Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Tours : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Les maladies cardiovasculaires apparaissent précocement au cours de l'insuffisance rénale chronique (IRC) et représentent la première cause de mortalité. La 1ère étape pour apprécier la relation entre risque cardiovasculaire et progression de l'IRC consiste à améliorer l'estimation du débit de filtration glomérulaire (DFG). Nous avons donc évalué l'impact des conditions analytiques de mesure de la créatininémie et de la cystatinémie sur l'estimation du DFG. Les créatinines IDMS traçables (enzymatique et Jaffe compensé) améliorent l'estimation du DFG. Cependant, les méthodes enzymatiques non sensibles aux pseudochromogènes doivent être préférées. Concernant la cystatine C, nos résultats soulignent l'absence de standardisation du dosage. Chez des patients IRC non dialysés (stade I à V), nous avons identifié l'ostéoprotégérine (OPG) comme marqueur biologique de la présence de calcifications vasculaires. In vitro, nous avons démontré que le stress oxydant, majoré en présence de sérum urémique, jouait un rôle clé dans la transdifférenciation des cellules musculaires lisses vasculaires en ost oblastes. La mortalité en dialyse reste élevée et est largement dépendante des maladies cardiovasculaires. Il nous a donc paru nécessaire de rechercher les marqueurs pronostics et/ou d'en suivre l'évolution en transplantation. En dialyse, malgré une épuration significative par hémodiafiltration, les peptides natriurétiques sont des marqueurs du remodelage ventriculaire. La combinaison "NT-proBNP-CRP" est un puissant facteur pronostic de mortalité cardiovasculaire en hémodialyse. Après transplantation rénale, les calcifications vasculaires se stabilisent chez la majorité des patients et les taux d'OPG diminuent précocement. Les taux d'OPG sont significativement plus élevés chez les patients dont les calcifications progressent. Toutefois, seule l'intensité des calcifications avant transplantation permet de prédire la progression / Cardiovascular disease occurs in the early stage of chronic kidney disease (CKD) and is the leading cause of death. The first step, to appreciate the link between cardiovascular risk and CKD progression, is to improve glomerular filtration rate (GFR) estimation. We have therefore evaluated the impact of analytical conditions for creatinine and cystatin C measurement on estimated GFR. New creatinine ID-MS traceable methods (enzymatic and compensated Jaffe) improved estimation of GFR by predictive equations. However, enzymatic methods that are much less susceptible to interfere with non-creatinine chromogens may provide more reliable estimations of GFR. Regarding cystatin C, our results highlighted the lack of standardization. In non dialyzed CKD patients (stage I to V), we identified osteoprotegerin (OPG) as a biomarker for the presence of vascular calcification. In vitro, we demonstrated that oxidative stress, increased in the presence of uremi c serum, played a key role in the transdifferentiation of vascular smooth muscle cells into osteoblast-like cells. In dialysis, mortality is high and largely dependant on cardiovascular disease. We have therefore investigated prognostic markers and/or followed their evolution after transplantation. In dialysis, despite their removal by hemodiafiltration, natriuretic peptides could be potential markers of left ventricular remodelling. In addition, the combination of high CRP and circulating NT-proBNP dramatically impaired the hemodialysis survival rate. After renal transplantation, stabilization of vascular calcification was observed in the majority of patients and OPG levels are dramatically reduced. Despite a higher baseline OPG level in progressors vs. non-progressors patients, post transplant vascular calcification progression was only predicted by baseline score.

L'hyménoptère Cotesia congregata (Microgastrinae ; Braconidae) pond ses oeufs à l'intérieur de son hôte, la chenille du lépidoptère Manduca sexta (Noctuidae ; Sphingidae) et introduit des particules virales de bracovirus contenant 30 cercles d'ADN double brin. Les gènes viraux portés par ces cercles codent pour une série de protéines qui sont produites dans les tissus de la chenille parasitée. Ces protéines virales jouent un rôle indispensable à la réussite parasitaire. En effet, l'expression des gènes viraux entraîne de nombreuses altérations de la physiologie de l'hôte, notamment un contournement de l'immunité de la chenille qui permet le développement des larves du parasite. D'autre part, le développement de l'hôte est bloqué à un stade pré-pupal. Les travaux portant sur la caractérisation des génomes de bracovirus ont beaucoup progressé et plusieurs familles de gènes ont été découvertes. Une synthèse des connaissances actuelles sur l'immunité des insectes et les gènes de bracovirus potentiellement impliqués dans le contrôle de l'immunité et du développement des lépidoptères est présentée en introduction.<br />Au cours de ma thèse, le séquençage et l'analyse du génome du bracovirus de Cotesia congregata ont été réalisés (Espagne et al 2004). L'existence de plusieurs familles multigéniques a été mise en évidence, notamment la famille des protéines tyrosines phosphatases (PTP) composée de 27 gènes (Provost et al 2004), la famille des cystatines composée de 3 gènes (Espagne et al soumis) et enfin celle des protéines à motif ankyrine composée de 6 gènes (Pennacchio et al en préparation). La caractérisation détaillée de la famille des PTP a été effectuée. La technique d'électrophorèse en champs inversés (FIGE) a permis la localisation physique de ces gènes sur l'ensemble du génome viral, et leur expression a été analysée dans une série de tissus de l'hôte parasité grâce à une méthode de PCR multiplex. Enfin, des tests d'activité biochimique de PTP de bracovirus produites in vitro grâce à un système d'expression en baculovirus.<br />Les gènes des familles décrites sont exprimés dans l'hôte parasité et les protéines possèdent, en général, la fonction biochimique prédite grâce aux domaines conservés qu'elles contiennent. Ceci suggère que ces protéines virales jouent un rôle actif dans les modifications de la physiologie de l'hôte induite par le parasitisme. La caractérisation des gènes viraux exprimés dans l'hôte est une étape indispensable vers l'identification du rôle individuel de chaque protéine dans le contrôle de la physiologie des chenilles parasitées.

Lors de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), la différenciation fibroblastique s’accompagne d’une accumulation excessive des composants de la matrice extracellulaire ainsi qu’à un dérèglement de la balance protéases / antiprotéases. Nous avons étudié le rôle des cathepsines à cystéine dans la myofibrogenèse et leur contribution potentielle à la physiopathologie de la fibrose pulmonaire chez l’Homme. Pour cela, le profil d’expression des cathepsines ainsi que de leurs inhibiteurs naturels a été évalué dans un modèle cellulaire expérimental, puis dans des myofibroblastes primaires et enfin dans des liquides de lavage broncho-Alvéolaires (LBA) de patients atteints de FPI. Nos résultats montrent que lors de la FPI la cystatine C (inhibiteur naturel des protéases à cystéine) régule les activités protéolytiques des cathepsines extracellulaires et pourrait ainsi contribuer à l’accumulation de collagènes. Elle serait un biomarqueur potentiel de la FPI. D’autre part la cathepsine B participe à la différentiation fibroblastique et son inhibition retarde la myofibrogenèse. / During idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), fibroblast differentiation is accompanied by an excessive accumulation of extracellular matrix components as well as an imbalance between proteases and theirs inhibitors. We evaluated the role of human cysteine cathepsins in myofibrogenesis and their potential contribution to the pathogenesis of IPF. Expression of cathepsins and their natural inhibitors have been studied in an experimental cell model, but also in primary myofibroblasts and in bronchoalveolar lavage fluids (BALF) of patients suffering from IPF. Our results show that cystatin C (a natural inhibitor of cysteine proteases) regulates the extracellular proteolytic activities of cathepsins and could contribute to the accumulation of collagens. Cystatin C could also be a potential biomarker of IPF. On the other hand, cathepsin B participates in fibroblast differentiation and its inhibition delays myofibrogenesis.

Les associations mutualistes, en permettant l'acquisition de nouvelles fonctions, ont joué un rôle majeur dans l'évolution des espèces. Pour comprendre en quoi ces associations sont impliquées dans l'adaptation des espèces nous avons étudié un cas unique de mutualisme associant un virus de type polydnavirus et une guêpe parasitoïde. Dans cette association, le virus est injecté dans l'hôte lépidoptère lors de l'oviposition et joue un rôle majeur dans le succès parasitaire en induisant une altération des fonctions physiologiques de l'hôte. En regard du nombre d'espèces de guêpes caractérisées par cette association, le virus doit constituer une innovation adaptative majeure et jouer un rôle déterminant dans l'évolution et la diversification des espèces de guêpes. En quoi cette association joue t-elle un rôle déterminant dans l'évolution et l'adaptation des guêpes ? Quelles sont les fonctions physiologiques ciblées chez l'hôte ? Pour répondre à ces questions nous avons étudié l'évolution de deux familles de gènes codant pour des facteurs de virulence potentiels et nous avons exploré les fonctions physiologiques d'une protéine potentiellement ciblée lors du parasitisme. Nous avons mis en évidence le rôle important de la sélection naturelle dans l'évolution des familles de gènes viraux. Par modélisation de la structure tridimensionnelle d'un facteur de virulence codant pour des cystatines, nous avons montré que cette sélection agissait préférentiellement au niveau des sites d'interaction avec les protéines cibles. De plus, cette étude souligne le caractère dynamique de l'évolution des facteurs de virulence incluant de multiples évènements de duplication, caractérisés par des processus de perte et d'acquisition au cours de l'évolution de l'association. Le caractère adaptatif et dynamique de l'évolution des gènes viraux a aussi été étudié en regard de l'évolution des espèces de guêpes et de leur spectre d'hôte. Par une approche fonctionnelle, nous avons étudié le rôle physiologique de protéases à cystéine qui constituent des cibles potentielles des cystatines virales. Nous avons montré que ces protéases sont régulées spécifiquement au cours du parasitisme au niveau protéique et transcriptionnel. Nous avons également montré que l'activité de ces protéases est modifiée après parasitisme. L'évolution adaptative et dynamique des facteurs de virulence reflètent leur rôle important dans le parasitisme. Il reste maintenant à montrer comment ces facteurs interagissent sur la physiologie de l'hôte lépidoptère. Des protéases à cystéine sont spécifiquement ciblées par le parasitisme, en étudiant les mécanismes d'interaction de ces protéases avec les cystatines virales et les processus coévolutifs mis en jeu, nous

L'amertume fait partie intégrante de notre alimentation. Elle est par exemple fortement représentée dans certaines boissons (ex: café) ou dans certains légumes tels les crucifères. Néanmoins, la perception de l'amertume varie entre les individus et certains aliments considérés comme bénéfiques pour la santé peuvent être rejetés en raison de leur goût amer. Des facteurs génétiques (ex : polymorphisme génétique des récepteurs du goût amer) ou environnementaux (ex : âge, prise de médicaments) expliquent en partie les variations interindividuelles dans la perception de l'amertume. Cependant, d'autres facteurs péri-récepteurs pourraient intervenir, notamment la composition salivaire. Afin d'investiguer dans un premier temps le lien existant entre le protéome salivaire propre à un individu et sa sensibilité à l'amertume, le seuil de détection du goût amer de la caféine a été mesuré sur 29 hommes sains. Leur salive au repos a été étudiée par électrophorèse mono- et bidimensionnelle. L'analyse par électrophorèse bidimensionnelle de la salive au repos des 6 sujets les plus sensibles et 6 les sujets les moins sensibles à la caféine a permis la détection de 255 spots, dont 26 étaient significativement différents entre hyper- et hyposensibles. L'identification de ces 26 spots a révélé la surexpression de fragments d'alpha amylase, de fragments d'albumine sérique, et de sous-unités alpha de l'immunoglobuline A ainsi que la sous-expression de cystatine SN chez les hypersensibles. Ce dernier résultat a été confirmé par Western Blot. Ceci a permis de formuler une hypothèse sur le rôle de la protéolyse en bouche sur la sensibilité à l'amertume. Dans un deuxième temps et afin d'étudier l'effet des molécules amères sur la composition salivaire, une étude in vitro a été menée sur la lignée cellulaire de glandes salivaires humaines HSG différenciées en acini ou non. Après une mise au point des conditions de différenciation (culture dite en 3D), la cystatine SN a été détectée dans les cellules HSG par Western blot après traitement des cellules à la caféine, à la quinine, et à l'urée. Après traitement à la caféine à 5, 50 ou 100µM, une quantification par ELISA a mis en évidence que la cystatine SN était toujours plus abondante dans les cellules HSG différenciées que dans les cellules non-différenciées. Spécifiquement dans les cellules différenciées, l'exposition à la caféine induisait une sur-expression de cystatine SN, la teneur maximale en cystatine SN étant observée avec la caféine à 50 µM. La présence de cystatine SN a également été détectée dans les milieux de culture

Les glandes salivaires sont des glandes mixtes : la salive (produit exocrine) estimpliquée dans le maintien de l'homéostasie buccale alors que les secrétions endocrines (ex :facteurs de croissance) ont un rôle physiologique (gamétogénèse, ostéogenèse,hypertension...) Chez les mammifères, elles affichent un dimorphisme sexuel qui laisseentrevoir une sensibilité éventuelle à des xeno-hormones.Ce mémoire présente l'action de la génistéine (phyto-oestrogène) et/ou de la vinclozoline(anti-androgène) sur la glande submandibulaire (SM) de rat lors d'une exposition précoce viala mère (gestation-lactation) et lors d'une exposition pendant la période de croissance (dusevrage à l'âge adulte). Les glandes SM, prélevées au stade immature et jeune adulte, ont faitl'objet d'une analyse histologique et d'une étude de marqueurs moléculaire des fonctionsendocrines et exocrines associées aux processus gustatifs. L'exposition précoce ralenti ledéveloppement de la glande SM et augmente sélectivement la préférence au sucré des malesimmatures mais pas des adultes ; l'analyse moléculaire révèle une action sélective sur lesfonctions exocrines corrélée à celle sur les préférences, ainsi qu'une action sur les fonctionsendocrines (facteurs de croissances) qui s'inverse avec l'âge. L'exposition à partir du sevrageperturbe seulement les mâles qui présentent des altérations des structures sécrétrices coupléesà des modifications d'expression des récepteurs hormonaux et facteurs de croissance, maisaussi au taux sérique de l'EGF.Cette étude identifie la glande submandibulaire comme cible de perturbateurs endocriniens etpose la question des conséquences physiologiques à terme

L’amertume fait partie intégrante de notre alimentation. Elle est par exemple fortement représentée dans certaines boissons (ex: café) ou dans certains légumes tels les crucifères. Néanmoins, la perception de l’amertume varie entre les individus et certains aliments considérés comme bénéfiques pour la santé peuvent être rejetés en raison de leur goût amer. Des facteurs génétiques (ex : polymorphisme génétique des récepteurs du goût amer) ou environnementaux (ex : âge, prise de médicaments) expliquent en partie les variations interindividuelles dans la perception de l’amertume. Cependant, d’autres facteurs péri-récepteurs pourraient intervenir, notamment la composition salivaire. Afin d’investiguer dans un premier temps le lien existant entre le protéome salivaire propre à un individu et sa sensibilité à l’amertume, le seuil de détection du goût amer de la caféine a été mesuré sur 29 hommes sains. Leur salive au repos a été étudiée par électrophorèse mono- et bidimensionnelle. L’analyse par électrophorèse bidimensionnelle de la salive au repos des 6 sujets les plus sensibles et 6 les sujets les moins sensibles à la caféine a permis la détection de 255 spots, dont 26 étaient significativement différents entre hyper- et hyposensibles. L’identification de ces 26 spots a révélé la surexpression de fragments d’alpha amylase, de fragments d’albumine sérique, et de sous-unités alpha de l’immunoglobuline A ainsi que la sous-expression de cystatine SN chez les hypersensibles. Ce dernier résultat a été confirmé par Western Blot. Ceci a permis de formuler une hypothèse sur le rôle de la protéolyse en bouche sur la sensibilité à l’amertume. Dans un deuxième temps et afin d’étudier l’effet des molécules amères sur la composition salivaire, une étude in vitro a été menée sur la lignée cellulaire de glandes salivaires humaines HSG différenciées en acini ou non. Après une mise au point des conditions de différenciation (culture dite en 3D), la cystatine SN a été détectée dans les cellules HSG par Western blot après traitement des cellules à la caféine, à la quinine, et à l’urée. Après traitement à la caféine à 5, 50 ou 100µM, une quantification par ELISA a mis en évidence que la cystatine SN était toujours plus abondante dans les cellules HSG différenciées que dans les cellules non-différenciées. Spécifiquement dans les cellules différenciées, l’exposition à la caféine induisait une sur-expression de cystatine SN, la teneur maximale en cystatine SN étant observée avec la caféine à 50 µM. La présence de cystatine SN a également été détectée dans les milieux de culture / Bitterness is present in every day beverages (e.g. coffee) and foods (e.g. vegetables such as cruciferous plants). However, bitterness is perceived differently among individuals and some foods considered as healthy may be rejected due to their bitter taste. Several genetic (eg. genetic polymorphism of bitter taste receptors) or environmental (eg. age, medications) factors partly explain the interindividual variability in bitterness perception. However, other peri-receptor factors may intervene, in particular salivary composition. First, in order to investigate the link between salivary proteome and sensitivity to bitterness, the detection threshold to the bitter taste of caffeine was measured in 29 male healthy subjects. Their resting saliva was studied by one- and two-dimensional electrophoresis. Two-dimensional electrophoresis revealed that 26 out of 255 spots were significantly different between the 6 hypersensitive and 6 hyposensitive subjects to the bitter taste of caffeine. Identification of the 26 spots revealed an overexpression of amylase-, serum albumin-, and immunoglobulin A fragments, and an underexpression of cystatin SN in hypersensitive subjects. The latter finding was confirmed by Western blotting. These results have led to formulate an hypothesis on the role of in-mouth proteolysis in bitterness perception. Second, in order to study the effect of bitter molecules on salivary composition, an in vitro study was performed on undifferentiated and differentiated human salivary cell line HSG. After setting the experimental conditions for HSG cell differentiation (culture in 3D conditions), cystatin SN was detected in HSG cells by Western blot after treatment with caffeine, quinine, and urea. After cell exposure with caffeine at 5, 50 and 100 µM, quantification by ELISA demonstrated that cystatin SN was always more abundant in differentiated vs undifferentiated HSG cells. Specifically in differentiated cells, caffeine exposure resulted in over-expression of cystatin SN, 50µM inducing the highest effect. Cystatin SN was also detected in culture media of the HSG cells

Les glandes salivaires sont des glandes mixtes : la salive (produit exocrine) estimpliquée dans le maintien de l’homéostasie buccale alors que les secrétions endocrines (ex :facteurs de croissance) ont un rôle physiologique (gamétogénèse, ostéogenèse,hypertension…) Chez les mammifères, elles affichent un dimorphisme sexuel qui laisseentrevoir une sensibilité éventuelle à des xeno-hormones.Ce mémoire présente l’action de la génistéine (phyto-oestrogène) et/ou de la vinclozoline(anti-androgène) sur la glande submandibulaire (SM) de rat lors d’une exposition précoce viala mère (gestation-lactation) et lors d’une exposition pendant la période de croissance (dusevrage à l’âge adulte). Les glandes SM, prélevées au stade immature et jeune adulte, ont faitl’objet d’une analyse histologique et d’une étude de marqueurs moléculaire des fonctionsendocrines et exocrines associées aux processus gustatifs. L’exposition précoce ralenti ledéveloppement de la glande SM et augmente sélectivement la préférence au sucré des malesimmatures mais pas des adultes ; l’analyse moléculaire révèle une action sélective sur lesfonctions exocrines corrélée à celle sur les préférences, ainsi qu’une action sur les fonctionsendocrines (facteurs de croissances) qui s’inverse avec l’âge. L’exposition à partir du sevrageperturbe seulement les mâles qui présentent des altérations des structures sécrétrices coupléesà des modifications d’expression des récepteurs hormonaux et facteurs de croissance, maisaussi au taux sérique de l’EGF.Cette étude identifie la glande submandibulaire comme cible de perturbateurs endocriniens etpose la question des conséquences physiologiques à terme / The salivary glands are mixed glands: saliva (exocrine product) is involved inmaintaining oral homeostasis whereas endocrine secretions (eg growth factors) have aphysiological role (gametogenesis, osteogenesis, hypertension ..). In mammals, they displaysexual dimorphism suggesting a possible susceptibility to xeno-hormones.This manuscript presents the action of genistein (phytoestrogen) and/or vinclozolin (antiandrogenic)on the submandibular gland (SM) rats when performing an early exposure via themother (pregnancy, lactation) or an exposure during the growth period (from weaning toadulthood). The SM glands, collected at immature and young adult ages, have been analyzedaccording histological aspect and expression of molecular markers of endocrine and exocrinefunctions associated with gustatory process. The early exposure disrupted the development ofthe SM gland and selectively increases the sweet preference in immature males but not inadults; molecular analysis reveals a selective action on exocrine functions related to the sweetpreferences and also an action on endocrine functions (growth factors) which reverses withage. Exposure from weaning disrupts only the male salivary glands with alterations insecretory structures coupled with changes in expression of both, sex-hormone receptors andgrowth factors, but also in serum EGF.This study identifies the submandibular gland as a target for endocrine disruptors and raisesthe question of the further physiological consequences

Introduction: L’approche endovasculaire pour la réparation d’anévrysmes aortiques s’associe à une utilisation importante de produit de contraste, qui peut causer une néphropathie induite par le produit de contraste (NIC) en postopératoire. L’hydratation intraveineuse peut réduire l’incidence de NIC, mais quel produit utiliser reste incertain. Nous avons évalué le bicarbonate de sodium, comparé au NaCl 0,9%, pour réduire l’incidence de NIC. Méthode: Nous avons mené une étude prospective, randomisée et contrôlée à double insu chez 34 patients subissant une chirurgie endovasculaire pour anévrysme aortique. Les patients des deux groupes (17 patients par groupe) ont reçu du bicarbonate de sodium ou du NaCl 0,9% à raison de 3 mL/kg/h pour une heure avant l’intervention puis 1 mL/kg/h jusqu’à 6 h après la fin de la chirurgie. Tous les patients ont reçu du N-acétylcystéine. L’objectif principal était l’incidence de NIC, définie comme une élévation de plus de 25% de la créatinine sérique 48 h suivant l’exposition au produit de contraste. Des biomarqueurs précoces de lésion rénale ont été mesurés. Résultats: Une NIC s’est développée chez 1 patient (5,88%) appartenant au groupe bicarbonate, comparé à aucun patient (0%) dans le groupe NaCl 0,9% (P = 0,31). Les biomarqueurs de lésion rénale étaient significativement augmentés dans les deux groupes après l’exposition au produit de contraste. Conclusions: Nous avons démontré un faible taux d’insuffisance rénale suivant une chirurgie endovasculaire aortique, que l’hydratation soit effectuée avec du bicarbonate ou du NaCl 0,9%, malgré une élévation des biomarqueurs de lésion rénale. / Background: The endovascular approach for the repair of aortic aneurysm involves the administration of large quantities of contrast media, which can cause contrast-induced nephropathy (CIN) in the post operative period. The only proven strategy to prevent CIN is intravenous hydration, but what type of infusion to use is not clear. We evaluated the efficacy of sodium bicarbonate, compared with NaCl 0.9%, to reduce the incidence of postoperative renal failure. Methods: We conducted a prospective, controlled, double-blind, randomized study in patients presenting for endovascular aortic aneurysm surgery. Patients in group A (n = 17) received sodium bicarbonate 3 mL/kg/h for 1 h before the procedure and then 1 mL/kg/h until 6 h after surgery, whereas patients in group B (n= 17) received the same amount of NaCl 0.9%. All patients received N-acetylcysteine. The primary end point was CIN, defined by serum creatinine greater than 25 % above baseline 48 h post operatively. Biomarkers of renal injury were measured. Results: CIN developed in one patient in the bicarbonate group (5,88%), compared with no patient in the NaCl 0,9% group (0%) (difference 5.88%;95% CI -5.3% to 17.06%, P = 0.31). Interleukin-18, N-acetyl-β-D-glucosaminidase and Kidney Injury Molecule-1 increased significantly in both groups after exposure to contrast media. Conclusions: We demonstrated a low rate of renal failure following endovascular aortic surgery using contrast media, regardless of whether bicarbonate or NaCl 0.9% was used for hydration, despite significant elevation in biomarkers of renal injury.