Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert is a native forest species with many possible uses, with great potential for commercial plantations. However, there is little information on the production of seedlings of this species, which, together with the inherent limitations of tree species, impedes the setting of breeding programs and, therefore, the establishment of stands of appropriate genetic quality. Studies related to the Peltophorum dubium propagation by tissue culture techniques can help in this regard. Therefore, this study aimed to evaluate methodologies for in vitro culture of Peltophorum dubium, with the specific purpose of increasing rates of multiplication of the species and reduce leaf senescence. Furthermore, we tried to establish an efficient methodology for the indirect organogenesis, which can be an alternative way to induce organs. On in vitro multiplication and leaf senescence were investigated different sources and concentrations of cytokinins 6-benzylaminopurine (BAP), kinetin (KIN), isopentenyladenine (2iP), and thidiazuron (TDZ), combined one with each other, or isolated, and its association with α-naphthaleneacetic acid (NAA) and in the case of kinetin, 2iP and TDZ, also with BAP. In indirect organogenesis, we evaluated the effect of different concentrations of 2.4-D and various explants cultured in the presence or absence of light. It can be concluded that the use of cytokinin 2iP, in the evaluated concentrations in the presence of NAA or in association with NAA and BAP, has no effect on in vitro multiplication of the epicotyls containing cotyledonary node of Peltophorum dubium. Further, after 21 days of in vitro culture, under conditions of high temperature, occurs expressive leaf senescence. Cytokinins BAP, KIN, 2iP and TDZ, in evaluated concentrations, do not influence the in vitro multiplication of Peltophorum dubium. To maintain controlled leaf senescence when TDZ is used is dispensable using NAA, however, when the cytokinin 2iP is employed, the presence of NAA contributes to a reduction in the number of senescent leaves. Generally, from 21 days of in vitro culture the auxin and cytokinins used (NAA, 2iP and TDZ) start to have a significant effect on the occurrence of leaf senescence, which will depend on the combination of growth regulators. Can be also checked that the presence of TDZ, 2iP and NAA at the concentrations tested have no influence on survival, establishment and number of leaves formed in Peltophorum dubium during the initial in vitro culture of epicotyls containing cotyledonary node, have been observed high averages for these variables. Furthermore, the combination of NAA and TDZ has significant deleterious effect on in vitro survival of Peltophorum dubium explants during the first 30 days of subculture. This association also has significant deleterious effect on in vitro establishment and number of new shoots in shoot apical segments during first 30 days of subculture of Peltophorum dubium. The presence of 2iP and NAA at the concentrations tested doesn't have influence on survival, establishment, number of shoots and number of leaves formed in Peltophorum dubium during the first subculture of 30 days. The callogenesis is maximized in the presence of 20 μM of 2.4-D in cotyledon and hypocotyl segments. In the absence of 2.4-D hypocotyl are more efficient in callus formation. There is a high phenolic oxidation, but that, in general, does not impair the formation of callus, mainly in hypocotyls and cotyledon segments. There are 100% of root formation in cotyledon segments in the presence of light and nutritive medium supplemented with 40 μM of 2.4-D; in the absence of light and in the presence of 20 μM auxin rooting is also satisfactory. / Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert é uma espécie florestal nativa com muitas possibilidades de uso e com grande potencial para plantios comerciais. No entanto, há poucas informações sobre a produção de mudas desta espécie, o que, aliado às limitações inerentes às espécies arbóreas, dificulta a implantação de programas de melhoramento genético e, consequentemente, o estabelecimento de povoamentos de adequada qualidade genética. Estudos relacionados à propagação de Peltophorum dubium por técnicas da cultura de tecidos in vitro podem auxiliar nesse sentido. Considerado o exposto, o presente estudo objetivou avaliar o efeito de fontes, concentrações e combinações de fitorreguladores na multiplicação e senescência foliar in vitro de Peltophorum dubium. Adicionalmente, procurou-se estudar a resposta de diferentes explantes em relação à organogênese indireta, que pode ser uma maneira alternativa para a indução de órgãos. Na multiplicação in vitro e na senescência foliar in vitro foram avaliadas diferentes fontes e concentrações das citocininas 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (CIN), isopenteniladenina (2iP) e thidiazuron (TDZ), combinadas entre si, ou isoladas, bem como sua associação com ácido α-naftalenoacético (ANA) e, no caso de CIN, 2iP e TDZ, com BAP. Na organogênese indireta, avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de 2,4-D e diferentes explantes cultivados na presença ou ausência de luz. Pode-se concluir que o emprego da citocinina 2iP, nas concentrações testadas, na presença de ANA ou em conjunto com ANA e BAP, não exerce influência na multiplicação in vitro de epicótilos contendo o nó cotilenodar de Peltophorum dubium. Ainda, aos 21 dias de cultivo in vitro, em condições de temperatura elevada, ocorre expressiva senescência foliar. As citocininas BAP, CIN, TDZ e 2iP, nas concentrações testadas, não influenciam na multiplicação in vitro de Peltophorum dubium. Verificou-se que, quando se utiliza TDZ, é dispensável a utilização de ANA para que se mantenha controlada a senescência foliar, no entanto, quando é 2iP, a presença de ANA contribui para a redução no número de folhas senescentes. De maneira geral, a partir dos 21 dias de cultivo in vitro, a auxina e as citocininas utilizadas (ANA, 2iP e TDZ) passam a exercer efeito significativo na ocorrência de senescência foliar, a qual vai depender da combinação dos fitorreguladores. Pode-se verificar, também, que a presença de TDZ, ANA e 2iP, nas concentrações testadas, não exerce influência na sobrevivência, estabelecimento e número de folhas formadas em Peltophorum dubium durante o cultivo in vitro inicial de epicótilos contendo o nó cotiledonar, observando-se elevadas médias para estas variáveis. Ainda, a associação entre ANA e TDZ tem efeito prejudicial significativo na sobrevivência in vitro de explantes de Peltophorum dubium durante o primeiro subcultivo de 30 dias. Esta associação também tem efeito prejudicial significativo no estabelecimento in vitro e número de brotos formados em segmentos apicais caulinares de Peltophorum dubium durante o primeiro subcultivo de 30 dias. A presença de 2iP e ANA, nas concentrações testadas, não exerce influência na sobrevivência, estabelecimento, número de brotos e número de folhas formados em Peltophorum dubium durante o primeiro subcultivo de 30 dias. A calogênese é maximizada na presença de 20 μM de 2,4-D em segmentos cotiledonares e hipocótilos. Na ausência de 2,4-D os hipocótilos são mais eficientes na calogênese. Observam-se altas porcentagens de oxidação fenólica, mas de maneira geral, as oxidações não inviabilizam a formação de calos, principalmente em segmentos cotiledonares e hipocótilos. Ocorrem 100% de formação de raízes em segmentos cotiledonares, na presença de luz e em meio nutritivo suplementado com 40 μM de 2,4-D; na ausência de luz e presença de 20 μM da auxina, a rizogênese é também satisfatória.

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-02-21T13:43:00Z No. of bitstreams: 1 PGPV15MA185.pdf: 1457517 bytes, checksum: 4293d4dda1796f82f86a5921ddb2d618 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-21T13:43:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGPV15MA185.pdf: 1457517 bytes, checksum: 4293d4dda1796f82f86a5921ddb2d618 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / PROMOP / In years when conditions are unfavorable for pollination and when the intensity of flowering is small, you may need to improve the fruit set. The use of growth regulators can be a strategy to be adopted in order to ensure good fruit set. The Thidiazuron is a phenylurea with cytokinin action, when it is applied at low concentrations during cell division it can increase fruit set and fruit size. The aim of this study was to evaluate the effect of Thidiazuron concentration in fruit set and fruit quality of apple ‘Royal Gala’, grown in mild winter conditions. The experiment was arranged during cycles 2011/2012, 2012/2013 and 2013/2014 in Fraiburgo, SC, in the Royal Gala apple trees in Marubakaido rootstock M9 with filter. In all evaluation cycles the experimental design was a randomized block with factorial design (6x3x2) with six concentrations of TDZ, two application forms and three years of evaluation, composed of twelve treatments with six replications, the experimental unit was formed by one plant. The TDZ concentrations of each treatment were applied in two seasons. The first application was performed on pink bud stage (E2) and the second application in full bloom stage (F2). The variables: fruit set (%), return of flowering (%), number and weight of fruits per plant, average fruit bulk (g), average fruit length, average fruit diameter and length/diameter of the fruit (C/D), average number of seeds, caliber by classes: ≤135; and between 136-165 ≥180. Red coloration of the skin of the fruit were evaluated in three classes: percentage of fruits with a red color covering less than 50% of the surface; percentage of fruits with a red color covering 50% to 80% of the surface; and percentage of fruits with red color covering more than 80% of the whole surface. Were determined the mineral content of N, P, K, Ca, Mg and their relationship, flesh firmness, starch degradation and soluble solids content. The data were submitted to analysis of variance and the significant variables was performed the analysis of orthogonal contrasts. Significant data also were adjusted in the regression equations to evaluate the behavior of the variables with increasing concentration. We also used Pearson correlation analysis to check for possible relationships between the different attributes evaluated. The TDZ is effective even at low concentrations, and it increases production and fruit set of apple especially when there are unfavorable weather problems during pollination period. TDZ reduces the ripening of fruits. There is a reduction in the percentage of red color covering the skin of the fruit and number of seeds per fruit in plants that received the application of TDZ. The levels of minerals present in the flesh keeps within the sufficiency range independent of the concentration of TDZ applied / Em anos em que as condições forem desfavoráveis à polinização e quando a intensidade da floração for pequena, pode ser necessário melhorar a frutificação efetiva. A utilização de fitorreguladores pode ser uma estratégia a ser adotada a fim de garantir uma boa frutificação efetiva. O Tidiazurom é uma feniluréia com ação de citocinina que quando aplicado em baixas concentrações durante a divisão celular pode promover o aumento na frutificação efetiva e o tamanho dos frutos. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da concentração de tidiazurom na frutificação e qualidade de frutos de macieira ‘Royal Gala’, cultivadas em condições de inverno ameno. O experimento foi conduzido durante os ciclos 2011/2012, 2012/2013 e 2013/2014 em Fraiburgo, SC, em macieiras da cultivar Royal Gala em porta enxerto Marubakaido com filtro de M9. Em todos os ciclos de avaliação o delineamento experimental foi em blocos casualizados com esquema fatorial (6x3x2), com seis concentrações de TDZ, duas formas de aplicação e três anos de avaliação, composto por doze tratamentos com seis repetições, sendo a unidade experimental formada por uma planta. As concentrações de TDZ respectivas a cada tratamento foram aplicadas parceladamente em duas épocas. A primeira aplicação foi realizada no estádio de balão rosado (E2), e a segunda aplicação no estádio de plena floração (F2). Foram avaliadas as variáveis: frutificação efetiva (%), retorno de floração (%), número e massa de frutos por planta, massa fresca média de frutos (g), comprimento e diâmetro médio dos frutos e relação comprimento/diâmetro dos frutos (C/D), número médio de sementes, calibre por classes: ≤135; entre 136-165 e ≥180. Foi avaliado a coloração vermelha da epiderme dos frutos em três classes: porcentagem de frutos com coloração vermelha cobrindo menos de 50% da superfície do fruto; porcentagem de frutos com coloração vermelha cobrindo 50% a 80% da superfície do fruto; e porcentagem de frutos com coloração vermelha cobrindo mais de 80% da superfície do fruto. Foram determinados os teores minerais de N, P, K, Ca, Mg e suas relações da polpa fresca de frutos, firmeza de polpa, iodo-amido e conteúdo de sólidos solúveis totais (SST). Os dados obtidos foram submetidos à análise da variância e para as variáveis significativas foi realizada a análise de contrastes ortogonais. Os dados significativos também sofreram ajustes nas equações de regressão com a finalidade de avaliar o comportamento das variáveis com o aumento da concentração. Utilizou-se também a análise de correlação de Pearson para verificar possíveis relações existentes entre os diferentes atributos avaliados. O TDZ é efetivo, mesmo em baixas concentrações, no aumento da produção e frutificação efetiva de macieira sobretudo quando ocorrem problemas climáticos desfavoráveis à polinização. O TDZ retarda a maturação dos frutos. Há redução na porcentagem de coloração vermelha recobrindo a epiderme dos frutos e número de sementes por fruto nas plantas que receberam aplicação de TDZ. Os teores de minerais presentes na polpa mantem-se dentro da faixa de suficiência independente da concentração de TDZ aplicada

FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A gabirobeira (Campomanesia spp.) e o baruzeiro (Dipteryx alata Vog) são duas fruteiras nativas do Cerrado com grande potencial devido ao seu aproveitamento alimentar e suas múltiplas possibilidades de utilização. A cultura de tecidos pode colaborar tanto para o cultivo quanto para a preservação destas espécies. Assim, neste trabalho, foram realizados experimentos com diversos fitorreguladores no cultivo in vitro das duas fruteiras. No experimento feito com a gabirobeira, foram testadas três poliaminas (espermina, espermidina e putrescina) em duas concentrações (0,5 e 1,0 mg L-1) para a multiplicação in vitro da gabirobeira utilizando, como explantes, segmentos nodais de plantas estabelecidas in vitro. Os resultados mostraram que as poliaminas não foram eficientes no desenvolvimento dos explantes de gabirobeira. Porém, o subcultivos de segmentos nodais pode funcionar como método de multiplicação in vitro da gabirobeira. Já nos estudos relacionados ao baruzeiro, foram realizados trabalhos comparando a ação de sete fitorreguladores (espermina, espermidina, putrescina, 2iP, cinetina, zeatina e BAP) e também a combinação de doses de BAP e ANA na multiplicação in vitro do baruzeiro, utilizando dois tipos de explantes: sementes e segmentos nodais de plantas estabelecidas in vitro. Para as sementes, a zeatina foi o fitorregulador que proporcionou a formação do maior número de brotações, enquanto a variação das doses de BAP e o uso de ANA não foram efetivos para a multiplicação in vitro. Quando os explantes utilizados foram segmentos nodais, a espermina foi o fitorregulador que, isoladamente, favoreceu a maior taxa de brotações por explante, enquanto a combinação de 0,5 mg L-1 de ANA e 12 mg L-1 de BAP mostrou-se a mais promissora para gerar brotações em segmentos nodais de baruzeiro. Assim, os dados aqui apresentados são importantes para a multiplicação in vitro da gabirobeira e do baruzeiro e podem subsidiar estudos futuros a relacionados ao tema. / The gabirobeira (Campomanesia spp.) and the baruzeiro (Dipteryx alata Vog.) are fruit trees native to the Brazilian Cerrado, both present great potential due to the value of their fruits as food and their multiple possibilities of usage. Tissue cultures can collaborate not only on cultivation, but also on the preservation of these species. Thereby, experiments with different growth regulators on in vitro cultivation of both fruit trees were performed in this work. In the experiment performed on the gabirobeira, three polyamines (spermine, spermidine and putrescine) in two concentrations (0.5 and 1.0 mg L-1) – designated to in vitro multiplication of the gabirobeira – were tested using nodal segments from plants established in vitro as explants. The results showed that polyamines were not efficient for the development of the gabirobeira explants. However, nodal segment subculturing can work as a method for in vitro multiplication of the gabirobeira. Furthermore, in the studies related to the baruzeiro, experiments were performed comparing the action of seven growth regulators (spermine, spermidine, putrescine, 2iP, kinetin, zeatin and BAP) and the combination of doses of BAP and NAA on in vitro multiplication of the baruzeiro, in which two types of explants were used: seeds and nodal segments from plants established in vitro. For seeds, zeatin was the growth regulator that provided the generation of the greatest number of shoots, whereas the variation of BAP doses and the use of NAA were not effective for in vitro multiplication. When nodal segments were used as explants, spermine was the growth regulator to single-handedly provide the highest rate of shoot formation per explant, whereas the combination of 0.5 mg L-1 of NAA and 12 mg L-1 of BAP revealed itself to be the most promising for the shoot induction in nodal segments from the baruzeiro. Therefore, the mentioned data are important to in vitro multiplication of the gabirobeira and the baruzeiro, and it can also support future research concerning the subject. / Tese (Doutorado)

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Maria Carolina Scatolin do Rio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:38:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_GleidsonSilva_D.pdf: 5340667 bytes, checksum: a5eb7198bd79e4c57ea6ac55d5742b85 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo hemibiotrofico Moniliophthora perniciosa, e uma das principais doenças que acometem o cacaueiro (Theobroma cacao L.). Durante a fase biotrófica, o patôgeno coloniza o espaço intercelular e estimula a formação de ramos hipertróficos denominados vassoura verde. No estagio avançado da doença, o fungo passa a colonizar também o interior das células e observa-se a morte do tecido originando a vassoura seca. A semelhança destes sintomas aos observados em outras fitopatologias sugere um desequilíbrio hormonal em resposta a infecção. Neste contexto, este trabalho apresenta um estudo integrado dos genes relacionados a diferentes hormônios vegetais e uma caracterização dos genes relacionados às citocininas. A possível participação dos hormônios no estabelecimento e na progressão da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro e discutida. Dados de RNA-seq foram gerados durante as diferentes fases da interação. Em seguida, genes diferencialmente expressos foram classificados de acordo com a terminologia do Gene Ontology. Além disso, a capacidade de biossíntese de citocininas pelo fungo M. perniciosa foi avaliada através do teste de complementação utilizando a levedura TM128 sln1?. Em paralelo, foi realizada uma caracterização detalhada dos genes que constituem o mecanismo de percepção de citocininas em cacau, sistema denominado two-component. Genes relacionados às respostas hormonais e de defesa foram os mais representados entre o grupo de diferencialmente expressos. Durante a fase assintomática, e observada a indução de genes relacionados a auxinas e etileno. Por outro lado, no estagio avançado, foram identificados genes relacionados à degradação de citocininas e as respostas de defesa mediadas por acido salicílico e jasmonato/etileno. Paralelamente, foi identificado no M. perniciosa um gene para a síntese de citocininas, entretanto, a funcionalidade deste não foi confirmada. Em T. cacau, a arquitetura do sistema two-component e similar a encontrada em Arabidopsis sp., porem, nenhuma alteração significativa na expressão dos genes que constituem este sistema foi identificada. Por essa razão, não foi possível estabelecer uma relação clara entre as citocininas e os sintomas da Vassoura-de-bruxa. Contudo, o padrão de expressão de genes relacionados à homeostase de auxinas, sugere uma regulação negativa das respostas de defesa contra patogenos biotroficos durante fase inicial da doença / Abstract: The Witches' Broom disease, caused by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, is the major disease affecting cacao (Theobroma cacao L.). During its biotrophic phase, the pathogen colonizes the intercellular space and stimulates the formation of hypertrophic branches called green broom. In the advanced stage of the disease, the fungus starts also to colonize the interior of the cells and it is noted the death of tissue originating the dry broom. The similarity of these symptoms to those observed in other plant diseases suggests a hormonal imbalance in response to the infection. In this context, this work presents an integrated study of plant hormone-related genes and a characterization of cytokinin-related genes. The possible participation of these genes in the establishment and progression of Witches' Broom in cacao is discussed. RNA-seq data regarding different phases of the interaction were generated. After this, differentially expressed genes were classified according to Gene Ontology terminology. Furthermore, the ability of cytokinin biosynthesis by M. perniciosa was assessed by a complementation test using the yeast TM128 sln1?. In parallel, we performed a detailed characterization of genes that constitute the mechanism of perception of cytokinins in cacao, the two-component system. For these, the gene expression values have been accessed through the previously generated RNA-seq data. Defense and hormone-related genes were the most represented among the differentially expressed genes. During asymptomatic phase, we observe the induction of auxin and ethylene-related genes. During the symptomatic stage, genes related to the degradation of cytokinins and defense responses mediated by salicylic acid and jasmonate/ethylene was identified. Simultaneously, a putative gene for the synthesis of cytokinins was identified in M. perniciosa genome; however, the participation of this gene in cytokinin synthesis was not confirmed. In T. cocoa, the architecture of two-component system is similar to that one found in Arabidopsis sp.; however, no significant change in the expression of genes that constitute this system was identified. For this reason, it was not possible to establish a clear relationship between cytokinins and the symptoms of the Witches' Broom disease. Moreover, the expression pattern of homeostasis auxin-related genes suggests a negative regulation of defense responses against biotrophic pathogens during the initial stage of the disease / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Micropropagation of Aloe polyphylla, an endangered species with a high ornamental and medicinal value, is an important part of its conservation. However, the in vitro culture was hindered by the phenomenon of hyperhydricity. The research reported in this thesis was undertaken for two reasons. Firstly, to understand the role of various culture factors involved in the process of hyperhydricity in A. polyphylla and to identify the in vitro conditions, under which this disorder can be prevented. Secondly, we conducted an investigation into the underlying mechanisms of this phenomenon by probing if it was mediated through internal cytokinins. Ammonium (NH4 +) ions, applied cytokinins (CKs) and CK concentrations were tested in multifactorial combinations and significantly influenced the regeneration rate and occurrence of hyperhydricity. Shoots were grown on media with different NH4 + concentrations (10.3, 20.6 and 61.8 mM) and supplemented with BA, zeatin or TDZ at 0, 5 or 15 ìM. Elevating the levels of NH4 +, in the absence of CKs, could not induce hyperhydricity. Similarly, very low hyperhydricity was observed when CKs were added to media containing low NH4 + (10.3 mM). However, in the presence of higher NH4 + concentrations, CKs increased hyperhydricity in a concentrationdependant manner, suggesting that they were capable of inducing this syndrome only when other factors in the culture system were not optimised. High numbers of healthy looking shoots were produced on media with low NH4 + and low BA or zeatin (5 ìM). The use of TDZ resulted in the formation of buds, which did not develop into shoots. In view of the fact that NH4 + was supplied in the form of NH4NO3, it was difficult to determine if NH4 + or nitrate (NO3 -) ions were associated with the increase in hyperhydricity. We further examined the role of nitrogen (N) supplied as inorganic NH4 + or NO3 -, or organic glutamine. The omission of total N from the culture medium resulted in low multiplication and hindered shoot growth. Ammonium as the sole source of N depressed shoot regeneration and growth and escalated the frequency of hyperhydricity to ca. 50%. When NO3 - was used as the sole N source, shoots of fine quality were produced and hyperhydricity was completely eliminated. Overall, the MS N mix was superior to any single N source for multiplication and growth of shoots, suggesting a synergistic effect between NH4 + and NO3 - on shoot regeneration. Furthermore, not only the absolute amount of N, but also the relative amounts of NH4 + and NO3 - influenced the multiplication rate, frequency of hyperhydricity and shoot quality. The highest regeneration was obtained with NH4 + : NO3 - ratios (mM) of 20 : 40, 30 : 30 and 40 : 20. Decreasing the ratio of NH4 + : NO3 - lowered the occurrence of hyperhydricity. The potential of glutamine as the sole source of N was also demonstrated, since its application resulted in the production of good quality shoots and almost no hyperhydricity. Shoot explants grown in static liquid media became hyperhydric and lost their ability to regenerate. The type of gelling agent used to solidify the medium affected greatly hyperhydricity and shoot multiplication. Gelrite resulted in a significantly lower multiplication rate and four times higher hyperhydricity (64.7%) compared to when agar was used. Gelrite was further selected to test the hypothesis if hyperhydricity can be overcome by decreasing the relative matric potential of the media, and respectively the availability of water, as represented by increasing gelrite concentrations. Satisfactory reduction in hyperhydricity was achieved only at 16 g l-1 gelrite, however the regeneration also decreased. The nature of the gelling agent is therefore essential for the successful control of this phenomenon. It appears that a crucial prerequisite for the reduction of hyperhydricity in tissue cultures of A. polyphylla is the gaseous exchange between the in vitro atmosphere and the outside environment. In ventilated cultures, achieved by using a modified lid with a hole (d = 7 mm) covered with polyester or cotton mesh, hyperhydricity was completely eliminated, irrespectively of the type of gelling agent. Ventilation was further advantageous for the in vitro regenerants by increasing their leaf chlorophyll content as well as epicuticular wax deposition, the last one being indicative of the development of the water loss regulation mechanisms of explants. The increased culture ventilation, however, was negatively correlated with the regeneration rate and shoot growth. Endogenous CKs were measured in in vitro regenerants after an eight-week cycle to examine whether the hyperhydricity-inducing effect of exogenous CKs and gelling agents is associated with changes in the endogenous CK content. The content of endogenous CKs, determined by HPLC-mass spectrometry, in the shoots grown on CK-free media comprised isopentenyladenine-, trans-zeatin- and cis-zeatin-type CKs. The application of exogenous CKs resulted in an increase in the CK content of the shoots. Following application of zeatin, dihydrozeatin-type CKs were also detected in the newly-formed shoots. Application of BA to the media led to a transition from isoprenoid CKs to aromatic CKs in the shoots. Shoots grown on gelrite media contained higher levels of endogenous CKs compared to those on agar media. Total CK content of hyperhydric shoots was higher than that of normal shoots grown on the same medium. We suggest that the ability of exogenous CKs and gelrite to induce hyperhydricity in shoots of Aloe polyphylla is at least partially due to up-regulation of endogenous CK levels. However, hyperhydricity is a multifactor process in which different factors intervene. / Thesis (Ph.D.)-University of KwaZulu-Natal, Pietermaritzburg, 2009.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert is a native forest species that shows fast development with environmental and economic importance. However, studies related to the production of quality seedlings by vegetative propagation are still incipient. As a result, this study investigated methods for multiplication and in vitro root formation of Peltophorum dubium. For multiplication was evaluated the use, alone or combined, of the cytokinins 6-Benzylaminopurine (BAP), Kinetin (KIN), isopentenyladenine (2iP) and Thidiazuron (TDZ) in different concentrations and its association with the auxin alpha-naphthalene acetic acid (ANA) or activated charcoal. In the formation of roots were evaluated the auxins NAA, indole-3-butyric acid (IBA)and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) at different concentrations and the exposure time of shoots to these growth regulators and their cultivation in nutrient media MS and WPM. We evaluated also alternative substrates (vermiculite, Plantmax ® or fine sand) associated with different volumes of MS nutrient medium containing agar or not, in the in vitro root formation, with the aim of providing a more porous medium to the development of root system. There wasn t emission of adventitious shoots in the absence of cytokinins in epicotyls of Peltophorum dubium. TDZ and 2iP, at 5 or 10 μM, associated with 0.015 μM NAA in MS medium promoted the highest percentage of buds. However, the shoots showed little development, intensive formation of callus at the base and leaf chlorosis, which didn t permit its use. In the absence of cytokinin was not observed leaf chlorosis. The inclusion of 1 g L-1 of activated charcoal to the nutrient medium MS provided more vigorous shoots and the use of epicotyl containing cotyledonary nodes allowed the formation of new shoots in all treatments. When BAP was used alone was not observed the emission of adventitious buds on epicotyl; these only started to occur when we used combinations of BAP with KIN or 2iP. In MS nutrient medium, the highest callus formation was observed in the presence of 10 μM IBA, after 30 days. In nutrient medium WPM, the highest callus formation occurred in the absence of IBA. Reduced percentage of root formation in Peltophorum dubium shoots were both obtained in MS medium as in WPM, regardless of the absence or presence of IBA. In MS nutrient medium, regardless of the presence or absence of auxin and independent of the concentration of this class of growth regulators, callus formation occurred at the base of the shoots of Peltophorum dubium to 30 days in vitro culture. Both the nutrient media MS and WPM possibilite the formation of roots on shoots of Peltophorum dubium with the use of "pulse" treatments of IBA at concentrations between 0 and 20 μM for six days in nutrient medium. However, the root formation was not satisfactory. There was intense callus formation at the base of the shoots at 60 days of culture, when the vermiculite was used as substrate in the process of inducing rooting. At 60 days it was possible to obtain root formation on all substrates. The combination of MS medium supplemented with 10 μM IBA, vermiculite and agar provided 36.8% of root formation in shoots, as well as improved the quality of roots of Peltophorum dubium. The use of epicotyl containing cotyledonary nodes on MS nutrient medium, supplemented with activated charcoal reduces the callus at the base of the explants and raises the emission of adventitious shoots for 75% and provides the obtaining of more vigorous shoots and leaves without chlorosis. The auxins NAA, IBA and 2,4-D in concentrations of up to 20 μM during the whole period of culture are not efficient in promoting the in vitro formation of roots on shoots of Peltophorum dubium. The use of pulse treatment with IBA for six days and the reduction the concentration of salts from the nutrient medium after this period allows the formation of roots, independent of IBA concentration and use of MS or WPM media. Most promising results are obtained using the combination of vermiculite, nutrient medium and agar, both in percentage of root formation, and the quality of root system formed. / Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert é uma espécie florestal nativa de rápido crescimento e dotada de importância ambiental e econômica. No entanto, os estudos relacionados à produção de mudas de qualidade por meio da propagação vegetativa são, ainda, incipientes. Em virtude disso, este trabalho objetivou estudar metodologias para a multiplicação e para a formação de raízes in vitro de Peltophorum dubium. Para a multiplicação foram avaliados o emprego isolado ou combinado das citocininas 6-Benzilaminopurina (BAP), Cinetina (CIN), Isopenteniladenina (2iP) e Thidiazuron (TDZ) em diferentes concentrações, bem como sua associação com a auxina Ácido alfa-Naftaleno Acético (ANA) ou carvão ativado. Na formação de raízes foram avaliadas as auxinas ANA, Ácido 3-Indol Butírico (AIB) e Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D) em diferentes concentrações, bem como o período de exposição das brotações a esses fitorreguladores e seu cultivo nos meios nutritivos MS e WPM. Foram avaliados, ainda, substratos alternativos (vermiculita, Plantmax® ou areia fina) associados a diferentes volumes de meio nutritivo MS, contendo ou não ágar, na formação in vitro de raízes, com o intuito de oferecer um meio mais poroso para o desenvolvimento do sistema radicular. Não ocorreu emissão de brotações adventícias na ausência de citocininas em epicótilos de Peltophorum dubium. TDZ e 2iP, a 5 ou 10 μM, associados a 0,015 μM de ANA, em meio MS, promoveram as maiores porcentagens de brotações adventícias. No entanto, as brotações apresentaram pequeno desenvolvimento, intensa formação de calos na base e clorose foliar, o que inviabilizou a sua utilização. Na ausência de citocininas não ocorreu clorose foliar. A inclusão de 1 g L- 1 de carvão ativado ao meio nutritivo MS proporcionou a obtenção de brotações mais vigorosas e a utilização de epicótilos contendo nós cotiledonares permitiu a formação de novas brotações em todos os tratamentos testados. Quando BAP foi utilizado isoladamente não foi observada a emissão de brotações adventícias em epicótilos; estas só passaram a ocorrer quando foram utilizadas combinações de BAP com CIN ou 2iP. Em meio nutritivo MS, a maior formação de calos foi observada na presença de 10 μM de AIB, aos 30 dias. Em meio nutritivo WPM, a maior formação de calos ocorreu na ausência de AIB. Reduzidas porcentagens de formação de raízes em brotações de Peltophorum dubium foram obtidas tanto em meio MS como em WPM, independentemente da ausência ou da presença de AIB. Em meio nutritivo MS, independente da presença ou não de auxinas e, independente da concentração utilizada, ocorreu calogênese na base das brotações de Peltophorum dubium aos 30 dias de cultivo in vitro.Tanto o meio nutritivo MS quanto o WPM possibilitaram a formação de raízes em brotações de Peltophorum dubium com a utilização de tratamentos pulse de AIB, em concentrações entre 0 e 20 μM, durante seis dias no meio nutritivo. No entanto, a formação de raízes não foi satisfatória. Ocorreu intensa formação de calos na base das brotações, aos 60 dias, quando a vermiculita foi utilizada como substrato no processo de indução ao enraizamento. Aos 60 dias foi possível obter formação de raízes em todos os substratos testados. A combinação de meio MS acrescido de 10 μM de AIB + vermiculita + ágar proporcionou 36,8% de formação de raízes nas brotações, bem como melhorou a qualidade do sistema radicular de Peltophorum dubium. A utilização de epicótilos contendo nós cotiledonares, em meio nutritivo MS, acrescido de carvão ativado, reduz a calogênese na base dos explantes e eleva a emissão de brotações adventícias para 75%, bem como proporciona a obtenção de brotações mais vigorosas e sem clorose foliar. As auxinas ANA, AIB e 2,4-D, em concentrações de até 20 μM durante todo o período de cultivo não são eficientes em promover a formação in vitro de raízes em brotações de Peltophorum dubium. O emprego de tratamento pulse com AIB por seis dias e a redução na concentração de sais do meio nutritivo após esse período permite a formação de raízes, independente da concentração de AIB e da utilização dos meios MS ou WPM. Resultados mais promissores são obtidos com a utilização da combinação de vermiculita, meio nutritivo e ágar, tanto na porcentagem de formação de raízes, como na qualidade do sistema radicular formado.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Lorena_ Donini.pdf: 3190241 bytes, checksum: f4606822576585e47016056d80f7fb55 (MD5) Previous issue date: 2009-04-08 / The olive (Olea europaea L.) belongs to the Oleacea falmily, which include until 30 genera and 600 species distributed in tropical and temperate regions. The cutting is a widely used method, however the in vitro culture by micropropagation is a viable method of propagation providing the uniformity to the orchards, besides to enable the production of plants with health and accelerate the methods of conventional propagation. Thus, this work aimed to evaluate in vitro establishment and multiplication of olive through different treatments of culture medium. The article 1 aimed the in vitro established of different olive cultivars under different types of light and to evaluate combinations of zeatin and gibberellic acid of the in vitro establishment. The article 2 aimed to determine both the suitable culture medium and zeatin concentration for in vitro establishment of olive tree cv. Arbequina. The objective of article 3 was find alternatives to replace the use of zeatin or decrease this concentration in the culture medium to evaluate different cytokinins and concentrations of in vitro establishment and multiplication of olive tree cv. Arbequina. The article 4 aimed to evaluate two sugar types and concentrations on in vitro multiplication of olive cultivar Arbequina. The article 5 evaluated different types of closing and silver nitrate of in vitro multiplication of olive tree cultivar Arbequina. It was verified that: (1) the cultivars Koroneiki e Picual presented higher rate of in vitro establishment when cultivated under white light; the zeatin and AG3 combination is not efficient for in vitro establishment of olive tree; (2) the WPM and MO medium culture provide better results on in vitro establishment of olive cultivar Arbequina; (3) the use of 2 mg L-1 BAP is efficient for establishment and the use of 2 mg L-1 zeatin is efficient on in vitro multiplication of cultivar Arbequina; (4) Sucrose provides better results and the use of 15 g L-1 of sucrose is efficient as sugar source on in vitro multiplication of cultivar Arbequina; (5) the use of aluminum as sealing and the addition of 10 mg L-1 silver nitrate in the MO culture medium presents better results on in vitro multiplication of olive tree cultivar Arbequina. / A oliveira (Olea europaea L.) pertence à família Oleaceae, esta família inclui até 30 gêneros e 600 espécies distribuídas por regiões tropicais e temperadas. A estaquia é um método de propagação muito utilizado, mas o cultivo in vitro, por meio da micropropagação, é um método viável de propagação podendo assegurar a uniformidade dos pomares, além de possibilitar a produção de mudas com alta sanidade e acelerar os métodos de propagação convencional. Assim, este trabalho teve como objetivo estabelecer e multiplicar in vitro cultivares de oliveira através de diferentes tratamentos. O Artigo 1 consistiu no estabelecimento in vitro de diferentes cultivares de oliveira sob diferentes tipos de luz e avaliação de diferentes combinações de zeatina e ácido giberélico no estabelecimento in vitro. No Artigo 2 o objetivo foi determinar o meio de cultura e concentração de zeatina adequada no estabelecimento in vitro de oliveira cv. Arbequina. O Artigo 3 teve como objetivo buscar alternativas para substituir a utilização da zeatina ou diminuir a concentração desta no meio de cultura avaliando diferentes citocininas e concentrações no estabelecimento e multiplicação in vitro de oliveira cultivar Arbequina. O Artigo 4 teve como objetivo avaliar dois tipos de açúcar e concentrações na multiplicação in vitro de oliveira cultivar Arbequina. O Artigo 5 teve como objetivo avaliar diferentes tipos de vedação e nitrato de prata na multiplicação in vitro de oliveira cultivar Arbequina. De acordo com os resultados obtidos, na ordem dos artigos, verificou-se que: (1) as cultivares Koroneiki e Picual apresentam maior taxa de estabelecimento in vitro quando cultivadas sob luz branca; a combinação de zeatina e AG3 não é eficaz para o estabelecimento in vitro de oliveira; (2) os meios de cultura WPM e MO proporcionam melhores resultados no estabelecimento de oliveira Arbequina; (3) a utilização de 2 mg L-1 de BAP é eficiente para o estabelecimento e a utilização de 2 mg L-1 de zeatina é eficiente para a multiplicação in vitro de oliveira cultivar Arbequina; (4) dentre os açúcares testados, a sacarose proporciona melhores resultados e a utilização de 15 g L-1 de sacarose é eficiente como fonte de açúcar na multiplicação in vitro de oliveira cultivar Arbequina; (5) A utilização de papel alumínio como vedação e a adição de 10 mg L-1 de nitrato de prata ao meio de cultura MO apresenta melhores resultados na multiplicação in vitro de oliveira cultivar Arbequina.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Eugenia involucrata DC. and Handroanthus chrysotrichus (Mart. ex DC) Mattos are native species with economic, ecological and silvicultural. They have problems with their spread via seeds, because they are recalcitrant and lose viability within a few weeks after collection. In addition, there is little information about the propagation of these species. Therefore, the general objective of this study was to evaluate methodologies which may contribute to micropropagation of E. involucrata and H. chrysotrichus. For multiplication of E. involucrata were tested different sources (BAP, KIN, 2iP and TDZ) and concentrations (0, 16 and 32 μM) of cytokinins added to the nutrient medium MS/2. Also, we tested the effect of TDZ (16 or 32 μM) combined with GA3 (0; 10; 20 and 40 μM) added in medium MS/2, on in vitro multiplication of nodal segments. Even for E. involucrata, we examined the effect of NAA (0; 0,5 and 1 μM) combined with TDZ (0; 16 and 32 μM), added to the medium MS/2. Finally, for E. involucrata, we tested the effect of different concentrations of TDZ (0; 16 and 32 μM) added to the nutrient medium MS/2, on the multiplication of shoot apices of seedlings germinated in vitro. For H. chrysotrichus were tested different types of explants (shoot apical segments and epicotyl) and nutrient media (WPM, MS, WPM/2 and MS/2) in the presence and absence of activated charcoal as well as the effect of BAP (0; 2; 4; 8 and 16 μM) on in vitro multiplication of this species. For in vitro multiplication of nodal segments of E. involucrata the cytokinins tested are dispensable; cytokinins favor the growth of bacterial contamination, high levels of contamination reduce in vitro survival and establishment of nodal segments; the in vitro establishment for this species is impaired by the occurrence of leaf chlorosis and swelling of the explants. As for H. chrysotrichus, the shoot apical segments show the highest development in the in vitro survival and establishment than of epicotyl ; there is a high in vitro swelling of the explants in the absence of growth regulators; in the in vitro establishment in medium WPM/2 in the presence of 0,05 μM shoot apical segments are more efficient under low concentrations of BAP; there isgreater calli formation in epicotyl with increase the concentration of BAP, the opposite was true for the shoot apical segment. / Eugenia involucrata DC. e Handroanthus chrysotrichus (Mart. ex DC) Mattos são espécies florestais nativas com importância econômica, silvicultural e ecológica. Possuem problemas quanto a sua propagação via sementes, pois estas são recalcitrantes, perdendo a viabilidade em poucas semanas após a coleta. Além disso, existem poucas informações sobre a propagação vegetativa dessas espécies. Considerado o exposto, o objetivo geral do presente estudo foi avaliar metodologias que possam contribuir para a micropropagação in vitro de E. involucrata e de H. chrysotrichus. Para a multiplicação de E. involucrata foram testadas diferentes fontes (BAP, CIN, TDZ e 2iP) e concentrações (0; 16 e 32 μM) de citocininas adicionadas ao meio nutritivo MS/2. Também foi testado o efeito de TDZ (16 e 32 μM) combinado a GA3 (0; 10; 20 e 40 μM), acrescentados em meio MS/2, na multiplicação in vitro de segmentos nodais. Ainda para E. involucrata, foi avaliado o efeito de ANA (0; 0,5 e 1 μM) combinado a TDZ (0; 16 e 32 μM), acrescidos ao meio MS/2. Por fim, para esta espécie, testou-se o efeito de diferentes concentrações de TDZ (0; 16 e 32 μM) adicionadas ao meio MS/2, na multiplicação de segmentos apicais caulinares obtidos de plântulas germinadas in vitro. Para H. chrysotrichus, foram testados diferentes tipos de explantes (segmento apical caulinar e epicótilo) e meios nutritivos (WPM, MS, WPM/2 e MS/2), na presença e ausência de carvão ativado, bem como o efeito de BAP (0; 2; 4; 8 e 16 μM) na multiplicação in vitro dessa espécie. Para multiplicação in vitro de segmentos nodais de E. involucrata, as citocininas testadas são dispensáveis, uma vez que favorecem o crescimento de contaminação bacteriana. Elevados índices de contaminação acarretam reduzida sobrevivência e estabelecimento in vitro de segmentos nodais; o estabelecimento in vitro para essa espécie é comprometido pela ocorrência de clorose foliar e intumescimento dos explantes. Já para H. chrysotrichus, o segmento apical caulinar apresenta desenvolvimento superior ao do epicótilo na sobrevivência e no estabelecimento in vitro; há elevado intumescimento in vitro dos explantes na ausência de fitorreguladores. No estabelecimento in vitro em meio WPM/2 na presença de 0,05 μM de ANA, os segmentos apicais caulinares são mais eficientes sob concentrações reduzidas de BAP; há maior calogênese em epicótilos à medida que aumenta a concentração de BAP, ocorrendo o contrário para o segmento apical caulinar.

Les cytokinines sont des hormones régulant de nombreux processus physiologiques. Elles sont en particulier impliquées dans certaines interactions plantes-microorganismes pathogènes. Leur perception est assurée par les récepteurs Histidine Kinases (HK) dont la fonction est prédominante dans la transduction de signaux moléculaires et environnementaux. Ce travail a permis une caractérisation complète des cinq récepteurs aux cytokinines de type CHASE-Histidine Kinase (MdCHK) et d’un osmosenseur (MdHK1) chez le pommier, espèce d’intérêt économique soumise à l’attaque de nombreux pathogènes. La combinaison d’approches moléculaires et bio-informatiques a révélé les particularités fonctionnelles et les rôles spécifiques des MdCHK. Ces connaissances ont permis de sélectionner une souche de levures exprimant le récepteur MdCHK2 en tant que biosenseur de cytokinines. Ce nouvel outil biotechnologique optimisé pour la détection rapide de cytokinines a conduit à la mise en évidence d’une production de ces composés par Erwinia amylovora, bactérie pathogène du pommier. Le criblage de bactéries pathogènes humaines grâce au biosenseur a également révélé leur production par Staphylococcus aureus et Streptococcus agalactiae. Afin d’optimiser ce biosenseur, une approche mécanistique de MdCHK2 a été entreprise et dévoile l’importance de certains domaines dans ses spécificités de perception. / Cytokinins are hormones regulating numerous physiological processes. They are particularly involved in some plant-pathogen interactions. Their perception is ensured by Histidine Kinase (HK) receptors which play a prevailing role in transducing molecular and environmental signals. This work enabled the full characterization of the five cytokinin CHASE-Histidine Kinase receptors (MdCHK) and the osmosensor (MdHK1) in apple tree, a species of economic interest subjected to many pathogen attacks. Combining molecular and bioinformatics approaches led us to reveal the functional features and specific roles of the MdCHK. This knowledge allowed us to select a yeast expressing the MdCHK2 receptor as a cytokinin biosensor. This new biotechnological tool optimized for fast cytokinin detection led us to expose the production of such molecules in Erwinia amylovora, a pathogenic bacterium of apple. Screening human pathogenic bacteria with the biosensor also unveiled their production in Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae. In order to optimize this biosensor, we initiated a mechanistic approach on MdCHK2 and showed the importance of some domains in its perception specificities.

Somatic embryogenesis (SE) represents potentially very suitable way of plant production - micropropagation - of plants in vitro. The process had been studied for more than thirty years and a lot of knowledge has been gained in the field though new ways based on new knowledge leading to improvement and increase of the effectiveness of cultivation protocols are still under focus in the field. Relatively recent discovery of aromatic cytokinins lead to new knowledge on very positive effects on different morphogenetic and physiological processes during both cultivation in vitro or in vivo treatments. This gave origin to the topic of the present thesis, which focused on study of the effect of meta-topolin (mT), aromatic cytokinin, on proliferation phase of SE on structural level of embryogenic lines of Norway spruce Picea abies (L.) Karst. The aim of the thesis is analysis of structural development of embryogenic lines with the use of anatomical preparations and quantitative stereological methods. The material represented three embryogenic lines: 107 and 34C were obtained from the Forestry and Game Management Research Institute from the lab of Dr. Jana Malá and the line AFO 541, which was used as a standard line. To compare the effect of mT with benzylaminopurine (BAP) on proportion of different...