A atividade de cisteíno proteases (CP) tem sido relacionada a diferentes patologias, como no caso da leishmaniose, doença de Chagas de alguns tipos de câncer. Devido a homologia entre as cisteíno proteases presentes em altos níveis nesses sistemas celulares, foi investigada aqui a importância dessas enzimas para o desenvolvimento e estabelecimento dessas doenças a partir da atividade biológica in vitro de novos inibidores reversíveis de cisteíno proteases. De maneira geral, as substâncias apresentaram relevante atividade inibitória de cisteíno proteases expressas pelos diferentes sistemas celulares, com máximo de inibição de 42% para o Neq0554 em relação à atividade de CP expressas por Leishmania spp. e 76% em relação a atividade de CP expressas por células de câncer de pâncreas. Diferentes níveis de atividade biológica foram observados entre os sistemas celulares, porém todos apresentaram supressão em relação aos parâmetros citostáticos após a inibição da atividade de CP. Quando testados em Leishmania spp. o crescimento celular foi suprimido em pelo menos 67%, com máximo de inibição de 95% para o Neq0551 a 10 μM. Da mesma maneira, em células de câncer de pâncreas, alterações no ciclo celular e supressão dos processos de migração e formação de colônias foram os resultados mais evidentes, comretenção de 50% da capacidade de formação de colônias das células Mia-Paca2 pelo Neq0554 a 10 μM. Já em relação aos protozoários da capa Y de Trypanosoma cruzi os inibidores testados apresentaram interessante seletividade contra os parasitos, em relação à célula hospedeira LLC-MK2, além de promoverem a supressão de cerca de 80% do processo de invasão celular in vitro quando a célula hospedeira foi previamente tratada com 10 μM do inibidor Neq0662 por 2 h antes do processo de infecção. Por fim, a encapsulação do Neq0554 em apoferritina promoveu um incremento na atividade anticancerígena para células de câncer de pâncreas, com IC50 de 79 μM contra > 200 μM em relação às células de fibroblasto, aumentando sua seletividade. De maneira geral, os resultados corroboram a hipótese de a inibição de cisteíno proteases nos sistemas celulares é eficiente para promover efeitos citostáticos, podendo ser utilizada com controle e supressão do desenvolvimento das patologias. Além disso, a atividade de CP nas células de protozoários e câncer de pâncreas apresentou perfil semelhante de ação, no qual inibidores de CP não promoveram a morte em nível significativo das células, mas ressaltaram os efeitos citostáticos em relação ao crescimento celular. / Cysteine proteases (CP) activity has been related to different pathologies, such as leishmaniasis, Chagas disease and some types of cancer. Due to the homology between cysteine proteases expressed by these cellular systems, it was investigated here the importance of these enzymes for the development and establishment of these diseases based on the in vitro biological activity of novel reversible cysteine protease inhibitors. In general, the inhibitor showed a significant inhibitory activity of cysteine proteases expressed by the different cellular systems, with a maximum inhibition of 42% for Neq0554 concerning the CP activity expressed by Leishmania spp. and 76% to CP activity expressed by pancreatic cancer cells. Different profiles of biological activity were observed between the cellular systems, but all substances had significant CP activity suppression, in cytostatic levels after the inhibition of CPA. When the inhibitors were tested against Leishmania spp., the cell growth was suppressed by at least 67%, with maximum inhibition of 95% for Neq0551 at 10 μM. Similarly in pancreatic cancer cells, changes in the cell cycle profile were the most evident results, as well as the suppression of migration and colony formation ability, with 50% retention of the colony development of Mia-Paca2 cells by Neq0554 at 10 μM. In contrast, to protozoa from Trypanosoma cruzi Y strain, the inhibitors tested showed an interesting selectivity against the parasites concerning the host cell LLC-MK2, also promoting the in vitro cell invasion suppression in about 80% when the host cell was pre-treated with Neq0662 10 μM for 2 h. Finally, the encapsulation of Neq0554 promoted an increase in its anticancer activity against pancreatic cancer cells, with IC50 of 79 μM alongside > 200 μM to fibroblast cells, besides increasing its selectivity. In general, the results corroborate the hypothesis that the inhibition of cysteine proteases in the cellular systems is efficient to promote cytostatic effects, being an interesting tool to be used as control and development suppression of some pathologies. Also, CP activity in protozoa cells and pancreatic cancer showed a similar profile of action, in which cysteine protease inhibitors did not promote death at a significant level for the cells, but emphasized cytostatic effects about cell growth.

The arsenal of drugs available for treating Leishmania infections is limited and presents high toxicity. Therefore, new, effective, and less toxic leishmaniasis treatments are still needed. In this work, two series of derivatives, containing a semicarbazone or hydrazide-N- acylhydrazone scaffolds was designed and synthetized as protease inhibitors. From these series, derivatives LASSBio 1483, LASSBio 1705, LASSBio 1707 and LASSBio 1736 highlighted, showing in vitro and in vivo leishmanicidal activities. Thus, these derivatives presented a potent leishmanicidal activity against amastigotes of L. major (IC50 of 1.5 µΜ to LASSBio 1483, 8.5 µΜ to LASSBio 1705 and 1.,9 µΜ to LASSBio 1707) , L. amazonensis (IC50 of 3.5 µΜ to LASSBio 1483 and 84.0 µΜ to LASSBio 1736), L. braziliensis (IC50 of 31.7 µΜ to LASSBio 1483, 8.0 µΜ to LASSBio 1705 and 5.3 µΜ to LASSBio 1736) and L. chagasi (IC50 of 53.3 µΜ to LASSBio 1707 and 57,6 µΜ to LASSBio 1736). Also, the leishmanicidal activity of derivatives LASSBio-1483, LASSBio 1705, LASSBio 1707 and LASSBio 1736 were mediated via induction of apoptosis as evidenced by externalization of phospholipids, despolarization of mitochondrial membrane and elevation of activation of caspases. The ultrastructural morphological effects against the parasite of LASSBio 1483 and LASSBio 1736 against L. chagasi promastigotes were also verified. The treatment of L. amazonensis -infected BALB/c mice with derivatives LASSBio 1483 (effect of 30.5% and 33.3% in infected ear, by p.o and i.p., respectively), LASSBio 1705 1483 (effect of 58.5% in infected ear and 61.1% in lymph node, i.p.), LASSBio 1707 (effect of 56.5% in lymph node, i.p.) and LASSBio 1736 (effect of 53.6% in infected ear, i.p.)or the treatment of L. chagasi - infected hamsters with LASSBio 1707 (effect of 53.6, i.p.)and LASSBio 1736 (effect of 46.0%, i.p.) led to a significant reduction of parasite burden when compared to controls that received PBS. The treatment with these derivatives did not result in hepatic or renal toxicity in these animals models of leishmaniasis. These data make LASSBio 1483, LASSBio 1705, LASSBio 1707 and LASSBio 1736 new lead-candidates against cutaneous and visceral leishmaniasis. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O arsenal de fármacos disponíveis para o tratamento das infecções por Leishmania spp. é limitada e de elevada toxicidade. Portanto, novos tratamentos, eficazes e menos tóxicos para leishmaniose ainda são necessários. Neste trabalho, duas séries de derivados contendo as subunidades semicarbazona ou hidrazida-N-acilhidrazona foram desenhados e sintetizados como inibidores de proteases. A partir destas séries, os derivados LASSBio 1483, LASSBio 1705, LASSBio 1707 e LASSBio 1736 se destacaram, mostrando atividade leishmanicida in vitro e in vivo . Assim, esses derivados apresentaram atividade leishmanicida potente contra amastigotas de L. major (CI 50 de 1,5 µΜ para LASSBio 1483, 8,5 µΜ para LASSBio 1705 e 15,9 µΜ para LASSBio 1707) , L. amazonensis (CI 50 de 3,5 µΜ para LASSBio 1483 e 84,0 µΜ para LASSBio 1736) , L. braziliensis (CI 50 de 31,7 µΜ para LASSBio 1483, 8,0 µΜ para LASSBio 1705 e 5,3 µΜ para LASSBio 1736) e L. chagasi (CI 50 de 53,3 µΜ para LASSBio 1707 e 57,6 µΜ para LASSBio 1736). Além disso, a atividade leishmanicida dos derivados LASSBio 1483, LASSBio 1705, LASSBio1707 e LASSBio 1736 foi mediada via indução de apoptose como evidenciado pela externalização de fosfolipídeos de membrana, despolarização da membrana mitocondrial e ativação de caspases. Os efeitos morfológicos ultra-estruturais de LASSBio 1483 e LASSBio 1736 em promastigotas de L. chagasi também foram verificados. O tratamento de camundongos BALB/c infectados por L. amazonensis com os derivados LASSBio 1483 (efeito de 30,5% e 33,3% na orelha infectada, por v.o. e i.p., respectivamente), LASSBio 1705 (efeito de 58,1% na orelha infectada e de 61,1% no linfonodo, i.p.) , LASSBio 1707 (efeito de 56,5% no linfonodo, i.p.) e LASSBio 1736 (efeito de 38,8% na orelha infectada , i.p.) ou o tratamento de hamsters infectados por L. chagasi com LASSBio 1707 (efeito de 53,6%, i.p.) e LASSBio 1736 (efeito de 46,0%, i.p.), na dose de 30 µmols/kg/dia, levaram a uma redução significativa da carga parasitária quando comparados aos controles que receberam PBS. O tratamento com estes derivados não resultaram em toxicidade hepática ou renal nestes modelos animais de leishmaniose. Estes dados fazem de LASSBio-1483, LASSBio-1705, LASSBio-1707 e LASSBio-1736 novos candidatos a protótipos a fármacos contra leishmaniose cutânea e visceral

Tripanossomas de mamíferos constituem um dos grupos mais complexos da família Trypanosomatidae, abrangendo parasitas com ciclos de vida e estruturas populacionais heterogêneos. De acordo com a diversidade, filogenias baseadas em genes SSUrDNA e gGAPDH segregaram estes parasitas em 4 Clados principais: T. brucei, T. cruzi, T. theileri e T. lewisi. Catepsinas L e B (CATL e CATB), as principais atividades proteolíticas dos tripanossomas, participam não apenas na degradação de proteínas como também em eventos biológicos como diferenciação, invasão celular, virulência e evasão do sistema imune. Comparamos os perfis proteolíticos de enzimas CATL em tripanossomas patogênicos e não patogênicos e também isolamos e sequenciamos os domínios catalíticos dos genes CATL e CATB em diversas espécies dos principais clados. Os resultados provaram a utilidade destes marcadores no diagnóstico e genotipagem de T. cruzi, T. rangeli, T. theileri e T. congolense, assim como na construção de filogenias robustas da família Trypanosomatidae, congruentes com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes of mammals comprise one of the most complex groups of the family Trypanosomatidae, including parasites with heterogeneous life cycles and population structures. According to such diversity, phylogenetic analyzes based on SSUrDNA and gGAPDH genes segregate these parasites in 4 major clades: T. brucei, T. cruzi, T. lewisi and T. theileri. Cathepsins L and B (CATL and CATB), the main proteolytic activities of trypanosomes, are not only involved in protein degradation but also in biological events such as cell differentiation, cell invasion, virulence, and evasion from the immune system. We comparatively analysed the CATL proteolytic profiles in pathogenic and non-pathogenic trypanosomes, and isolated and sequenced the catalytic domains of CATB and CATL genes in several species of the major clades. Our results demonstrated the usefulness of both markers in the diagnosis and genotyping of T. cruzi, T. rangeli, T. congolense and T. theileri as well as in the construction of robust phylogenies of the family Trypanosomatidae, congruent with traditional markers.

Tripanossomas de mamíferos constituem um dos grupos mais complexos da família Trypanosomatidae, abrangendo parasitas com ciclos de vida e estruturas populacionais heterogêneos. De acordo com a diversidade, filogenias baseadas em genes SSUrDNA e gGAPDH segregaram estes parasitas em 4 Clados principais: T. brucei, T. cruzi, T. theileri e T. lewisi. Catepsinas L e B (CATL e CATB), as principais atividades proteolíticas dos tripanossomas, participam não apenas na degradação de proteínas como também em eventos biológicos como diferenciação, invasão celular, virulência e evasão do sistema imune. Comparamos os perfis proteolíticos de enzimas CATL em tripanossomas patogênicos e não patogênicos e também isolamos e sequenciamos os domínios catalíticos dos genes CATL e CATB em diversas espécies dos principais clados. Os resultados provaram a utilidade destes marcadores no diagnóstico e genotipagem de T. cruzi, T. rangeli, T. theileri e T. congolense, assim como na construção de filogenias robustas da família Trypanosomatidae, congruentes com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes of mammals comprise one of the most complex groups of the family Trypanosomatidae, including parasites with heterogeneous life cycles and population structures. According to such diversity, phylogenetic analyzes based on SSUrDNA and gGAPDH genes segregate these parasites in 4 major clades: T. brucei, T. cruzi, T. lewisi and T. theileri. Cathepsins L and B (CATL and CATB), the main proteolytic activities of trypanosomes, are not only involved in protein degradation but also in biological events such as cell differentiation, cell invasion, virulence, and evasion from the immune system. We comparatively analysed the CATL proteolytic profiles in pathogenic and non-pathogenic trypanosomes, and isolated and sequenced the catalytic domains of CATB and CATL genes in several species of the major clades. Our results demonstrated the usefulness of both markers in the diagnosis and genotyping of T. cruzi, T. rangeli, T. congolense and T. theileri as well as in the construction of robust phylogenies of the family Trypanosomatidae, congruent with traditional markers.