A l'interface de la génétique et de l'environnement, l'épigénétique contribue à la diversité phénotypique. Déterminer l'impact de la variation épigénétique sur les caractères quantitatifs (QT) est un nouveau défi. La croissance staturale fournit l’opportunité d’étudier la variabilité de plusieurs traits phénotypiques liés entre eux : des QT cliniques (la taille, l’accélération de la vitesse de croissance en réponse à l'hormone de croissance, GH) et des QT biologiques tels que la concentration d’IGF1 et la réponse de cette concentration à la GH. L’ « Insulin-like Growth Factor 1 » (IGF1) contrôle la croissance postnatale chez les mammifères, y compris l'homme. Nous l’avons choisi comme locus candidat pour nos études épigénétiques. Nous avons quantifié la méthylation des deux promoteurs P1 et P2 de ce gène, qui régulent son expression. Notre objectif était d’évaluer la contribution de la méthylation d’ADN de ces promoteurs i) à la taille des enfants en croissance, ii) à l’IGF1 circulant, iii) et à la réponse de ces paramètres à un traitement par la GH. Taille et IGF1 circulant. La relation entre la méthylation des promoteurs d’IGF1 et la taille a été étudiée au sein de deux cohortes du service d'endocrinologie pédiatrique, totalisant 216 enfants prépubères de différentes statures. Nous avons montré que la méthylation d'un groupe de six CGs situés dans la partie proximale du promoteur P2 du gène IGF1 présentait une corrélation inverse avec la croissance et l'IGF1 circulant. Les enfants les plus grands sont ainsi moins méthylés sur ces CGs que les enfants de petite taille. La contribution de la méthylation à la variance de la taille a été évaluée à environ 13%, et à 10% pour la variance de l'IGF1 sérique. Pour montrer que l’association observée reflète une causalité biologique, nous avons étudié le lien entre la méthylation des promoteurs P1 et P2 et l'activité transcriptionnelle du gène IGF1 in vivo et in vitro. Nous avons montré que les quantités de transcrits de classe II, issus du promoteur P2, sont inversement corrélés à la méthylation du promoteur P2 dans les cellules sanguines mononucléées. In vitro, nous avons cloné le promoteur P2 déméthylé ou méthylé dans un plasmide rapporteur (luciferase) transfecté dans la lignée HEK293 : le promoteur déméthylé s’est révélé nettement plus actif (+57%). Finalement, nous suggérons que l’hyperméthylation de certains CGs du P1 et du P2 d’IGF1 pourrait être un des nombreux mécanismes moléculaires responsables d’une moindre expression du gène et d’un phénotype de petite taille. La réponse au traitement par la GH. Une fraction des enfants de petite taille est traitée par l'hormone de croissance (GH) pour accélérer sa croissance, mais l’efficacité du traitement est très variable entre les individus. Les causes de cette variabilité sont partiellement comprises : la génétique joue un rôle, mais il reste une place possible pour la variabilité épigénétique. Dans ce but, nous avons étudié l'effet direct de la variabilité épigénétique sur la transcription du gène IGF1 et l’IGF1 circulant, dans un test aigu d’administration de GH, puis sur la réponse thérapeutique à un traitement d’un an par la GH. Après une injection de GH, nous avons constaté une augmentation variable du nombre de transcrits d’IGF1 chez les enfants étudiés. L'augmentation des transcrits de la classe II était inversement corrélée à la méthylation des CGs du P2. La variabilité de méthylation au CG-137 contribuait pour 20% à 67% de l’expression d’IGF1 en réponse à la GH. Chez 136 enfants de petite taille, nous avons montré que la méthylation de l'ADN du promoteur P2 était associée à la réponse au traitement par la GH au cours de la première année. Cette association est observée pour l'augmentation de la vitesse de croissance et pour les taux d’IGF1. (...) / At the interface of genetics and environment, epigenetics contributes to phenotypic diversity. Quantifying the impact of epigenetic variation on quantitative traits (QT), an emerging challenge in humans. Growth provides a handset of quantitative traits to epigenetic studies. We studied the variability of several inter-related QTs: clinical QTs (height, height reponse to growth hormone and biological QT (serum IGF1 and serum IGF1 response to GH). Since insulin-like growth factor 1 (IGF1) controls postnatal growth in mammals including human, we tested whether the CG methylation of the two promoters (P1 and P2) of the IGF1 gene could be a epigenetic contributor to the individual variation i) in circulating IGF1 and stature in growing children. ii) on response of these parameters to treatment with (GH). Child height and circulating IGF1. To explore the relation between IGF1 promoter methylation and height, we studied two cohorts of pedriatric endocrinology department, totalling 216 prepubertal children with various statures. The methylation of a cluster of six CGs located within the proximal part of the IGF1 P2 promoter showed a strong negative association with serum IGF1 and growth. These correlations were observed in two cohorts of growing children. Tall children show lower levels of methylation in several CGs in P2 and P1 promoters of IGF1 gene than short children with idiopathic short stature. CG methylation contributed 13% to the variance of height and 10% to the variance of serum IGF1. To test if the found association reflected biological causality, we tested if methylation at the P2 promoter affects the transcriptional activity of the IGF1 gene. The transcriptional activity of the P2 promoter was inversely correlated with the CG methylation in mononuclear blood cells. We established that high levels of CG methylation at the two promoters of IGF1 contributed to the many molecular mechanisms responsible for “idiopathic” short stature. Response to treatment with (GH). Short children using growth hormone (GH) to accelerate their growth respond to this treatment with a variable efficacy. The causes of this individual variability are partially understood and could involve epigenetics. In this aim, we investigated the contribution of DNA methylation to the response to GH at two levels: direct effect of GH on transcription of IGF1 gene, on circulating IGF1 and on the growth response to GH. Following a GH injection, we found a variable increase in IGF1 transcripts across the studied children. The increase in P2-driven transcripts showed a strong inverse correlation with 4/8 of P2 CGs. Among the CGs of P1 promoter, only CG-611 showed an inverse correlation with P1-driven transcripts. Variability of DNA methylation in these CGs contributes with 27% to 67% of increase in transcripts. In 136 children with idiopatic short stature, we showed that DNA methylation of the P2 promoter is associated with growth response to GH during the first year of GH administration, for both increment in growth rate and circulating IGF1. CG-137 methylation of P2 promoter contributes 25% to variance of growth response to GH. The link between DNA methylation and the response to a treatment in humans illustrating the role of epigenetic marks as potent contributors to conclusion « pharmacoepigenetics». Our work can find application in growth physiology and therapeutics, as well as for studies in aging, longevity or cancer where IGF1 has a prominent role.

Résumé : L’obésité est un enjeu de société de première importance; elle est un facteur de risque de plusieurs maladies et engendre d’importantes dépenses en santé. Outre l’alimentation, la sédentarité et les prédispositions génétiques, il semble que l’environnement fœtal soit un facteur déterminant dans le développement de l’obésité. En effet, il a été démontré que les nouveau-nés exposés à un environnement intra-utérin défavorable ont un risque accru de développer, à l’adolescence et à l’âge adulte, l’obésité ainsi que les désordres métaboliques qui y sont associés. Le diabète gestationnel (DG) est l’une des complications de santé maternelle les plus fréquentes et est associé à un risque accru à long terme pour la santé métabolique de l’enfant. Malgré les nombreuses données probantes épidémiologiques concernant le phénomène de la programmation fœtale associée au DG, les mécanismes moléculaires impliqués ont été très peu étudiés. Il est cependant de plus en plus évident que l’épigénétique soit l’un de ces mécanismes. Cette thèse a pour objectif d’identifier les changements de méthylation de l’ADN, la modification épigénétique la plus stable et la plus connue, chez les nouveau-nés exposés in utero au DG. Dans un premier temps, la méthylation de l’ADN de 44 échantillons de placenta et de sang de cordon a été analysée à l’échelle du génome. Cette approche a permis de démontrer que les gènes épigénétiquement modifiés suite à une exposition au DG sont majoritairement retrouvés dans les voies biologiques associées aux maladies métaboliques. Des analyses dans une cohorte indépendante (n=80) ont confirmé l’effet de la glycémie maternelle sur la méthylation de l’ADN des gènes BRD2, LRP1B et CACNA1D impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides et du glucose et du système rénine-angiotensine respectivement. Dans un second temps, l’approche par gènes candidats a démontré que l’exposition au DG est associée à la méthylation de l’ADN de gènes du métabolisme des lipides (LPL et ABCA1) du placenta. L’analyse de la méthylation de la LEP et de l’ADIPOQ dans le sang et les tissus adipeux de sujets sévèrement obèses a permis d’identifier des sites de méthylation pouvant potentiellement être utilisés dans le sang comme marqueur de susceptibilité à l’obésité. L’ensemble des résultats de cette thèse démontrent que le DG modifie le profil épigénétique de gènes impliqués dans les voies biologiques des maladies métaboliques (métabolisme énergétique et des lipides) et supportent l’importance de la méthylation de l’ADN dans la programmation de la santé métabolique du nouveau-né ayant été exposé in utero au DG. / Abstract : Obesity has reached epidemic proportions worldwide in both adult and childhood populations and is now recognized as a major public health issue. Obesity is associated with higher incidence of cardiometabolic complications including type 2 diabetes (T2D), dyslipidemia and hypertension as well as with increased health care costs. The fetal environment now appears, with genetics and the environment, as one cause of the obesity epidemic. Indeed, according to the fetal programming hypothesis, newborns exposed to a detrimental fetal environment are more susceptible to develop obesity, T2D and other related chronic disorders when they become teenagers or adults. Many studies have associated gestational diabetes mellitus (GDM) exposure with these long-term metabolic health risks for the newborn. Although, numerous studies show epidemiological evidence to support the fetal programming hypothesis, only a few studies have been undertaken to understand the underlying molecular mechanisms. However, several studies now suggest that epigenetics may be involved. The objective of this thesis is to study changes in DNA methylation, the more stable and studied epigenetic system, in newborns that have been exposed to GDM in utero. First, a genome-wide DNA methylation analysis (BeadChip) was performed in a sample set of 44 placenta and cord blood samples to identify genes and metabolic pathways dysregulated by GDM. This approach showed that genes epigenetically affected by GDM are predominantly involved in metabolic diseases. The associations between maternal glycemia and DNA methylation levels were confirmed, in an independent birth cohort, for BRD2, LRP1B and CACNA1D gene loci involved in the regulation of lipid and glucose metabolism and the renin-angiotensin system respectively. Then, using a candidate gene approach we reported that DNA methylation levels at gene loci involved in lipid metabolism (LPL and ABCA1) are modified in the placenta following exposure to GDM. Furthermore, analyses of LEP and ADIPOQ DNA methylation levels in blood and adipose tissues of severely obese men and women allowed the identification of CpG sites that might be used in blood as a marker of obesity susceptibility. Altogether the results of this thesis show that GDM affects the epigenetic signature of genes involved in metabolic disease pathways (energy and lipid metabolism) and support the role of DNA methylation in metabolic health programming of the newborn exposed to GDM.

La sénescence cellulaire est une réponse aux stresses selon laquelle des cellules pouvant proliférer optent pour entrer dans un arrêt du cycle cellulaire en réponse à une variété de stimulations intrinsèques et extrinsèques telle que, par exemple, le raccourcissement des télomères, un stress oxydatif, des dommages à l’ADN ou l’activation constitutive d’oncogènes. Toutes ces stimulations ont en commun le potentiel d’initier ou de promouvoir une transformation néoplasique qui peut dégénérer en cancer. En fait, la sénescence est maintenant acceptée comme un mécanisme cellulaire autonome pour empêcher le développement du cancer et elle est reconnue, particulièrement dans les cellules humaines, pour s’établir et se maintenir à l’aide d’au moins deux voies de suppression tumorale majeures : les voies de p53/p21CIP et de p16INK4A/pRB. Ces deux voies sont capables d’activer et d’augmenter l’expression d’un autre suppresseur tumoral : la protéine PML. En tant que suppresseur de tumeur, PML est suffisant pour induire la sénescence dans des cellules normales, mais il n’arrive généralement pas à activer une réponse complète de sénescence dans les cellules cancéreuses. Considérant ces faits, le premier objectif de cette thèse était d’étudier le mécanisme de résistance des cellules cancéreuses contre la sénescence induite par PML. Nous avons trouvé que, dans des cellules normales, la surexpression de CDK4 ou de CDK6 (CDK4/6) est suffisante pour contourner la sénescence induite par PML. De même dans les cellules cancéreuses, l’expression de ces kinases, souvent retrouvées augmentées dans de nombreux cancers, prévient probablement l’induction d’une sénescence par PML. Effectivement, grâce à l’inhibition de l’expression et/ou de la fonction kinase des CDK4/6, nous avons réussi à restaurer un programme de sénescence dans des cellules cancéreuses. En fait, l’utilisation de palbociclib, un inhibiteur spécifique de CDK4/6 maintenant en essais cliniques, permet d’augmenter l’habileté de PML à induire un arrêt de croissance plus fort et plus durable dans des cellules en cultures ainsi qu’une meilleure réduction de la progression de tumeurs dans des souris. Cette sénescence plus complète corrèle avec une augmentation de la présence de marqueurs d’autophagie, une meilleure répression des gènes cibles des E2F et une signature d’expression de gènes correspondant à l’inhibition de la méthylation de l’ADN. Ce dernier point découle du fait que l’inhibition de CDK4/6 par le palbociclib promeut une dégradation par autophagie de la DNA méthyltransférase DNMT1. Nous avons aussi démontré que CDK4 est capable d’interagir avec DNMT1 et de le phosphoryler in vitro. Ces résultats soulignent la valeur potentielle des inhibiteurs de CDK4/6 en tant que modulateurs épigénétiques pour faciliter l’activation de la sénescence dans des cellules cancéreuses. La sénescence induite par PML est fortement liée aux modifications post-traductionnelles. Parmi ces dernières, la SUMOylation joue un rôle important dans la fonction d’échafaudeur de PML et dans la formation des corps de PML. Les corps de PML sont des structures nucléaires dynamiques stimulées par des stresses, comme l’activation d’oncogènes menant à la sénescence, et dont la formation permet la séquestration de protéines spécifiques pour leur régulation et/ou pour leur modification post-traductionnelle. À travers le recrutement de protéines, les corps de PML régulent de nombreuses fonctions cellulaires telles que la sénescence, l’apoptose, la réponse antivirale, la réponse aux dommages à l’ADN et la régulation de l’expression de gènes. Compte tenu de cela, le deuxième objectif de cette thèse était de caractériser le rôle de la SUMOylation dans la sénescence induite par un oncogène, soit par l’expression de l’oncogène RAS. À l’aide d’une analyse du protéome de SUMO3 dans les cellules sénescentes versus des cellules en croissances, nous avons pu identifier 25 sites de SUMOylation dans 23 protéines dont l’incidence était significativement régulée par la sénescence. Il est à noter que la plupart de ces protéines (un tiers) sont connues pour être associées au corps de PML. Curieusement, UBC9 (la seule enzyme E2 pour la SUMOylation) a été retrouvée plus SUMOylée dans la sénescence sur sa Lys-49. Des études fonctionnelles d’un mutant d’UBC9 pour la Lys-49 ont démontré une diminution de son association aux corps de PML et la perte de la capacité d’UBC9 surexprimé à retarder la sénescence. De plus, la localisation forcée d’UBC9 dans les corps de PML gêne la sénescence induite par PML ou RAS. Ces résultats nous permettent de proposer des fonctions pro- et anti-sénescence de la SUMOylation des protéines, particulièrement pour UBC9. Mots-clés : Sénescence, PML, CDK4 et CDK6 (CDK4/6), méthylation de l’ADN, palbociclib, corps de PML, SUMOylation, UBC9 / Cellular senescence is a stress response wherein proliferating competent cells undergo a stable cell cycle arrest in response to a variety of intrinsic and extrinsic stimuli, including telomere shortening, oxidative stress, DNA damage or the constitutive activation of oncogenes among others. All these stimuli have in common the potential to initiate or promote neoplastic transformation that can degenerate in cancer. Senescence, particularly in human cells, is established and maintained by at least two major tumor suppressor pathways: the p53/p21CIP and p16INK4A/pRB pathways and is now accepted as a potent cell-autonomous mechanism for suppressing the development of cancer. Both pathways are able to activate and increase the expression of the tumor suppressor protein PML. As a tumor suppressor, PML is sufficient to induce senescence in normal cells; however, upon the same stimuli, cancer cells fail to engage a complete senescence response. Given this, the first aim of this thesis is to investigate the resistance mechanisms of cancer cells to PML-induced senescence. We found that overexpression of the CDK4 and CDK6 (which are often up-regulated in cancer) are sufficient to bypass PML-induced senescence in normal cells. In cancer cells the expression of these kinases impairs the PML-induced senescence. By inhibiting the expression and/or function of CDK4/6 we were able to restore the senescence program in cancer cells. Also, the specific CDK4/6 inhibitor palbociclib (currently used in clinical trials) increased the ability of PML to regulate a stronger and more permanent growth inhibition in cell culture and decreased tumor progression in mice. This complete senescence response correlated with an increase in autophagy markers, repression of E2F target genes and a gene expression signature of blocked DNA methylation. Furthermore, CDK4/6 inhibition by palbociclib promotes autophagy-dependant degradation of the DNA methyltransferase DNMT1. More important, we were able to demonstrate that CDK4 directly interacts and phosphorylates DNMT1 in vitro. These results highlight the potential value of CDK4/6 inhibitors as epigenetic modulators to facilitate activation of cellular senescence in cancer cells. PML-induced senescence is tightly regulated by post-translational modifications (PTMs). Among these PTMs, SUMOylation plays an important role in the scaffold function of PML and the formation of the PML-NBs (PML-Nuclear Bodies). PML-NBs are dynamic structures triggered by stress such as oncogene-induced senescence, and its formation allows the sequestration of target proteins for their regulation and/or its post-translational modification. By protein recruitment, PML-NBs regulate several cellular functions such as senescence, apoptosis, antiviral response, DNA repair and gene regulation. Given this; the second aim of this thesis is to characterize the role of SUMOylation in oncogene mediated cellular senescence, specifically by the expression of the oncogene RAS. By a SUMO3 proteome analysis of senescent cells we were able to identify 25 SUMO sites in 23 proteins that were significantly regulated during senescence. Importantly, most of these proteins were PML-NB associated. Interestingly, UBC9 (the only SUMO E2 enzyme), was found more SUMOylated in senescence on its Lys-49. Functional studies of a UBC9 mutant in Lys-49 showed a decreased association to PML-NBs and the loss of UBC9’s ability to delay senescence. Moreover, forced localization of UBC9 into PML-NBs counteracted RAS and PML-induced senescence. These results allowed us to propose a pro- and an anti-senescence function of protein SUMOylation, specifically for UBC9. Keywords: Senescence, PML, CDK4/6, DNA methylation, palbociclib, PML-NBs, SUMOylation, UBC9

A l'interface de la génétique et de l'environnement, l'épigénétique contribue à la diversité phénotypique. Déterminer l'impact de la variation épigénétique sur les caractères quantitatifs (QT) est un nouveau défi. La croissance staturale fournit l’opportunité d’étudier la variabilité de plusieurs traits phénotypiques liés entre eux : des QT cliniques (la taille, l’accélération de la vitesse de croissance en réponse à l'hormone de croissance, GH) et des QT biologiques tels que la concentration d’IGF1 et la réponse de cette concentration à la GH. L’ « Insulin-like Growth Factor 1 » (IGF1) contrôle la croissance postnatale chez les mammifères, y compris l'homme. Nous l’avons choisi comme locus candidat pour nos études épigénétiques. Nous avons quantifié la méthylation des deux promoteurs P1 et P2 de ce gène, qui régulent son expression. Notre objectif était d’évaluer la contribution de la méthylation d’ADN de ces promoteurs i) à la taille des enfants en croissance, ii) à l’IGF1 circulant, iii) et à la réponse de ces paramètres à un traitement par la GH. Taille et IGF1 circulant. La relation entre la méthylation des promoteurs d’IGF1 et la taille a été étudiée au sein de deux cohortes du service d'endocrinologie pédiatrique, totalisant 216 enfants prépubères de différentes statures. Nous avons montré que la méthylation d'un groupe de six CGs situés dans la partie proximale du promoteur P2 du gène IGF1 présentait une corrélation inverse avec la croissance et l'IGF1 circulant. Les enfants les plus grands sont ainsi moins méthylés sur ces CGs que les enfants de petite taille. La contribution de la méthylation à la variance de la taille a été évaluée à environ 13%, et à 10% pour la variance de l'IGF1 sérique. Pour montrer que l’association observée reflète une causalité biologique, nous avons étudié le lien entre la méthylation des promoteurs P1 et P2 et l'activité transcriptionnelle du gène IGF1 in vivo et in vitro. Nous avons montré que les quantités de transcrits de classe II, issus du promoteur P2, sont inversement corrélés à la méthylation du promoteur P2 dans les cellules sanguines mononucléées. In vitro, nous avons cloné le promoteur P2 déméthylé ou méthylé dans un plasmide rapporteur (luciferase) transfecté dans la lignée HEK293 : le promoteur déméthylé s’est révélé nettement plus actif (+57%). Finalement, nous suggérons que l’hyperméthylation de certains CGs du P1 et du P2 d’IGF1 pourrait être un des nombreux mécanismes moléculaires responsables d’une moindre expression du gène et d’un phénotype de petite taille. La réponse au traitement par la GH. Une fraction des enfants de petite taille est traitée par l'hormone de croissance (GH) pour accélérer sa croissance, mais l’efficacité du traitement est très variable entre les individus. Les causes de cette variabilité sont partiellement comprises : la génétique joue un rôle, mais il reste une place possible pour la variabilité épigénétique. Dans ce but, nous avons étudié l'effet direct de la variabilité épigénétique sur la transcription du gène IGF1 et l’IGF1 circulant, dans un test aigu d’administration de GH, puis sur la réponse thérapeutique à un traitement d’un an par la GH. Après une injection de GH, nous avons constaté une augmentation variable du nombre de transcrits d’IGF1 chez les enfants étudiés. L'augmentation des transcrits de la classe II était inversement corrélée à la méthylation des CGs du P2. La variabilité de méthylation au CG-137 contribuait pour 20% à 67% de l’expression d’IGF1 en réponse à la GH. Chez 136 enfants de petite taille, nous avons montré que la méthylation de l'ADN du promoteur P2 était associée à la réponse au traitement par la GH au cours de la première année. Cette association est observée pour l'augmentation de la vitesse de croissance et pour les taux d’IGF1. (...) / At the interface of genetics and environment, epigenetics contributes to phenotypic diversity. Quantifying the impact of epigenetic variation on quantitative traits (QT), an emerging challenge in humans. Growth provides a handset of quantitative traits to epigenetic studies. We studied the variability of several inter-related QTs: clinical QTs (height, height reponse to growth hormone and biological QT (serum IGF1 and serum IGF1 response to GH). Since insulin-like growth factor 1 (IGF1) controls postnatal growth in mammals including human, we tested whether the CG methylation of the two promoters (P1 and P2) of the IGF1 gene could be a epigenetic contributor to the individual variation i) in circulating IGF1 and stature in growing children. ii) on response of these parameters to treatment with (GH). Child height and circulating IGF1. To explore the relation between IGF1 promoter methylation and height, we studied two cohorts of pedriatric endocrinology department, totalling 216 prepubertal children with various statures. The methylation of a cluster of six CGs located within the proximal part of the IGF1 P2 promoter showed a strong negative association with serum IGF1 and growth. These correlations were observed in two cohorts of growing children. Tall children show lower levels of methylation in several CGs in P2 and P1 promoters of IGF1 gene than short children with idiopathic short stature. CG methylation contributed 13% to the variance of height and 10% to the variance of serum IGF1. To test if the found association reflected biological causality, we tested if methylation at the P2 promoter affects the transcriptional activity of the IGF1 gene. The transcriptional activity of the P2 promoter was inversely correlated with the CG methylation in mononuclear blood cells. We established that high levels of CG methylation at the two promoters of IGF1 contributed to the many molecular mechanisms responsible for “idiopathic” short stature. Response to treatment with (GH). Short children using growth hormone (GH) to accelerate their growth respond to this treatment with a variable efficacy. The causes of this individual variability are partially understood and could involve epigenetics. In this aim, we investigated the contribution of DNA methylation to the response to GH at two levels: direct effect of GH on transcription of IGF1 gene, on circulating IGF1 and on the growth response to GH. Following a GH injection, we found a variable increase in IGF1 transcripts across the studied children. The increase in P2-driven transcripts showed a strong inverse correlation with 4/8 of P2 CGs. Among the CGs of P1 promoter, only CG-611 showed an inverse correlation with P1-driven transcripts. Variability of DNA methylation in these CGs contributes with 27% to 67% of increase in transcripts. In 136 children with idiopatic short stature, we showed that DNA methylation of the P2 promoter is associated with growth response to GH during the first year of GH administration, for both increment in growth rate and circulating IGF1. CG-137 methylation of P2 promoter contributes 25% to variance of growth response to GH. The link between DNA methylation and the response to a treatment in humans illustrating the role of epigenetic marks as potent contributors to conclusion « pharmacoepigenetics». Our work can find application in growth physiology and therapeutics, as well as for studies in aging, longevity or cancer where IGF1 has a prominent role.

<p>Our primary goal is to better understand complex diseases using statistically disciplined approaches. As multi-modal data is streaming out of consortium projects like Genotype-Tissue Expression (GTEx) project, which aims at collecting samples from various tissue sites in order to understand tissue-specific gene regulation, new approaches are needed that can efficiently model groups of data with minimal loss of power. For example, GTEx project delivers RNA-Seq, Microarray gene expression and genotype data (SNP Arrays) from a vast number of tissues in a given individual subject. In order to analyze this type of multi-level (hierarchical) multi-modal data, we proposed a series of efficient-score based tests or score tests and leveraged groups of tissues or gene isoforms in order map genomic biomarkers. We model group-specific variability as a random effect within a mixed effects model framework. In one instance, we proposed a score-test based approach to map expression quantitative trait loci (eQTL) across multiple-tissues. In order to do that we jointly model all the tissues and make use of all the information available to maximize the power of eQTL mapping and investigate an overall shift in the gene expression combined with tissue-specific effects due to genetic variants. In the second instance, we showed the flexibility of our model framework by expanding it to include tissue-specific epigenetic data (DNA methylation) and map eQTL by leveraging both tissues and methylation. Finally, we also showed that our methods are applicable on different data type such as whole transcriptome expression data, which is designed to analyze genomic events such alternative gene splicing. In order to accomplish this, we proposed two different models that exploit gene expression data of all available gene-isoforms within a gene to map biomarkers of interest (either genes or gene-sets) in paired early-stage breast tumor samples before and after treatment with external beam radiation. Our efficient score-based approaches have very distinct advantages. They have a computational edge over existing methods because they do not need parameter estimation under the alternative hypothesis. As a result, model parameters only have to be estimated once per genome, significantly decreasing computation time. Also, the efficient score is the locally most powerful test and is guaranteed a theoretical optimality over all other approaches in a neighborhood of the null hypothesis. This theoretical performance is born out in extensive simulation studies which show that our approaches consistently outperform existing methods both in statistical power and computational speed. We applied our methods to publicly available datasets. It is important to note that all of our methods also accommodate the analysis of next-generation sequencing data.</p> / Dissertation

The studies presented in this dissertation, Evolution And Divergence Of The Structural And Physical Properties Of DNA Binding By Methyl-Cytosine Binding Domain Family Members 2 And 3, pertain primarily to two key epigenetic regulators involved with the biological interpretation of methylated DNA marks. We provide insights into the emergence and evolution of the MBD2 and MBD3 and how those molecular entities influence heritable changes in gene activity. We further provide details regarding the mystery surrounding MBD3 function and the MBD2-mediated capacity of primitive animals to carry out methylation-specific epigenetic mechanisms. In chapter two, we describe the DNA binding properties of MBD2 and MBD3. This study provides information regarding previously unidentified MBD3 binding properties and potential biological function. In chapter three, we show that sponges demonstrate a MBD2-mediated capacity for binding methylated DNA sites, recruit NuRD components in vitro, and knockdown of MBD2 in the freshwater desmosponge, Ephydatia muelleri, promotes an abnormal growth phenotype.

Endogenous retrovirus ERVWE1 is an integral part of the human genome. In the course of evolution, a protein encoded by the env gene of this retrovirus - Syncytin-1 - has gained unique function in human development. It mediates cell-to-cell fusion of placental cytotrophoblasts. Receptor that binds to Syncytin-1 is expressed in different cell types. Syncytin-1-mediated fusion is essential in placenta, but it can cause disruption of tissue integrity in other cell types. ERVWE1 expression is regulated by promoter DNA methylation, transcription factor GCM1 and efficient mRNA splicing. This thesis concerns the ERVWE1 expression and its regulation in non-placental tissues. It was found out that the moderate GCM1 overexpression was not sufficient to induce Syncytin-1 expression. Neither treatment with DNA demethylation agent 5-azacytidine nor with Syncytin-1 activator forskolin was able to manage Syncytin-1 expression. This thesis extends previous findings concerning high syncytin-1 expression in seminomas. In same tissues, there was found elevated TET1 expression on mRNA level in comparison with controls. The presence of the TET1 demethylation enzyme can influence ERVWE1 promoter DNA methylation. Previously unreported splicing variant of TET1 has been found during the construction of human TET1 expression...

Abstract Background: Type 1 diabetes (T1D) is a multifactorial autoimmune disease. Its incidence in Europe is continuously rising. The highest T1D risk is associated with HLA (human leukocyte antigen) class II genes. HLA class II molecules play a key role in regulation of immune response. They contribute to the selection of T cell repertoire by presenting antigenic peptides to the CD4+ T lymphocytes. HLA class II expression is controlled by regulatory module that is situated 150 - 300 base pairs upstream of the transcription- initiation site in all HLA class II genes. Polymorphisms in this region are linked to some autoimmune diseases. There were identified several promoter alleles (named QAP) in the HLA DQA1 gene promoter region. Most of the polymorphisms appear to be conserved within haplotype. Individual QAP alleles may have a different promoter strength by which they influence expression of HLA DQA1 gene alleles. Promoter strength can be modulated by DNA methylation. Aims:Our aim was to define methylation profile of HLA DQA1 promoters and determine the mRNA expression of individual alleles of HLA DQA1 gene in T1D patients. The mRNA expression level of HLA DQA1 gene alleles was determined using quantitative PCR. Methods: 30 diabetic pacients (age range 21 to 76 years), were included in this pilot...

During the process of spermatogenesis, histones are replaced by protamines, basic proteins enabling transmission of DNA to the oocyte during fertilization. In mouse sperm, there is only 1% of remaining histones whose N-terminal tails contain post-translationally modified residues. In this study, I was interested in contribution of paternal histone H4 acetylated on lysine K12 residues (H4K12ac) that is present in mature sperm head in remaining nucleosomes. Physiologically, H4K12ac has an important role in transcription factor accumulation and in regulation of gene expression. The presence and abundance of H4K12ac modification in various pronuclei stages of 1-cell embryo and parthenotes were assessed by imunnoflourescent detection with utilization of anti-H4K12ac antibody. Altogether, the paternal pronucleus exhibits a strong acetylation signal on H4K12 since its formation, while in the maternal one, there is a slow continual increase of H4K12ac getting on the same level as paternal pronucleus till the pronuclei fusion. Simultaneously DNA methylation status in both pronuclei was detected. In paternal pronucleus there is a continual decrease in the DNA methylation detectable as a decrease of 5mC and an increase of 5hmC signal. Meanwhile, the maternal pronucleus stays widely methylated. DNA...

Les mécanismes épigénétiques sont apparus comme fondamentaux au cours de la tumorigenèse, où l’inhibition des gènes suppresseurs de tumeurs et d'autres gènes associés aux cancers peut être causée non seulement par des facteurs génétiques, mais aussi épigénétiques. La réversibilité intrinsèque et l'ubiquité des modifications épigénétiques ainsi que leurs apparitions précoces dans de nombreux cancers en font une cible attractive pour la découverte de biomarqueurs et l’élaboration de stratégies pour la prévention du cancer. Afin d'identifier les événements épigénétiques impliqués dans la cancérogenèse et d’acquérir une meilleure compréhension des mécanismes, nous avons utilisé des méthodes quantitatives permettant de déterminer les profils de méthylation de l'ADN au sein d’un panel de gènes associés au cancer. Ces travaux ont principalement été effectués sur des cas de cancer du poumon et des contrôles. Nos analyses ont révélé une fréquence élevée et anormale d’hyperméthylation de l’ADN au niveau de gènes spécifiques dans les tumeurs pulmonaires par rapport aux tissus environnants non-tumoraux. Ces résultats sont en accord avec l'hypothèse établie qu’une méthylation aberrante de l'ADN se produit d’une manière tumeur-spécifiques et au niveau de certains gènes. Nous avons montré une association entre les changements de méthylation de l’ADN des gènes et certains facteurs environnementaux connus pour être des facteurs de risque (tels que le tabagisme et la consommation d’alcool). Nos résultats suggèrent également que les caractéristiques clinico-pathologiques tels que l'âge et le sexe peuvent influencer les niveaux de méthylation de l’ADN. Nous avons étudiés les conséquences moléculaires de l’inactivation des gènes ayant une hyperméthylation anormale dans les tumeurs et nous avons montré que leur dérégulation par voie épigénétique compromettait des voies de signalisation importantes (telles que les voies de signalisation déclenchant la mort cellulaire) / Epigenetic changes have emerged as key mechanisms in fpment. The main events associated with cancer development and progression such as silencing of tumor suppressor genes and activation of proto-oncogenes can be caused not only by genetic but also by epigenetic deregulation. The intrinsic reversibility and ubiquity of epigenetic changes as well as their early appearances in virtually all types of human cancer make them attractive subjects for biomarker discovery and strategies for cancer prevention. In order to identify critical epigenetic events involved in common human cancers and to gain a better mechanistic understanding of them we have applied quantitative profiling of DNA methylation states in a panel of cancer-associated genes in large case-control studies of lung cancer. Our analyses revealed a high frequency of aberrant hypermethylation of specific genes in lung tumors as compared to surrounding non-tumor tissues, consistent with the notion that aberrant DNA methylation occurs in a tumor-specific and gene-specific manner. Importantly, we have identified specific DNA methylation changes that are associated with the established and suspected risk factors (such as tobacco smoking and alcohol intake). Our results also indicated that clinicopathological features such as age and gender may also influence DNA methylation levels. Furthermore, we have carried out functional studies and identified possible underlying mechanisms and functional impact of deregulated methylation-mediated silencing of the genes under study on cellular processes (such as cell death response)