La dystrophie musculaire facioscapulohumérale (FSHD) est une maladie autosomique dominante, caractérisée par une faiblesse et une atrophie progressive de certains muscles squelettiques. La FSHD est liée à une répression inefficace de la région des macrosatellites D4Z4 sur le chromosome 4, entraînant l'expression inappropriée dans le muscle squelettique, d’un gène à double homeobox 4 (DUX4), et la dérégulation des gènes avoisinants. La surexpression de DUX4 est responsable du phénotype atrophié des myotubes FSHD et induit la dérégulation de gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant. Malgré les avancés majeures dans la compréhension du locus morbide, les mécanismes exacts impliqués dans la FSHD ne sont pas totalement compris et aucun traitement curatif n’est disponible. Cependant, de nombreuses données montrent le rôle prépondérant du stress oxydant dans la FSHD. Récemment, nous avons caractérisé la présence d’un stress oxydant dans les biopsies musculaires et les prélèvements sanguins des patients atteints de FSHD. Nous avons démontré que ce stress est corrélé à une altération de la fonction musculaire chez ces patients et qu’une supplémentation en antioxydants adaptée améliore la fonction musculaire et réduit les dommages oxydatifs. Par ailleurs, nous avons démontré que les myoblastes dérivés des biopsies FSHD sont plus sensibles à des agents pro-oxydants et présentent des défauts de différenciation. L’objectif de nos travaux est de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la FSHD afin de faciliter la mise en place d’approches thérapeutiques. Ce projet de thèse original réunit à la fois une approche fondamentale et clinique.Grâce à la mise en place d’un nouveau modèle in vitro de culture primaire de myoblastes de patients atteints de FSHD, nous avons montré la présence d’un stress oxydant dans ces myoblastes corroborant les observations précédemment obtenues aux niveaux systémiques et musculaires chez ces patients. Par ailleurs, les traitements par des agents pro-oxydants (paraquat et peroxyde d'hydrogène) ont un effet différentiel sur l’expression des enzymes antioxydantes par rapport aux contrôles suggérant un défaut dans les mécanismes d'adaptation au stress oxydant chez les patients atteints de FSHD.D’autre part, afin d'améliorer les procédures de réadaptation pour les patients atteints de FSHD, nous avons proposé d'étudier la faisabilité, la sécurité et l'efficacité de l’entraînement de force par électrostimulation neuromusculaire (ESNM) pour contrer la faiblesse musculaire des quadriceps chez ces patients. Cette étude, en cours, semble être une stratégie de réhabilitation prometteuse pour les patients atteints de FSHD et n’a montré aucun effets indésirables jusqu’à présent. / Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is an autosomal dominant disease, characterized by progressive weakness and atrophy of specific skeletal muscles. FSHD is linked to an inefficient repeat-mediated epigenetic repression of the D4Z4 macrosatellite repeat array on chromosome 4, resulting in the unappropriated expression in skeletal muscle of the double homeobox 4 (DUX4) retrogene. DUX4 overexpression leads to atrophic myotubes phenotype and dysregulation of antioxidant genes. Despite major progress in the understanding of the genetic locus, exact mechanisms that lead to FSHD defects are not completely understood and no curative treatment is available. However, several lines of evidence have proposed oxidative stress and myogenesis defect as the major biological processes affected in FSHD. Recently, we characterized oxidative stress in skeletal muscle biopsies and blood samples from patients with FSHD. We demonstrated that oxidative stress is associated with reduced physical performance in patients with FSHD and that antioxidants adapted strategy was effective to reduce oxidative stress and maintain muscle functions. Furthermore, satellite cell-derived myoblasts from these patients were more susceptible to pro-oxidant agents than control myoblasts and showed a defect in differentiation. The originality of this project relies on creating a synergy between basic and clinical research. The major goal of this work is to identify molecular mechanisms involved in FSHD oxidative stress in order to identify therapeutic approaches.Using in vitro cell model of FSHD, recently developed and optimized in our team, we demonstrate the presence of oxidative stress in FSHD primary myoblast cultures that corroborates previous observations at systemic and muscular levels. Furthermore, treatments with different pro-oxidant agents (paraquat and hydrogen peroxide) have a differential effect on the expression of antioxidant enzymes compared to controls, suggesting a defect in the oxidative stress adaptive response in FSHD myoblasts.Furthermore, in order to improve rehabilitation procedures for patients affected with FSHD, we proposed to investigate the feasibility, safety, and effectiveness of neuromuscular electrostimulation (NMES) strength training to counteract quadriceps muscle weakness in these patients. This ongoing study appears to be a promising rehabilitation strategy and shows no adverse effect for patients with FSHD.

Le récepteur cannabinoique de type 1 (CB1R) est l’un des récepteurs couplés aux protéines G les plus abondants du cerveau mammifère. CB1R a longtemps été décrit comme un récepteur présynaptique régulant de manière rétrograde la transmission synaptique. Cependant, depuis les vingt dernières années, de nouveaux rôles ont été découverts et il est maintenant clairement admis que l’action des endocannabinoides (eCBs) ne se limite pas à la régulationde la neurotransmission au niveau de synapses adultes déjà établies. En effet, les eCBs et le CB1R sont des acteurs majeurs de l’ensemble des phases du développement cérébral. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués n’ont toujours pas été identifiés. Les mécanismes cellulaires auxquels nous nous intéressons ne dépendant pas de l’environnement cellulaire, nous proposons donc de combiner la puissance génétique du modèle drosophile à l’accessibilité et la haute résolution offerte par la culture primaire de neurones. De plus, le récepteur CB1 ne possédant pas d’orthologue parmi les invertébrés, ce système offre la possibilité d’étudier la biologie du récepteur en s’affranchissant de la machinerie endocannabinoide. Cependant, actuellement, aucun protocole de culture primaire de neurones de drosophile ne permet d’obtenir des cellules hautement différenciées et polarisées à basse densité. Ainsi, nous avons tout d’abord développé, optimisé et validé un nouveau protocole permettant de d’obtenir des neurones fonctionnels, hautement différenciés et polarisés en culture de basse densité. Dans un second temps, nous avons démontré que l’activation durécepteur CB1, exprimé ectopiquement dans les neurones de drosophile, entrainait son internalisation, de manière identique à ce qui avait déjà été observé chez les mammifères. Puis, nous avons étudié l’effet de l’expression et de l’activation ectopique de CB1R sur le développement neuronal chez la drosophile. Ainsi, nous avons démontré que l’activation du récepteur module directement la dendritogénèse. Afin de compléter la caractérisation de notremodèle, nous avons démontré que l’activation transitoire du récepteur dans les corps pédonculés (le centre de la mémoire olfactive chez la drosophile) altérait spécifiquement la formation d’une forme consolidée de mémoire après un conditionnement aversif. En conclusion, la validation du modèle drosophile dans l’étude de la biologie cellulaire durécepteur CB1 ouvre de nouvelles perspectives quant à la détermination des mécanismes moléculaires régissant l’action du récepteur sur le fonctionnement neuronal. / The type-1 cannabinoid receptor (CB1R), the neuronal receptor for the major psychoactive substance of marijuana, is one, of the most abundant G-protein coupled receptors in the mammalian central nervous system. CB1R is traditionally described as a presynaptic receptor that retrogradely regulates synaptic transmission. In addition to this now relatively wellcharacterized function, in the last two decades it has become widely recognized that endocannabinoid (eCB) actions in the brain are not limited to the regulation of neurotransmission at established adult synapses. Indeed, eCB and CB1R are now recognized to be involved in brain development at the synaptic, neuronal and network levels. However, precise mechanisms underlying these processes remain poorly described. Since cellular mechanisms that mediate CB1R-activition dependent neuronal remodeling and subneuronal targeting have been demonstrated to be cell-autonomous, we aimed to combine the power of Drosophila genetics with the experimental accessibility and single-cell resolution of lowdensity primary neuronal cultures, a tool currently lacking in Drosophila. Moreover, becauseDrosophila does not have a CB1R ortholog, CB1R cell biology may be observed independently from eCB machinery. Thus, we first developed and validated an in vitro culture protocol that yields mature and fully differentiated Drosophila neurons. Secondly, we showed that activation-dependent endocytosis of ectopically expressed CB1R is conserved in Drosophila neurons. Next, we investigated whether ectopic expression and activation of CB1R in Drosophila modulate neuronal development. As observed in mammals, we observed that activation of CB1R impairs dendritogenesis in a cell-autonomous manner. For further characterization of our model, we showed that, as with mammals, transient ectopic CB1R expression and activation in mushroom body neurons (the center of olfactory memory in Drosophila) modulate the formation of a consolidated form of aversive memory. In conclusion, the validation of this new animal model opens new perspectives to better characterize mechanisms underlying modulation of neuronal functions induced by CB1Ractivity

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La survenue d’un cancer du sein découvert durant la grossesse est un événement dramatique compliquant entre 1/3000 et 1/10000 grossesses, ce qui en fait le cancer le plus fréquemment rencontré chez la femme enceinte. Sur le plan thérapeutique, certaines molécules anticancéreuses peuvent être utilisées, notamment les taxanes (paclitaxel et docétaxel). Si les études cliniques rétrospectives isolées semblent plutôt rassurantes, les données concernant leur passage transplacentaire sont encore fragmentaires. Quant à leurs effets sur le placenta humain et plus particulièrement sur la fonction de transport placentaire, ils sont pour l’heure inconnus. Nos objectifs étaient de 1) dresser une cartographie de l’expression génique physiologique des différents transporteurs placentaires de médicaments en utilisant un modèle de culture primaire trophoblastique, 2) d’apprécier le passage transplacentaire comparatif des taxanes et leur accumulation placentaire en utilisant le modèle du cotylédon perfusé, 3) d’étudier plus particulièrement les effets du paclitaxel sur le placenta humain et notamment sur l’expression des transporteurs de médicaments, en utilisant en plus des modèles mentionnés, les cotylédons de patientes ayant été traitées par paclitaxel durant leur grossesse. Nos études ont tout d’abord permis de dresser une cartographie originale de l’expression physiologique de plus de 80 transporteurs placentaires de médicaments, et ce comparativement entre le début et la fin de la gestation. De plus, nos expériences ont montré que le passage transplacentaire des taxanes était faible et comparable entre les deux molécules, et que celles-ci semblaient s’accumuler dans les cotylédons placentaires. Enfin, nous avons pu mettre en évidence un effet significatif du paclitaxel sur le placenta humain, notamment sur la modulation de certains transporteurs de médicaments. / The occurrence of breast cancer during pregnancy is a dramatic event reaching roughly 1/3000 to 1/10000 pregnancies, this type of cancer being the most frequent in pregnant women. Regarding therapeutic options, some anticancer agents may be used, especially taxanes (paclitaxel and docetaxel). If most of retrospective data appear to be reassuring, little is known regarding their transplacental transfer. Moreover, to our knowledge, potential effects of taxanes on human placenta, especially on placental transport function are unknown. Our aims were to 1) provide a transcriptional expression cartography of various placental drug transporters throughout pregnancy, using primary trophoblast culture model, 2) assess the comparative transplacental transfer of taxanes and their accumulation in cotyledons, using the perfused placental model, 3) assess potential effects of paclitaxel on human placenta, especially on drug transporter expression, not only using above-described models, but also cotyledons from pregnant-cancer patients treated with paclitaxel during pregnancy. Here, we finally provided an original transcriptional cartography of various drugs transporters in human normal placenta all along pregnancy. Moreover, we found a low and comparable transplacental transfer of paclitaxel and docetaxel that led to a moderate accumulation in cotyledons. Finally, we evidenced a significant effect of paclitaxel on human placenta, especially by modulating drug transporter expression.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative du système nerveux central qui se caractérise notamment par l’accumulation de peptide beta-amyloïde (Aβ) dans le tissus nerveux. Dans la première partie de cette thèse nous avons montré que l’interaction des oligomères Aβ1-42 de haut poids moléculaire avec la membrane plasmique des cellules PC12 différenciées ou des cellules nerveuses (neurones et astrocytes primaires) provoque des variations de la [Ca2+]i dépendant de l’activation des récepteurs NMDA. Dans la seconde partie nous avons montré qu’une pré-exposition des cellules PC12 et des cellules nerveuses à de faibles concentrations de peptide Aβ module l’interaction ultérieure des oligomères avec la membrane plasmique. Enfin dans le cadre d’une collaboration avec l’entreprise Innovative Health Diagnostics (IHD) nous avons participé à la caractérisation d’une sonde amyloïde fluorescente développée pour réaliser des tests de détection de la MA à partir d’échantillons sanguins. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disease of the central nervous system which is characterized in particular by the accumulation of beta amyloïde peptide (Aβ) in nerve tissues. In the first part of this thesis we showed that the interaction of high molecular weight Aβ1-42 oligomers with the plasma membrane of differenciated PC12 or nerve cells (neurons and astrocytes) triggers variations of their depending on the activation of the NMDA receptors. In the second part we showed that a pre-exposure of PC12 and nerve cells with low concentrations Aβ1-42 of modulates the later interaction of oligomers with the plasma membrane. Finally in collaboration with the company Innovative Health Diagnostics (IHD) we participated in the characterization of a fluorescent amyloid probe developed to realize detection test of AD from blood samples.

La bioingénierie de greffons endothéliaux cornéens est une des solutions réalistes en cours de développement dans quelques laboratoires pour palier au grand déséquilibre entre pénurie mondiale de dons de cornée et besoins immenses et croissant des populations. Cette véritable médecine régénérative consistera à injecter des cellules endothéliales (CEs) dans la chambre antérieure aux stades précoces des dystrophies endothéliales et, pour les stades avancées des pathologies endothéliales, à reconstruire in vitro des greffons endothéliaux composés d'un support transparent et biocompatible colonisé par une monocouche des CEs. Dans les 2 cas, la première étape obligatoire est la production de masse de CEs ou de "CE-like". Dans ce travail, nous avons exploré les différentes possibilités pour obtenir suffisamment de CEs fonctionnelles pour envisager des applications cliniques : 1- L'expansion de CEs natives prélevées sur des cornées de donneurs, ou culture primaire, se heurtent aux capacités prolifératives limitées des CEs in vitro. Un des prérequis étant la compréhension des mécanismes d'arrêt de la prolifération des CEs humaines, nous avons fait la synthèse bibliographique des connaissances sur leur cycle cellulaire et leur sénescence, et présentons 2 articles originaux: le premier utilise un microarray spécifique de 112 gènes de contrôle du cycle cellulaire pour comparer les profils transcriptionnels des CEs de 6 modèles biologiques comportant théoriquement un stimulus prolifératif croissant: in vivo, post mortem, organoculture, culture primaire confluente, culture primaire non confluente et lignée immortalisée. Nous identifions de nombreux acteurs impliqués dans l'arrêt du cycle, en particulier ceux impliquant une réponse à des dommages oxydatifs de l'ADN. Le second article explore les capacités prolifératives résiduelles des CEs de donneurs âgés de plus de 50 ans, sont les plus nombreux en Europe et donc les pourvoyeurs habituels de CEs pour la bioingénierie. Nous montrons qu'une optimisation des techniques de culture permet d'obtenir in vitro une mosaïque endothéliale de 2000 cellules/mm2. Enfin, un troisième article montre qu'un stimulus physique inattendu constitué d'un train d'impulsion électrique permet d'obtenir un très grand nombre de figures mitotiques mais uniquement dans des zones de faible DCE, démontrant encore une fois l'importance majeur de l'inhibition de contact dans l'arrêt prolifératif. 2- La sélection et l'expansion, par culture en sphère, des progéniteurs endothéliaux de la périphérie endothéliale pourrait être un moyen de contourner la sénescence de la majorité des CEs. La synthèse bibliographique montre que la plupart des travaux publiés émanent d'une seule équipe japonaise. Dans notre second article, nous avons montré l'existence de rares "label-retaining cells" dans les cornées de donneurs âgés, qui pourraient correspondre à ces progénieteurs. Nous avons aussi montré qu'il était possible d'obtenir des sphères avec ces donneurs. 3- La différenciation de cellules souches embryonnaires, mésenchymateuses ou des cellules pluripotentes induites est enfin la troisième voie qui pourrait permettre de produire des CEs en grand nombre. La méthode d'induction de la différenciation pourrait reproduire le schéma physiologique et désormais bien caractérisé de formation de l'endothélium à partir du mésenchyme périoculaire dérivé de la crête neurale et que nous rappelons au début de notre mémoire bibliographique. Nous rappelons également les méthodes utilisables pour caractériser les cellules obtenues: vérification de leur identité par immunomarquage d'un panel de protéines caractéristique (en absence de marqueur unique spécifique) et vérification de leur fonctionnalité par mesures de leurs capacités de pompage ionique, au minimum de façon indirecte sur chambre d'électrophysiologie de type Ussing, au mieux de façon directe en quantifiant la déturgescence d'une cornée humaine conservée dans le bioréacteur breveté du BiiGC / Corneal endothelial engineering is becoming a more and more realistic solution to restore vision from corneal edema. This method focus to regenerate corneal endothelium by direct injection of corneal endothelial cells (ECs) into patient anterior chamber at the early stage of endothelial dystrophies, or by grafting a transparent biocompatible material covered by a monolayer of ECs. These two techniques require both in vitro isolation and amplification of ECs or endothelial-like cells. In this thesis, different strategies to obtain a high quantity of functional ECs for clinical application are explored: 1- Due to the limit proliferative capacity of EC, the first strategy consists to analyze mechanisms implicated EC cell cycle arrest and then to optimize protocol for native EC isolation or for cell proliferation activation ex vivo. This is summarized in three publications. The first publication describes the cell cycle regulation by comparing transcriptional expression of 112 genes in 6 biological models of EC with different proliferative profile: in vivo, postmortem, organ-culture, confluent primary culture, non confluent primary culture and immortalized cell line. , The key molecular actors identified using the combining microarray analysis and gene ontology methods are consistent with previous findings about oxidative DNA damage mechanism. The second publication characterizes EC differentiation process and its impact on EC proliferative capacity in old donor corneas. Analyses of differentiation/progenitor markers and of proliferative capacity underline the differentiation process of EC from the centre to the peripheral corneal endothelium. Thereby, an optimized culture protocol was developed, allowing the formation of high-density monolayer (> 2000 cells/mm2) with stable endothelial morphology. We proved the possibility to make profit from a majority of old-donor cornea grafts invalidated for penetrating graft In the third publication, the activation of endothelial cell cycle by electric pulses directly in corneal graft was characterized. We confirm the activation of endothelial cell cycle at different phases but also the damage of tissue during electroporation. 2- Second strategy consists of the amplification of ECs from potential EC progenitors. Using sphere forming culture and a new method to detect slow-cycling cells, we demonstrate the existence of "young" ECs population with higher proliferative capacity in corneal periphery. The isolation of ECs by sphere formation is one possible step for ECs selection in vitro. 3- The differentiation of embryonic stem cells, mesenchymal stem cells or induced pluripotent stem cells into corneal endothelial cells is the third approach considered by our laboratory. The manipulation of stem cells differentiation would be based on the molecular mechanisms implicated in the formation of corneal endothelium from periocular mesenchymal cells described in the first part of the bibliography. Finally, in order to validate the quality of endothelial cell mass obtained, we revisited recent methods for the evaluation of corneal endothelial identity (immunolocalisation of specific markers), for the measurement of pump activity of cell monolayer (Ussing chamber, perfusion chamber) or directly in deswelled cornea using the bioreactor patented by the BiiGC laboratory