassette as a reporter gene in experiments to monitoring cryptococcosis infection.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / Introdução: A criptococose e a terceira causa de infeccao fungica invasiva nos pacientes submetidos a transplante renal, apresentando alta mortalidade. Objetivo: Descrever as caracteristicas epidemiologicas, clinicas e diagnostica, assim como os fatores prognosticos e o impacto da anfotericina B sobre a funcao do enxerto da criptococose em pacientes submetidos a transplante renal. Metodos: Foi utilizada ficha clinica padrao, com mais de 250 variaveis, para avaliar todos os casos de criptococose acompanhados nos hospitais do complexo UNIFESP/EPM durante o periodo de janeiro de 1995 a janeiro de 2007. Resultados: Um total de 40 casos de criptococose foi identificado entre 4.727 transplantes renais, sendo 67,5 por cento do genero masculino. Desses, 37,5 por cento apresentaram rejeicao do enxerto previa a micose e 30 por cento dos casos eram portadores de hepatite C. A criptococose ocorreu com media de 4,5 anos apos o transplante renal, sendo que em 77,5 por cento dos casos ocorreu apos um ano do transplante. O antigeno criptococico teve alta sensibilidade, mas, correlacao limitada com a evolucao clinica frente ao tratamento. Os comprometimentos mais frequentes foram: do sistema nervoso central (75 por cento), pulmonar (30 por cento), cutaneo (30 por cento) e doenca disseminada (40 por cento). Dos 40 pacientes, 97,5 por cento foram tratados, sendo a anfotericina B utilizada em 89,7 por cento dos casos. A diminuicao da imunossupressao durante o tratamento foi realizado em 57,9 por cento dos casos. Apenas 41,4 por cento apresentaram resposta terapeutica favoravel em duas semanas. A mortalidade de 90 dias ocorreu em 29,4 por cento dos individuos, sendo maior no comprometimento disseminado. Os fatores prognosticos encontrados foram: sonolencia na admissao; hipoglicorraquia e tinta da China positiva no liquor inicial e resposta desfavoravel ao tratamento com duas semanas. A anfotericina B desoxicolato causou nefrotoxicidade em 97,1 por cento dos casos, sendo grave em 45,5 por cento. Observou-se a perda do enxerto em 12,1 por cento dos pacientes que utilizaram essa medicacao. A perda do enxerto em 30 dias foi significantemente mais frequente nos pacientes com idade superior a 50 anos; nos com creatinina basal ou do diagnostico elevada e nos pacientes que apresentavam causas adicionais para a nefrotoxicidade. Conclusoes: A criptococose se mantem como uma complicacao importante nos pacientes submetidos a transplante renal, com uma apresentacao tardia no periodo pos-transplante e alta mortalidade. A anfotericina B desoxicolato mostrou alta nefrotoxicidade nessa populacao, associada a significante taxa de perda do enxerto / Introduction: Cryptococcosis, which is the third cause of invasive fungal infections in renal transplant recipients, is an important life-threatening opportunistic infection. Objective: Describe the epidemiological, clinical and diagnostic features of cryptococcosis in renal transplant recipients, as well as the outcome, predictors of mortality and the amphotericin B impact on renal graft function. Methods: Cases of cryptococcosis among renal transplant recipients were identified in UNIFESP/EPM hospitals from January 1995 through January 2007. Results: Forty renal transplant recipients were diagnosed with cryptococcosis among 4,727 consecutive transplant recipients, being 67.5% male. 37.5% out of 40 patients had graft rejection preceding the infection and 30% had hepatitis C. Cryptococcosis occurred a mean of 4.5 years after transplantation; 77,5% of the infections developed more than 1 year after transplantation. The cryptococcal antigen had a high sensibility, although a limited clinical correlation during treatment. Cryptococcus neoformans was isolated in 22 patients and in 1 patient, Cryptococcus gattii infection was documented. Central nervous system involvement occurred in 75% of the cases, pulmonary and cutaneous involvement in 30% each and disseminated infection was observed in 40% of the patients. Regarding treatment, 97.5% of cases received antifungal therapy, whose primary therapy comprised amphotericin B in 89.7%. Primary Immunosuppression was reduced in 57.9% of cases during the infection and the outcome was favorable in 41.4% within 2 weeks. Mortality rate at 90 days was 29.4% and it was higher in disseminated cryptococcosis. Drowsiness on admission; low glucose and positive India ink in the initial cerebrospinal fluid and unfavorable outcome within 2 weeks were a significant predictor of death in these patients. In 45.5% of cases, the baseline serum creatinine level increased more than 50% during amphotericin B therapy and 12.1% had graft loss. The graft loss within 30 days was significantly more likely to occur in patient older than 50; in those with higher baseline and diagnostic serum creatinine levels and in patients who had an additional factor for nephrotoxicity. Conclusion: Cryptococcosis remains a relevant late-onset complication in renal transplant recipients, which describes high mortality rate. Amphotericin B deoxycholate had a negative influence on graft function, with a significant high graft loss rate. / BV UNIFESP: Teses e dissertações