Orientador: Francisco Leydson Formiga Feitosa / Banca: Luiz Cláudio Nogueira Martins / Banca: Maurício Garcia / Resumo: Foram coletadas 460 amostras de fezes de cordeiros com até 30 dias de vida com o objetivo de determinar a ocorrência de Cryptosporidium na região de Araçatuba, assim como as espécies envolvidas nesta parasitose. Realizou-se análise microscópica pela técnica de coloração negativa com verde malaquita em todas as amostras de fezes. Para a identificação molecular de Cryptosporidium, nas amostras positivas à microscopia, utilizou-se a reação de nested PCR, com amplificação de fragmentos da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico ou do gene da actina. Encontraram-se 6,73% dos animais eliminando oocistos de Cryptosporidium nas fezes. A espécie e genótipo envolvidos foram: Cryptosporidium parvum e genótipo cervídeo que representam potencial zoonótico e Cryptosporidium parvum tipo B. Foram coletadas também 191 amostras de sangue de cordeiros com até 30 dias de vida com o objetivo de determinar as concentrações séricas de imunoglobulina G, PT, γ globulina, GGT e FA, assim como determinar a associação entre estas variáveis. Foi avaliada se a atividade sérica das enzimas GGT e FA pode ser utilizada indiretamente como indicadora de transferência de imunidade passiva. Para tanto, foram realizados os testes de imunodifusão radial, espectrofotometria e eletroforese respectivamente. Para os valores de GGT e FA, foram utilizados kits comerciais. Houve correlação estatística significativa entre a FA e GGT; fato também observado com relação a PT, a IgG e a GGT. A γ globulina mostrou-se correlacionada com GGT, IgG e PT. A atividade de FA demonstrou-se ineficaz para uso como indicadora de transferência de imunidade passiva. / Abstract: A total of 460 fecal samples were collected from lambs during the first 30 days of life with the aim to determine the occurrence of Cryptosporidium in Araçatuba region, as well as to identify species involved in this parasitism. Microscopic analysis of feces was carried out using malachite green negative stain. Cryptosporidium positive samples were subjective to a nested PCR, with amplification of fragments of the subunity 18S of the gene of the ribossomic RNA or the gene of the actin. In this study 6.73% of animals were eliminating oocists of Cryptosporidium in their feces. The involved species and genotype were: Cryptosporidium parvum and cervide genotype, which represent a zoonotic potential and Cryptosporidium parvum type B. Blood samples (191) were collected from lambs that were up to 30 days old to determine the serum concentrations of immunoglobulin G, TP, γ globulin, GGT and ALP, as well as to determine the association between these variables. This was done in order to explore the possibility of using changes in activities of GGT e ALP as indirect indicators of immune passive transfer in lambs The following tests were perfomed: radial immunodiffusion, spectrophotometry and electrophoresis respectively. GGT and ALP values were determinate using commercial kits. There was a statistically significant correlation between ALP and GGT. The same correlation was observed from TP, IgG and GGT. A positive γ globulin correlation was found between GGT, IgG and TP. ALP activity cannot be used as an indicator of immune passive transfer. / Mestre

Este estudo objetivou identificar a prevalência de cistos de Giardia sp. e oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras de fezesde cães do município de Porto Alegre. As amostras foram analisadas através do método de Faust e cols, para pesquisa de Giardia e esfregaços de fezes corados com Zieh-Neelsen para pesquisa de Cryptosporidium. Foram comparadas as prevalências destes parasitos entre duas populações de cães: cães com proprietário provenientes de comunidades econômica e socialmente vulneráveis de Porto Alegre cães errantes recolhidos ao canil municipal. Foram avaliadas também as prevalênciasem duas faixas etárias: filhotes (idade até 12 meses) e adultos (12 meses ou mais) e quanto ao sexo. Através da aplicação de um questionário epidemiológico algumas variáveis ambientais e de manejo, como acesso à via pública, convivência com outros animais no domicílio e higiene do ambiente onde o animal vive, também puderam ser avaliadas. Das 454 amostras de fezes de cães examinadas, 18,5 %, apresentaram cistos de Giardia, não sendo identificada diferença significativa entre os cães com e sem proprietário. Na pesquisa de Cryptosporidium a prevalência foi de 6,34% nas 410 amostras analisadas. A prevalência encontrada em cães com proprietário foi maior 9,85 % do que os cães de rua 2,89 %. Comparando as faixas etárias, ambos os parasitos apresentaram maior ocorrência em filhotes, 32,65% positivo para Giardia e 11, 36% para Cryptosporidium. Quanto ao sexo não houve diferença significativa em ambos os parasitos. Na análise de variáveis ambientais e de manejo, foi observado que a convivência com outros animais no domicílio e o acesso à via pública não se constituíam como fator de risco para a ocorrência de ambos os parasitos estudados. No entanto, a condição de higiene do domicílio apresentou significativa associação com a ocorrência de cistos de Giardia, que não foi observado na ocorrência de oocistos de Crytposporidium spp. A prevalência de ambos os parasitos em cães assintomáticos coincide com o que é apresentado na bibliografia, que nos cães o significado patogênico das infecções por Giardia e Cryptosporidium é pequeno. Animais assintomáticos podem eliminar cistos de Giardia e oocistos de Cryptoporidium em quantidade significativa, no presente estudo (18,5% e 6,34 %, respectivamente) podendo atuar como fonte de infecção para outros animais, contaminando o ambiente e podendo, em situações especiais, vir a contaminar seres humanos (transmissão zoonótica). / This study aimed at identifying the prevalence of cysts of Giardia sp. and oocysts of Cryptosporidium spp. in dogs of the municipality of Porto Alegre. The samples were analyzed by the method of Faust et al for the search of Giardia and fecal smear stained by Zieh-Neelsen technique for the search of Cryptosporidium. The prevalence of these parasites was compared between two populations of dogs: dogs with owners from economically and socially vulnerable communities of Porto Alegre and wandering dogs which had been taken to the Municipal Kennel. It was also evaluated the prevalence of the parasites in two age groups - puppies (age up to 12 months) and adults (12 months or more), and regarding their sex. By applying an epidemiological survey, some environmental and handling variables, such as management, access to public roads, coexistence with other animals at home and the hygiene of the place where the animals live could also be assessed. Of the 454 dog feces samples examined, 18,5%showed cysts of Giardia, not being identified significant differences between tne dogs with and without owners. In the search of Cryptosporidium the prevalence was of 6,34% of the 410 samples analyzed. The prevalence in dogs with owners was 9,85 % greater than in the street dogs 2,89%. Comparing the age groups , both parasites showed greater occurrence in puppies, 32,65% positive for Giardia and 11,36 % for Cryptosporidium. Regarding sex, there was no significant difference for both parasites. In the analysis of environmental and handling variables it was noted that the coexistece with other animals at home and the access to public roads did not constitute a risk factor for the occurrence of both parasites studied . However, the condition of hygiene of the domicile presented significant association with the occurrence of cysts of Giardia, which was not observed in oocysts occurence of Cryptosporidium. The prevalence of both parasites in asymptomatic dogs coincides with what it is found in the bibliography tha in dogs the pathogenic infection by Giardia and Cryptosporidium is small. Asymptomatic animals can eliminate cysts of Giardia and oocystis of Cryptosporidium in significant amount. In this study, 18,5% and 6,34%, respectively and they can act as a source of infection to the other animals, contaminating the environment which may, in special cases, come to infect human beings (zoonotic transmission).

Made available in DSpace on 2018-08-24T22:53:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_3674_Marcus Ocorrencia de oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia em sistemas de abastecimento de agu.pdf: 2228950 bytes, checksum: d34171fd8e0650c28dbd8418a531464d (MD5) Previous issue date: 2009-07-17 / Os protozoários Cryptosporidium parvum e Giardia lamblia têm emergido como principais causadores de doenças veiculadas à água, tanto em países desenvolvidos quanto naqueles em desenvolvimento. A presença destes parasitos em água tem chamado a atenção das organizações internacionais de saúde para uma intervenção nos padrões de qualidade da água para abastecimento público. Os cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium são resistentes às pressões ambientais, podendo sobreviver por vários meses no ambiente aquático, além resistir ao cloro no processo convencional de desinfecção. A pesquisa foi realizada no período de abril de 2008 a março de 2009, e teve como objetivo avaliar a ocorrência de Giardia e Cryptosporidium em dois sistemas de tratamento de água da região da Grande Vitória, no Estado do Espírito Santo. O sistema Carapina (A) tem duas opções de tratamento na mesma planta, filtração direta e flotofiltração, sendo esta última operada em situações de turbidez > 30 uT na água bruta. O sistema Vale Esperança (B) possui duas linhas independentes de tratamento, uma por filtração direta e outra por tratamento convencional. As técnicas de concentração de protozoários por floculação com CaCO3 e filtração em membranas foram avaliadas através de testes de eficiência relativa em diferentes matrizes (água bruta, filtrada e destilada), para definir qual técnica apresenta melhor desempenho na recuperação dos protozoários. A floculação foi melhor para Giardia (48,30%), mas semelhante à filtração na recuperação de Cryptosporidium (p > 0,05), sugerindo que em pesquisas dos dois protozoários na mesma amostra deve-se utilizar a floculação com CaCO3. Os cistos e oocistos foram visualizados por imunofluorescência direta e contraste de fase. Os dois mananciais estudados não apresentaram diferenças no nível de contaminação dos protozoários (p > 0,05). O tratamento convencional teve o melhor desempenho na remoção dos protozoários, pois não foi detectada a presença dos parasitos no seu efluente filtrado. Na água filtrada da flotofiltração identificou-se a maior freqüência de cistos (50,00%) e oocistos (66,67%). No efluente da filtração direta do sistema B, Giardia e Cryptosporidium foram detectados em 16,67% e 41,67% das amostras, respectivamente. A flotofiltração e a filtração direta do sistema B apresentaram turbidez > 0,5 uT na água filtrada em 100% e 58,33% das amostras, respectivamente. No efluente da filtração direta do sistema A não foram identificados oocistos de Cryptosporidium, somente cistos de Giardia em 16,67% das amostras. Na água tratada dos reservatórios não se detectou os parasitos, porém os resultados podem estar subestimados devido às limitações das técnicas de detecção. A remoção dos protozoários por flotofiltração variou de 1,00 a 2,36 log e na filtração direta nos sistemas A e B ficou entre 0,39 e 1,91 log sendo que na maioria dos meses não foi possível enquadrar a eficiência de remoção na recomendação feita pela USEPA (3,0 log para Giardia e 2,0 log para Cryptosporidium) devido à concentração encontrada em água bruta e o limite de detecção dos métodos. Correlações significativas foram observadas na água bruta, entre os protozoários e os parâmetros turbidez, coliformes totais, E.coli, cor verdadeira e aparente. O presente trabalho foi importante para mostrar a real situação dos sistemas de tratamento de água na região da Grande Vitória, ES, quanto à remoção de protozoários patogênicos, evidenciando a importância do monitoramento de Giardia e Cryptosporidium em águas destinadas ao abastecimento público.

La criptosporidiosis es una infección protozoaria de distribución mundial, ocasionada por diversas especies del Genero Cryptosporidium, que se evidencia con cuadros de diarrea en animales jóvenes, en niños recién nacidos y humanos inmunosuprimidos. Sin embargo, su presencia también se reporta en individuos asintomáticos. El objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia de Cryptosporidium spp. en alpacas machos reproductores del Centro Experimental La Raya, Cusco. El diseño del trabajo incluyó el muestreo de la totalidad de los machos reproductores del Centro Experimental La Raya (n=156). Las muestras de heces se fijaron con metanol y se colorearon con el método de Ziehl Neelsen Modificado, para detectar la presencia de Cryptosporidium. Los resultados fueron analizados para determinar la prevalencia. Se encontró que la prevalencia corregida de Cryptosporidium andersoni fue de 53.1% y la de Cryptosporidium parvum-like fue de 18.5%. Se concluye que Cryptosporidium andersoni y Cryptosporidium parvum-like son los agentes que parasitan a las alpacas machos reproductores y que la prevalencias encontradas de Cryptosporidium spp. fueron altas comparadas con otros estudios en camélidos sudamericanos

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario

The apicomplexan Cryptosporidium is a protozoan parasite of humans and other mammals. Cryptosporidium species cause acute gastro-enteritis and diarrheal disease in healthy humans and animals, and cause life-threatening infection in immuno-compromised individuals such as people with AIDS. It has a one-host life cycle and invades intestinal epithelial cells causing diarrhea, or more rarely the pulmonary epithelium. Cryptosporidium carries out all the asexual reproductive stages like several other apicomplexans. Current annotation of this organism predicts it to contain 3884 genes of which only 1581 genes have predicted functions. By using a combination of bioinformatics analysis, biochemical evidence, and high-throughput data, a genome-scale metabolic model of Cryptosporidium hominis is being constructed. The current model is comprised of approximately 213 gene-associated enzymes involved in major metabolic pathways including carbohydrate, nucleotide, amino acid, and energy metabolism. The approach of constructing a genome-scale model provides a link between the genotype and the phenotypic behavior of the organism, making it possible to study and predict behavior based upon genome content. This modeling approach provides an overview for evaluating missing components in a metabolic network and provides an analytical framework for interpreting data as more research becomes available. The goal of constructing this model is to systematically study and analyze various functional behaviors of C. hominis with respect to its stages in life cycle and pathogenicity.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Cryptosporidium spp, es un protozoo causante de diarrea en bovinos, principalmente terneros. El objetivo del estudio fue comparar la inhibición de la Reacción en Cadena de la Polimerasa para Cryptosporidium spp en muestras de DNA obtenidas desde dos métodos de extracción, y determinar su efecto en la positividad y rendimiento diagnóstico. Se procesaron 40 muestras de heces de terneras de planteles lecheros de la Región Metropolitana, Chile. Todas las muestras eran positivas para Cryptosporidium spp según técnica Ziehl Neelsen modificada. De cada muestra se realizó extracción mediante los métodos cloroformo-fenol y kit ZR Fecal DNA Miniprep, Zymo Research®. La Reacción en Cadena de la Polimerasa fue positiva en 32 (80%) y 40 (100%) de las muestras de DNA extraídas mediante cloroformo-fenol y kit Zymo® respectivamente. En las ocho muestras extraídas mediante cloroformo-fenol que no amplificaron a la Reacción en Cadena de la Polimerasa para Cryptosporidium, se realizó una Reacción en Cadena de la Polimerasa control para descartar la presencia de inhibidores, resultando solo una de estas muestras inhibida. No hubo diferencias significativas al comparar la inhibición de la prueba molecular según cada método de extracción. El DNA (ng/μL) obtenido de extraídos mediante kit Zymo® fue mayor en el 95% de las muestras, en relación a cloroformo-fenol, siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p≤0,05). Los resultados sugieren la importancia de realizar una Reacción en Cadena de la Polimerasa control de inhibición en muestras que no amplifiquen, evitando informar falsos negativos. / Proyectos Fondecyt 1121035, 1110255 Y U. de Chile-DI-MULT 06/17-2.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El presente estudio tuvo como objetivo pesquisar Cryptosporidium spp. y Giardia spp. en mamíferos terrestres del Buin Zoo muestreados durante el período 2013-2014. Se realizó un muestreo censal estacional de recintos de ungulados, carnívoros y primates, obteniéndose un total de 204 muestras fecales, cada una correspondiente a un pool de heces obtenidas de tres días alternos; las cuales fueron procesadas en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, mediante tinción de Ziehl-Neelsen modificado y Telemann modificado. 47 muestras fecales resultaron positivas a algún parásito (23,04%), siendo los carnívoros principalmente infectados (51,06%); y Giardia spp. mayormente encontrado (significativo en invierno y verano). Se encontró monoparasitismo en 91,49% de las muestras positivas y aquellas con ambos parásitos fueron sólo de carnívoros. Las variaciones estacionales encontradas para cada parásito no fueron estadísticamente significativas, pero al analizarse sin corrección de continuidad, se obtuvo como resultado que las muestras de ungulados y primates positivas a Giardia spp. fueron menos abundantes durante las estaciones frías que en verano. Esta es la primera descripción de Cryptosporidium spp. en leones africanos y tigres de bengala, así como también de Giardia spp. en pudúes, nyalas, jirafas, suricatas y monos tití cabeza algodón. Se concluye que hubo presencia de estos agentes parasitarios en el zoológico durante todo el periodo 2013-2014, lo que es relevante debido al posible riesgo zoonótico que conlleva, recomendándose así la implementación de un programa de control y prevención, con énfasis en vías de transmisión parasitaria

A criptosporidiose já foi descrita em várias espécies animais, incluindo várias espécies de aves. É considerada uma das principais infecções por protozoários em aves das ordens Anseriformes, Charadriformes, Columbiformes, Galliformes, Passeriformes, Psittaciformes e Struthioniformes. Três espécies de Cryptosporidium infectam aves: Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium galli e Cryptosporidium meleagridis, além de vários genótipos distintos geneticamente, como os genótipos I, II, III, IV e V de aves. Cryptosporidium galli e Cryptosporidium genótipo III de aves estão relacionados com infecções crônicas no proventrículo, de forma semelhante à infecção por Cryptosporidium serpentis, em serpentes. Vários métodos de diagnóstico são utilizados para detecção do parasito, mas somente aqueles com base em biologia molecular são capazes de determinar a espécie de Cryptosporidium. O projeto teve com objetivo o desenvolvimento da PCR duplex em tempo real, tendo como alvo o gene da subunidade 18S do rRNA, por meio de ensaio TaqMan, para detecção de DNA de C.galli e Cryptosporidium genótipo III de aves, e avaliar os atributos diagnósticos da PCR duplex em tempo real quando comparada à nested PCR, utilizando 1027 amostras fecais de aves das ordens Passeriformes e Psittaciformes. A PCR duplex em tempo real apresentou positividade em 580/1027 (56,47%) para C. galli, enquanto que a nested PCR resultou em positividade para Cryptosporidium spp. em 104/1027 (10,13%) amostras. Para Cryptosporidium genótipo III de aves, houve positividade em 21/1027 (2,04%). A PCR duplex em tempo real resultou em alta especificidade analítica quando foram utilizadas amostras de DNA de outras espécies e genótipos de Cryptosporidium. A única exceção foi a amplificação de DNA de C. serpentis, com a utilização de primers e sonda para detecção de Cryptosporidium genótipo III de aves, porém, com uma baixa eficiência de amplificação. Foram identificados novos hospedeiros aviários para ambas as espécies gástricas, assim como foi possível a identificação de C. baileyi e, pela primeira vez no Brasil, de Cryptosporidium genótipo V de aves. Conclui-se que a PCR duplex em tempo real desenvolvida neste estudo é um recurso que apresenta rapidez e confiabilidade para diagnóstico de criptosporidiose gástrica em aves / Cryptosporidiosis has been described in several animal species, including many species of birds, and is considered a major protozoan infection of the orders Anseriformes, Charadriformes, Columbiformes, Galliformes, Passeriformes, Psittaciformes and Struthioniformes. Three species of Cryptosporidium are valid in birds: Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium meleagridis and Cryptosporidium galli; beside these species, there are several genotypes genetically distinct, as avian genotypes I, II, III, IV and V. Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III are related to chronic infections in proventriculus, similar to Cryptosporidium serpentis infection in snakes. Several methods are used for cryptosporidiosis diagnosis, but only those based on molecular biology are able to determine the Cryptosporidium species and genotypes. The aim of this project was the development of a duplex real-time PCR targeting 18S subunit of rRNA gene, by TaqMan assay, to detect DNA of C. galli and Cryptosporidium avian genotype III, and to evaluate the diagnostic attributes of the duplex real-time PCR compared to nested PCR, using 1027 fecal samples from birds of the orders Passeriformes and Psittaciformes. The duplex real time PCR showed positivity in 580/1027 (56.47%) for C. galli, whereas nested PCR was positive for Cryptosporidium spp. in 104/1027 (10.13%) samples. For Cryptosporidium avian genotype III, there was positivity in 21/1027 (2.04%) samples. The duplex real time PCR resulted in high analytical specificity when tested using DNA samples from other Cryptosporidium species and genotypes. The only exception was the amplification of DNA from C. serpentis with primers and probe for the detection of Cryptosporidium avian genotype III, although with lower efficiency. New avian hosts were identified for both gastric species, as well as it was possible to identify C. baileyi and, for the first time in Brazil, Cryptosporidium avian genotype V. It was concluded that the duplex real time PCR developed in this study is a fast and reliable tool for diagnosis of gastric cryptosporidiosis in birds.

Cryptosporidium parvum is a deadly waterborne protozoan parasite that invades the gastrointestinal tract of humans and causes severe to life-threatening gastro enteric disease. Due to the ubiquitous nature of Cryptosporidium parvum in the world’s water, it is necessary to determine the source of an outbreak. Rapid detection and identification of various genotypes of Cryptosporidium are a valuable goal in determining the source of the pathogen in a human epidemic. Exploitation of gene sequences specific to species is a powerful tool detecting pathogens. Molecular beacons are one of these tools for high selectivity and specificity detection of DNA and RNA. Molecular beacon is a single strand of DNA that forms a stem and loop structure, where the stem holds the DNA together and the loop detects a target sequence. This molecular beacon detection is determined by the changes of fluorescent emissions of fluorescent dye linked to the ends of the stem. In this thesis work, a new and novel molecular beacon was designed to detect the specific sequences from the heat shock protein gene of Cryptosporidium parvum that infects humans. This probe is synthesized by the conjugation of pyrene molecules to both ends of the stem which leads to a unique feature of pyrene excimer-monomer switching molecular beacon upon the hybridization of the loop sequence with the target DNA sequence. This thesis systematically investigates the physical binding (e.g., quantum yield) and thermodynamic properties, including enthalpy, entropy, and free energy of this excimer-monomer switching molecular beacon in the presences of complimentary, mismatched, and damaged DNA, respectively, in the three phases: phase one is the molecular beacon in the stem and loop structure, phase two is the molecular beacon hybridized to its target DNA, and phase three is the molecular beacon in a random coil. The effect of magnesium concentration on the binding and thermodynamic properties was also investigated. Finally, as a comparison, a conventional fluorescence resonance energy transfer-based molecular beacon with a fluorophore at the 5’ end and quencher at the 3’ end was used to assess selectivity and sensitivity in detection of DNA-DNA hybridization.