A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

O Complexo Cryptococcus neoformans compreende as espécies C. neoformans e C. gattii. Estas leveduras basidiomicéticas causam criptococose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Particularmente em fungos, proteínas ancoradas por Glicosilfosfatidilinositol (GPI-Ps) estão envolvidas em muitos aspectos da interação patógeno-hospedeiro, como adesão e invasão das células hospedeiras, modulação e evasão da resposta imune do hospedeiro e patogênese. Este trabalho tem por objetivo identificar proteínas ancoradas por GPI nas espécies do Complexo C. neoformans por análise in silico de suas sequências genômicas. Para isso, foi utilizado um conjunto de algorítimos para predição de GPI-Ps nas linhagens C. neoformans var. grubii (H99) e C. gattii (R265) através da análise de 6967 e 6210 seqüências de ORFs traduzidas, respectivamente. A classificação de uma proteína como sendo uma GPI-P seguiu o seguinte critério: a seqüência de aminoácidos apresentou (i) um peptídio sinal de secreção N-terminal; (ii) uma sequência sinal de ancoramento por GPI na extremidade C-terminal; (iii) ausência de domínios transmembrana internos. As seqüências foram obtidas no banco de dados genômicos do Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/science/data). Neste estudo, 63 proteínas foram identificadas como GPI-Ps em C. neoformans var. grubii (H99) e 47 em C. gattii (R265). Fosfolipase B1, Endo-1,3 -glucanases, Quitina desacetilases e Glioxaloxidases foram encontradas em ambas as espécies. Estas proteínas já foram previamente descritas como GPI-Ps, demonstrando que a metodologia empregada no estudo mostrou-se eficiente. As proteínas identificadas puderam ser, de maneira geral categorizadas funcionalmente, destacando-se aquelas envolvidas na biogênese e remodelamento da parede celular. Aproximadamente 70% das proteínas identificadas em ambas espécies não têm função conhecida, algumas tendo homólogas com outras proteínas fúngicas e outras sendo únicas da espécie. A identificação dessas proteínas será de extrema importância na elucidação de aspectos relacionados à patogênese e servirá de modelo para outras doenças causadas por fungos. / The Cryptococcus neoformans species Complex includes the Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii yeasts. These basidiomycete yeasts can cause disease in immunocompromised and immunocompetent patients, respectively. Notably in fungus, glicosylphosphatidilinositol-anchored proteins (GPI-Ps) are involved in different aspects of host-pathogen interaction, such as host cells adhesion and invasion, host immune response modulation and evasion and pathogenesis. In this work, we performed a systematic, genome-wide in silico identification of C. neoformans complex species GPI-Ps. A set of prediction tools was apllied for the screening of 6967 and 6210 predicted protein sequences from C. neoformans var. grubii (H99 strain) an C. gattii (R265 strain), respectively. The sequences were retrieved from the Broad Institute genome database (http://www.broadinstitute.org/science/data). The identification of putative GPI-Ps was based on the following criteria: i) the presence of an N-terminal signal peptide for secretion; ii) the presence of a C-terminal GPI-attachment site and iii) absence of internal transmembrane domains. A total of 63 putative GPI-Ps were identified in C. neoformans var. grubii and 47 proteins were identified as GPI-P in C. gattii. Proteins previously described as GPI-anchored, such as Phospholipase B1, Endo-1,3--glucanases, Chitin deacetylases and Glyoxaloxidases were identified in both species C. neoformans var grubii and C. gattii. The proteins identified could be classified in several functional categories, especially those involved in cell wall biogenesis and remodeling. About 70% of the GPI-Ps identified have unknown functions. Many of the putative GPI-Ps do not display conserved domains, but some possess have fungal orthologs homólogs while others are currently unique to specie. The GPI-P identification in Cryptococcus neoformans species complex is of extreme importance for elucidating aspects related to the pathogenesis and will serve as a model for others fungal diseases.

SILVA, A. R. Avaliação in vitro da berberina frente às cepas de Candida spp. e Cryptococcus neoformans resistentes ao fluconazol e sua atividade em isolados formadores de biofilme. 2015. 67 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-04-25T12:16:21Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_arsilva.pdf: 998105 bytes, checksum: ce9627da7fc2b87f008c03014538cf67 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-04-25T12:16:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_arsilva.pdf: 998105 bytes, checksum: ce9627da7fc2b87f008c03014538cf67 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T12:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_arsilva.pdf: 998105 bytes, checksum: ce9627da7fc2b87f008c03014538cf67 (MD5) Previous issue date: 2015-08-27 / Currently, the incidence of fungal infections has increased significantly, contributing to morbidity and mortality. It has as one of its main causes the increase of antibiotic resistance. Recently associated with biofilm production, which has a high level of antibiotic resistance, coupled with the limited antifungal pharmacological when compared to antibacterial, it leads to the need for the development of new therapeutic strategies. The berberine has shown to have broad antibacterial and antifungal activity. In this context, the objective was to evaluate the antifungal potential of berberine against strains of Candida spp. and Cryptococcus neoformans resistant to fluconazole and evaluate the effect of berberine against strains of Candida tropicalis in biofilm formation. The evaluation of the antifungal effect was determined by microdilution in broth (M27-A3) and by flow cytometry techniques, in which the likely mechanism of action of that compound was evaluated. For the assessment of the biofilm, a colorimetric assay (MTT) was used to determine the susceptibility of sessile cells. Strains of Candida spp. and Cryptococcus neoformans resistant to fluconazole after 24h and 72h showed the minimum inhibitory concentration (MIC) equal to 8 μg/mL and 16-24 μg/ml, respectively. It demonstrates a significant antifungal activity, which, in accordance with cytometry, after the cells were treated with berberine, promoted damage to DNA, changes in the integrity of the plasma and mitochondrial membrane, caused and probably led to cell death by apoptosis. Regarding isolated biofilm formers, when exposed to berberine, they showed a MIC of less than 37.5 mg/mL (MIC 50%), causing a statistically significant reduction in the cellular activity of the biofilm (P <0.001). Therefore, considering these activities, coupled with the lack of studies related to biotechnological development of a phytoproduct, berberine becomes a source of promising molecules with antifungal properties. / Atualmente, a incidência de infecções fúngicas tem aumentado significativamente, contribuindo assim para morbidade e mortalidade. Esse fato que tem como umas das principais causas o aumento da resistência antimicrobiana, estando associado à produção de biofilme que tem um elevado nível de resistência antimicrobiana juntamente com o arsenal farmacológico antifúngico limitado, quando comparado ao arsenal antibacteriano, leva a necessidade do desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. A berberina tem demonstrado ter ampla atividade antibacteriana e antifúngica. Dentro desse contexto, o objetivo foi avaliar o potencial antifúngico da berberina frente às cepas de Candida spp. e Cryptococcus neoformans resistentes ao fluconazol, bem como avaliar o efeito da berberina frente às cepas de Candida spp. em forma de bioflme. A avaliação do efeito antifúngico foi determinada pelo método de microdiluição em caldo (M27-A3) e por meio de técnicas de citometria de fluxo em que foram avaliados elementos que contribuam para elucidação do provável mecanismo de ação da berberina. Para a avaliação da atividade de células fúngicas do biofilme, utilizou-se o ensaio colorimétrico com o sal de tetrazólio (MTT), a fim de determinar a suscetibilidade das células sésseis. As cepas de Candida spp. e Cryptococcus neoformans resistentes ao fluconazol após 24h e 72h apresentaram a Concentração Inibitória Mínima (CIM) igual 8 µg/mL e 16 – 24 µg/mL, respectivamente, demonstrando assim, apresentar atividade antifúngica significativa, que sendo confirmada posteriormente por técnicas da citometria de fluxo, após a exposição das células ao composto sintético cloreto de berberina, foram observadas alterações concementes a ruptura da integridade da membrana plasmática e mitocondrial, danos ao DNA e provavelmente o desencadeamento de tais eventos conduziu a morte celular por apoptose. Em relação aos isolados formadores de biofilme, esses ao serem expostos a berberina apresentaram CIM inferior a 37,5 µg/mL (CIM50), sendo a redução considerada estatisticamente significativa na atividade celular do biofilme (P < 0,001). Sendo assim, as atividades, no presente estudo aliados a busca de mais elementos que contribuam para a melhor compreensão e o desenvolvimento biotecnológico de um fitoproduto, tomando como exemplo a molécula de estudo, a berberina, sendo aqui elencada como possível protótipo de moléculas promissoras com propriedades antifúngicas.

Interações patógeno-hospedeiro geram alterações em diversos mecanismos, tanto no hospedeiro quanto no patógeno. Neste contexto, nas células do sistema imune do hospedeiro ocorre modulação para impedir o desenvolvimento de patógenos, culminado em sua eliminação, como no caso de infecções por Cryptococcus neoformans. Macrófagos alveolares constituem o primeiro tipo celular a responder à levedura, a qual, após a fagocitose, é capaz de se proliferar e disseminar no hospedeiro. Como mecanismo de defesa, células hospedeiras podem reduzir a concentração de micronutrientes essenciais para o patógeno, mecanismo conhecido por imunidade nutricional. Zinco (Zn) é o segundo metal de transição mais abundante e um micronutriente essencial para todos os organismos e, com isto, macrófagos podem responder a patógenos com redução dos níveis de Zn para auxiliar na eliminação de patógenos. A fim de avaliar se macrófagos respondem com privação de Zn a a fungos, a alteração na homeostase de Zn em macrófagos infectados por C. neoformans foi avaliada bem como a influência da ativação celular nesta resposta. Demonstramos que macrófagos respondem com privação de Zn à infecção por C. neoformans uma vez que ocorreu (i) diminuição nos níveis intracelulares de Zn livre em macrófagos infectados com a levedura viável, (ii) redução na expressão de importadores do metal, (iii) redução nos níveis de Zn livre em leveduras após exposição a macrófagos, (iv) aumento na proliferação no interior de macrófagos e diminuição da taxa de exocitose de C. neoformans em condições de disponibilidade de Zn. Tal modulação de Zn na resposta a C. neoformans foi exercida por alguns transportadores de Zn que respondem significativamente a condições de privação de Zn, principalmente os da família ZnT, e a privação de Zn como mecanismo de imunidade nutricional foi evidente em macrófagos ativados com IFN- e LPS. Macrófagos ativados com PMA não mostraram redução nos níveis intracelulares de Zn em reposta a C. neoformans ou modulação significativa nos níveis de transcritos de transportadores de Zn, como ZIP2 e ZnT7, em comparação a macrófagos ativados com IFN- e LPS. Além disso, de forma geral, macrófagos ativados continham maiores níveis intracelulares de Zn livre em comparação a macrófagos não ativados, sugerindo modulação do processo de ativação na homeostase de Zn em macrófagos J774.A1. / Host-pathogen interactions cause alterations on several mechanisms in both host and pathogen. In this context, host immune system cells are modulated to prevent pathogens growth, aiding in their elimination, as it occurs during Cryptococcus neoformans infections. Alveolar macrophages are the first cell type to respond to yeast infection. Once phagocytosed, cryptococcal cells are capable to proliferate and disseminate in the host. As a defense mechanism, host cells can reduce essential micronutrients concentration to the pathogen, a mechanism known as nutritional immunity. Zinc (Zn) is the second most abundant transition metal and an essential micronutrient for all organisms and thus, macrophages may respond to pathogens with reduced levels of Zn to aid pathogens elimination. In order to evaluate whether macrophages respond with Zn deprivation to fungi, alterations on Zn homeostasis in C. neoformans-infected macrophages was evaluated as well as the influence of cellular activation in this response. We demonstrate that macrophages respond with Zn deprivation to C. neoformans infection, as we could observe (i) a reduction of free intracellular Zn levels in macrophages infected with viable yeast, (ii) a reduced expression of Zn importers, (iii) a decreased free Zn concentration in yeasts exposed to macrophages, (iv) increased yeast proliferation within macrophages and decreased yeast exocytosis under Zn rich conditions. This Zn modulation in response to C. neoformans was exerted by some Zn transporters which respond significantly to Zn deprivation conditions, especially those of the ZnT family, and Zn deprivation as a nutritional immunity mechanism was evident in IFN- and LPS-activated macrophages. PMA-activated macrophages showed no reduction in intracellular Zn levels in response to C. neoformans or a significant modulation in Zn transporters transcript levels, such as ZIP2 and ZnT7, in comparision to IFN-- LPS-activated macrophages. In addition, in general, activated macrophages contained increased free intracellular Zn levels in comparision to non-activated macrophages, suggesting activation process modulation on Zn homeostasis in J774.A1 macrophages.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-03-28T04:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344604.pdf: 1015682 bytes, checksum: 335d990113d5b4c936026c9464b3f875 (MD5) Previous issue date: 2016 / O Cryptococcus neoformans, agente etiológico da criptococose é uma levedura encapsulada de distribuição mundial. A doença é oportunista para pacientes imunocomprometidos, mas também pode acometer indivíduos imunocompetentes. A infecção pelo fungo resulta de inalação de basidiósporos presentes no ambiente e pode causar infecção pulmonar sintomática ou assintomática autolimitada ou permanecer latente dentro de um granuloma. O fungo está classificado em três variedades: C. neoformans var grubii (sorotipo A) de distribuição mundial, C. neoformans var neoformans (sorotipo D) e C. neoformans var gattii (sorotipos B e C) e o híbrido sorotipo AD encontrados nas regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, as três variedades são reportadas como agentes etiológicos da criptococose em humanos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência do fungo Cryptococcus neoformans em amostras ambientais na Serra Catarinense e avaliar a variabilidade genética dos isolados. Excretas de pombos (720 amostras) e folhas de eucalipto (240 amostras), foram coletas no período de Abril de 2014 a Março de 2016 em intervalo de 3 meses em 18 municípios da Serra Catarinense e processadas para isolamento do fungo em meio de cultura Níger cloranfenicol a 37oC. Foram isoladas 17 amostras, todas do município de Lages e a caracterização morfológica, produção de urease, produção de melanina e quimiotipagem em meio CGB permitiram identificar presuntivamente os isolados como pertencentes ao gênero Cryptococcus. A amplificação do gene CAP59 e a restrição do fragmento amplificado com as enzimas de restrição AvaII e HaeIII permitiu identificar todos os isolados com C. neoformans var. grubii tipo A e a tipagem molecular através de PCR-fingerprinting utilizando o iniciador M13 revelou que todas as amostras pertencem ao padrão molecular VNI. Os resultados mostram que apenas C. neoformans var. grubii tipo A, padrão molecular VNI foi identificado nas amostras ambientais na Serra Catarinense.<br> / Abstract : Cryptococcus neoformans, the causative agent of cryptococcosis is an encapsulated yeast-like fungus of worldwide distribution causing a common opportunistic infection on immunocompromised patients, but also affecting immunocompetent individuals. The infection occurs via inhalation of environmental basidiospores and may lead to symptomatic or asymptomatic pulmonary disease that can be often self-limited or remain latent within a granuloma in the lung. The fungus has three varieties as follows: C. neoformans var. grubii (serotype A) worldwide distributed, C. neoformans var. neoformans (serotype D) and C. neoformans var. gattii (serotypes B and C), as well as the hybrid serotype AD are found in tropical and subtropical regions. Since human cryptococcosis in Brazil is caused by all three varieties, we have addressed in this study the occurrence and typing of C. neoformans obtained from environmental samples from the Serra Catarinense. Pigeon excreta (720 samples) and eucalyptus leaves (240 samples) were collected between April 2014 and March 2016 in a 3 months interval at the municipalities of the Serra Catarinense and processed for fungus isolation in Niger chloranphenicol medium at 37oC. A total of 17 samples were isolated from the municipality of Lages. Morphological characterization, urease and melanin production and chemotyping in CGB medium, led us to presumptively identify the isolates belonging to the genus Cryptococcus. The PCR/RFLP analysis of the CAP59 gene using HaeIII and AvaII allowed identification of the isolates as C. neoformans var. grubii type A. Molecular typing using PCR-fingerprinting with M13 primer revealed that all samples belong to NIV molecular pattern. Our results indicate the exclusive presence of C. neoformans var. grubii type A VNI in environmental samples from the Serra Catarinense.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-01T13:08:28Z No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-07-26T22:27:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T22:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Os genes de histonas desacetilases (HDAC) são altamente conservados entre diferentes espécies e dirigem importantes processos epigenéticos na manutenção da estrutura e funcionamento do genoma. Entretanto, o papel das HDAC na regulação dos traços de virulência de patógenos permanece pobremente explorado. O fungo patogênico em humanos Cryptococcus neoformans passa por mudanças fenotípicas que promovem persistência e sobrevida dentro do hospedeiro ou em nichos ecológicos. Tais mudanças estão associadas à regulação diferencial da expressão gênica. Neste contexto, inicialmente foi avaliado o efeito de dois inibidores químicos de histona desacetilases (HDACi), o butirato de sódio (NaBut) e a tricostatina A (TSA), sobre as células de C. neoformans. Os resultados demonstraram que ambos inibidores foram capazes de afetar os principais traços de virulência de C. neoformans. Em seguida, foram identificados e deletados 8 genes de HDAC de Classe I e Classe II em C. neoformans. A maioria dos processos previamente associados à virulência em C. neoformans foi afetada pelo tratamento com HDACi eou pela deleção de genes: a capacidade de crescimento a 37 – 39 ºC, a formação da cápsula polissacarídica, a produção de melanina, as atividades de fosfolipase e de proteases, a formação de hifas de acasalamento e a integridade da parede celular. Os mutantes de HDAC também mostraram defeitos na sobrevivência intracelular quando co-cultivados com macrófagos murinos, assim como virulência comprometida nos modelos de infecção de Galleria mellonella e camundongos. A histona desacetilase Clr3 foi apontada como um importante regulador da virulência em C. neoformans. A linhagem de C. neoformans clr3mutante mostrou-se hipovirulenta em ambos os modelos de criptococose animal. Outrossim, a análise de RNA-seq indicou que a proteína Clr3 regula a expressão de vários genes importantes para a adaptação e sobrevivência de C. neoformans ao ambiente hospedeiro. Os resultados indicam que a remodelação da cromatina, por meio das conservadas HDAC, é um importante mecanismo envolvido na virulência de C. neoformans. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Histone Deacetylase (HDAC) genes are highly conserved among different species, directing one of the most important epigenetic processes regulating gene expression – chromatin remodeling. However, the role of HDACs in the regulation of virulence traits in pathogens remains poorly explored. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans undergoes phenotypic changes to promote persistence and survival inside the host or in specific ecological niches. Very likely, these changes are associated with epigenetic regulation. In this context, we initially evaluated the effect of two chemical inhibitors of histone deacetylases (HDACi): Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA). The results showed that both were able to impair the expression of the main virulence traits of C. neoformans. Based on these data, we identified and deleted eight genes encoding predicted class I/II HDACs in C. neoformans. In this way, we predicted that we would be able to assign specific function to each HDAC, especially in regards to virulence trait expression. Phenotypes of specific HDAC mutant strains indicate that individual proteins control non-identical but overlapping cellular processes associated with virulence. In the other hand, for some genes we also have observed an opposite regulation. Most processes previously related to virulence in C. neoformans were affected here, such as thermotolerance (growth at 37-39 oC); capsule, melanin and protease formation; and cell wall integrity. Additionally, defects in mating and hyphal development were observed for the clr3HDAC mutant strain. HDAC mutants also displayed defects in intracellular survival when co-cultured with activated macrophages, a finding highly correlated with altered virulence in vivo. Also, we tested the virulence in Galleria mellonella and mice. Overall our results support that the Clr3 histone deacetylase is a newly identified regulator of fungal virulence. The corresponding mutant was hypovirulent in both animal models of cryptococcosis. Furthermore transcriptional profiling shows that the Clr3 protein regulates the expression of many genes that are important for the adaptation of C. neoformans for survival inside the host. Our work displays that chromatin remodeling by the conserved histone deacetylases is an important mechanism behind the virulence of C. neoformans.

O Complexo Cryptococcus neoformans compreende as espécies C. neoformans e C. gattii. Estas leveduras basidiomicéticas causam criptococose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Particularmente em fungos, proteínas ancoradas por Glicosilfosfatidilinositol (GPI-Ps) estão envolvidas em muitos aspectos da interação patógeno-hospedeiro, como adesão e invasão das células hospedeiras, modulação e evasão da resposta imune do hospedeiro e patogênese. Este trabalho tem por objetivo identificar proteínas ancoradas por GPI nas espécies do Complexo C. neoformans por análise in silico de suas sequências genômicas. Para isso, foi utilizado um conjunto de algorítimos para predição de GPI-Ps nas linhagens C. neoformans var. grubii (H99) e C. gattii (R265) através da análise de 6967 e 6210 seqüências de ORFs traduzidas, respectivamente. A classificação de uma proteína como sendo uma GPI-P seguiu o seguinte critério: a seqüência de aminoácidos apresentou (i) um peptídio sinal de secreção N-terminal; (ii) uma sequência sinal de ancoramento por GPI na extremidade C-terminal; (iii) ausência de domínios transmembrana internos. As seqüências foram obtidas no banco de dados genômicos do Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/science/data). Neste estudo, 63 proteínas foram identificadas como GPI-Ps em C. neoformans var. grubii (H99) e 47 em C. gattii (R265). Fosfolipase B1, Endo-1,3 -glucanases, Quitina desacetilases e Glioxaloxidases foram encontradas em ambas as espécies. Estas proteínas já foram previamente descritas como GPI-Ps, demonstrando que a metodologia empregada no estudo mostrou-se eficiente. As proteínas identificadas puderam ser, de maneira geral categorizadas funcionalmente, destacando-se aquelas envolvidas na biogênese e remodelamento da parede celular. Aproximadamente 70% das proteínas identificadas em ambas espécies não têm função conhecida, algumas tendo homólogas com outras proteínas fúngicas e outras sendo únicas da espécie. A identificação dessas proteínas será de extrema importância na elucidação de aspectos relacionados à patogênese e servirá de modelo para outras doenças causadas por fungos. / The Cryptococcus neoformans species Complex includes the Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii yeasts. These basidiomycete yeasts can cause disease in immunocompromised and immunocompetent patients, respectively. Notably in fungus, glicosylphosphatidilinositol-anchored proteins (GPI-Ps) are involved in different aspects of host-pathogen interaction, such as host cells adhesion and invasion, host immune response modulation and evasion and pathogenesis. In this work, we performed a systematic, genome-wide in silico identification of C. neoformans complex species GPI-Ps. A set of prediction tools was apllied for the screening of 6967 and 6210 predicted protein sequences from C. neoformans var. grubii (H99 strain) an C. gattii (R265 strain), respectively. The sequences were retrieved from the Broad Institute genome database (http://www.broadinstitute.org/science/data). The identification of putative GPI-Ps was based on the following criteria: i) the presence of an N-terminal signal peptide for secretion; ii) the presence of a C-terminal GPI-attachment site and iii) absence of internal transmembrane domains. A total of 63 putative GPI-Ps were identified in C. neoformans var. grubii and 47 proteins were identified as GPI-P in C. gattii. Proteins previously described as GPI-anchored, such as Phospholipase B1, Endo-1,3--glucanases, Chitin deacetylases and Glyoxaloxidases were identified in both species C. neoformans var grubii and C. gattii. The proteins identified could be classified in several functional categories, especially those involved in cell wall biogenesis and remodeling. About 70% of the GPI-Ps identified have unknown functions. Many of the putative GPI-Ps do not display conserved domains, but some possess have fungal orthologs homólogs while others are currently unique to specie. The GPI-P identification in Cryptococcus neoformans species complex is of extreme importance for elucidating aspects related to the pathogenesis and will serve as a model for others fungal diseases.

Interações patógeno-hospedeiro geram alterações em diversos mecanismos, tanto no hospedeiro quanto no patógeno. Neste contexto, nas células do sistema imune do hospedeiro ocorre modulação para impedir o desenvolvimento de patógenos, culminado em sua eliminação, como no caso de infecções por Cryptococcus neoformans. Macrófagos alveolares constituem o primeiro tipo celular a responder à levedura, a qual, após a fagocitose, é capaz de se proliferar e disseminar no hospedeiro. Como mecanismo de defesa, células hospedeiras podem reduzir a concentração de micronutrientes essenciais para o patógeno, mecanismo conhecido por imunidade nutricional. Zinco (Zn) é o segundo metal de transição mais abundante e um micronutriente essencial para todos os organismos e, com isto, macrófagos podem responder a patógenos com redução dos níveis de Zn para auxiliar na eliminação de patógenos. A fim de avaliar se macrófagos respondem com privação de Zn a a fungos, a alteração na homeostase de Zn em macrófagos infectados por C. neoformans foi avaliada bem como a influência da ativação celular nesta resposta. Demonstramos que macrófagos respondem com privação de Zn à infecção por C. neoformans uma vez que ocorreu (i) diminuição nos níveis intracelulares de Zn livre em macrófagos infectados com a levedura viável, (ii) redução na expressão de importadores do metal, (iii) redução nos níveis de Zn livre em leveduras após exposição a macrófagos, (iv) aumento na proliferação no interior de macrófagos e diminuição da taxa de exocitose de C. neoformans em condições de disponibilidade de Zn. Tal modulação de Zn na resposta a C. neoformans foi exercida por alguns transportadores de Zn que respondem significativamente a condições de privação de Zn, principalmente os da família ZnT, e a privação de Zn como mecanismo de imunidade nutricional foi evidente em macrófagos ativados com IFN- e LPS. Macrófagos ativados com PMA não mostraram redução nos níveis intracelulares de Zn em reposta a C. neoformans ou modulação significativa nos níveis de transcritos de transportadores de Zn, como ZIP2 e ZnT7, em comparação a macrófagos ativados com IFN- e LPS. Além disso, de forma geral, macrófagos ativados continham maiores níveis intracelulares de Zn livre em comparação a macrófagos não ativados, sugerindo modulação do processo de ativação na homeostase de Zn em macrófagos J774.A1. / Host-pathogen interactions cause alterations on several mechanisms in both host and pathogen. In this context, host immune system cells are modulated to prevent pathogens growth, aiding in their elimination, as it occurs during Cryptococcus neoformans infections. Alveolar macrophages are the first cell type to respond to yeast infection. Once phagocytosed, cryptococcal cells are capable to proliferate and disseminate in the host. As a defense mechanism, host cells can reduce essential micronutrients concentration to the pathogen, a mechanism known as nutritional immunity. Zinc (Zn) is the second most abundant transition metal and an essential micronutrient for all organisms and thus, macrophages may respond to pathogens with reduced levels of Zn to aid pathogens elimination. In order to evaluate whether macrophages respond with Zn deprivation to fungi, alterations on Zn homeostasis in C. neoformans-infected macrophages was evaluated as well as the influence of cellular activation in this response. We demonstrate that macrophages respond with Zn deprivation to C. neoformans infection, as we could observe (i) a reduction of free intracellular Zn levels in macrophages infected with viable yeast, (ii) a reduced expression of Zn importers, (iii) a decreased free Zn concentration in yeasts exposed to macrophages, (iv) increased yeast proliferation within macrophages and decreased yeast exocytosis under Zn rich conditions. This Zn modulation in response to C. neoformans was exerted by some Zn transporters which respond significantly to Zn deprivation conditions, especially those of the ZnT family, and Zn deprivation as a nutritional immunity mechanism was evident in IFN- and LPS-activated macrophages. PMA-activated macrophages showed no reduction in intracellular Zn levels in response to C. neoformans or a significant modulation in Zn transporters transcript levels, such as ZIP2 and ZnT7, in comparision to IFN-- LPS-activated macrophages. In addition, in general, activated macrophages contained increased free intracellular Zn levels in comparision to non-activated macrophages, suggesting activation process modulation on Zn homeostasis in J774.A1 macrophages.

A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-09-13T15:57:01Z No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2013-10-03T11:53:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T11:53:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FabianafreireMendesOliveira.pdf: 3550004 bytes, checksum: 479e0f87b52423d1bb6907da07bbdbdc (MD5) / O advento de pacientes portadores do HIV e de pacientes imunocomprometidos provocou um aumento na incidência de micoses fúngicas, como a criptococcose. Existem várias classes de antifúngicos disponíveis comercialmente para o tratamento dessas infecções que são utilizadas de acordo com a patologia e o patógeno. No entanto, são relatados casos de resistência a essas drogas e existe uma grande preocupação em relação aos efeitos adversos que elas podem causar nos pacientes. Nesse contexto, o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas poderia ser uma solução para a problemática atual das drogas disponíveis e isso requer o estudo de novos alvos moleculares. O gene ERG6 codifica a enzima esterol C-24 metiltransferase que atua na conversão de zimosterol em fecosterol. Constitui uma etapa que ocorre em fungos para a biossíntese do ergosterol, mas não ocorre nos hospedeiros animais, que possuem enzimas específicas para a conversão do zimosterol até colesterol. No presente trabalho, a função do gene ERG6 foi investigada e caracterizada no fungo Cryptococcus neoformans demonstrando que a ausência desse gene gera diversas alterações fenotípicas, tais como sensibilidade ao estresse osmótico, ao estresse oxidativo e maior susceptibilidade a diferentes drogas antifúngicas. Além disso, foi ainda observado que a capacidade de crescer em meios contento diferentes estressores de parede se mostra alterada. Em relação aos fatores de virulência conhecidos para C. neoformans, o fungo foi incapaz de crescer a temperatura de 37°C, porém não teve sua produção de cápsula ou melanina afetadas. No entanto, em testes para observação da sua capacidade de virulência in vitro utilizando macrófagos e in vivo com lagartas da espécie Galleria mellonella mostraram uma redução na virulência em mutantes de ERG6. Por fim a análise dos esteróis de membrana mostrou que ocorre uma alteração em toda a composição de esteróis da membrana celular. Dessa forma, por ser uma enzima encontrada principalmente em fungos, a Erg6 pode ser um alvo molecular potencial para drogas antifúngicas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The advent of HIV patients and immunocompromised patients caused an increase in the incidence of fungal mycoses, such as cryptococcosis. There are several antifungal agents commercially available for the treatment of such infections that are chosen based on the disease and the pathogen. However, cases of resistance are reported to these drugs and there is great concern about the adverse effects that they can cause on patients. In this context, the development of new antifungal drugs could be a solution to the current problem of the available drugs and it requires the study of potential molecular targets. The gene ERG6 encodes the sterol C-24 methyltransferase, an enzyme that acts on the conversion zimosterol in fecosterol. This is a step that occurs in fungi in the ergosterol biosynthesis, but does not occur in the animal hosts which have specific enzymes for the conversion of zymosterol to cholesterol. In this study, gene function of ERG6 was investigated and characterized in the Cryptococcus neoformans demonstrating the absence of this gene generates several phenotypic changes, such as sensitivity to osmotic stress, oxidative stress and increased susceptibility to different antifungal drugs. Furthermore, it was also observed that the ability to grow on media with different cell wall stressors was also altered. It was observed that the lack of ERG6 greatly affects the permeabillity of the membrane resulting in osmotic and oxidative stress sensitivity and changing antifungal drugs susceptibility. Furthermore, it was also observed that the ability to grow in medium with cell wall stressor was altered. About the virulence factor, C. neoformans was unable to grow at 37°C, but it had not affected the production of melanin or capsule. However, virulence tests in vitro with macrophages and in vivo with Galleria mellonella caterpillars showed a decrease in the virulence of ERG6 mutants. Finally, the membrane sterols analysis demonstrated a change in the membrane sterol composition. Thus, being an enzyme found especially fungi, the Erg6 may be a potential molecular target for antifungal drugs.