Troisième dystrophie musculaire en terme d’incidence, la dystrophie facio-scapulo-humérale est une maladie qui reste encore énigmatique. Bien qu’elle a été montrée comme associée à la contraction d’un macrosatellite, D4Z4, au niveau du subtélomère 4q35 au début des années 1990, l’origine des modifications observées chez les patients est encore mal connue. C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à différents aspects de la pathologie. Tout d’abord, nous avons étudié l’expression des gènes de la région 4q35 ainsi que de gènes impliqués dans la physiologie musculaire chez des fœtus et des adultes porteurs ou non d’une contraction du nombre de D4Z4 et avons ainsi pu mettre en évidence que les dérégulations géniques étaient déjà observable chez les fœtus, faisant de ceux-ci un modèle relevant d’étude de la pathogénèse précoce de la FSHD. Nous nous sommes ensuite intéressés à la régulation épigénétique de deux gènes situés au niveau du locus 4q35 et avons pu observer que des modifications épigénétiques globales pouvaient, ou non, moduler l’expression de ces gènes et ce dépendamment du nombre de répétitions du macrosatellite. Enfin, nous avons analysé la régulation de la région par l’effet de position télomérique et avons remarqué que seuls certains gènes de la région, distants, étaient régulés par ce mécanisme épigénétique. Ces résultats nous ont permis d’avancer un peu plus dans la connaissance de la dystrophie facio-scapulo-humérale et de valider un nouveau modèle d’étude de la pathologie. / Hird more frequently myopathy, the facioscapulohumeral dystrophy is an enigmatic disease. It is associated with the macrosatellite D4Z4 contraction since 90’s but the origin of the modifications observable in patients remains unclear. That’s why, we have focused our work in different aspects of this disease. First of all, we have studied expression of 4q35 and muscular genes in fetuses and adults carrying a contraction of the D4Z4 macrosatellite and shown that the molecular deregulations can be observed since the fetal stage. So, we have validated this model as an interesting model to study the early FSHD pathogenesis. Secondly, we have been interested in epigenetic regulation of two genes located in the 4q35 region and have observed a modulation of their expression in a global epigenetic modulation contest. Those deregulations depend on the number of D4Z4 repeats. Finally, we have analyzed the region regulation by telomere position effect and have noted only some genes are deregulated by this epigenetic mechanism. With those results, we have progressed in the FSHD pathogenesis knowledge and we have validated a new model to study this pathology.

La variabilité phénotypique est définie par la capacité d’une espèce donnée à produire des variants phénotypique à partir d’un seul génotype, sous l’influence de l’environnement. L’origine de la variabilité phénotypique constituait un débat entre les scientifiques jusqu’à l’heure actuelle. Il était généralement admis que les variations génétiques seraient la seule source de la variabilité phénotypique. Cependant, les études récentes montrent que des variations épigénétiques pourraient être une source alternative pour les variants phénotypiques, sans modifier la séquence de l’ADN. L’épigénétique est l’une des composante du « Dual inheritance system », une théorie qui évoque l’existence de deux systèmes d’héritabilité : la génétique et l’épigénétique. Dans les interactions hôte / parasite, les parasites exercent des pressions sélectives sur leurs hôtes et vice versa, conduisant à une véritable course aux armements entre les deux partenaires. Une telle interaction nécessite une adaptation rapide où chaque partenaire doit évoluer sa capacité d’exprimer de nouveaux variants phénotypiques. Schistosoma mansoni est un parasite humain responsable de la bilharziose intestinale. Cette maladie est classée au second rang mondial selon l’OMS. Le schistosome se caractérise par un cycle de vie qui est complexe nécessitant le passage par deux hôtes : l’hôte intermédiaire Biomphalaria glabrata et l’hôte définitif qui pourrait être l’homme ou les rongeurs. Nous nous sommes intéressés au cours de la thèse à l’interaction de S. mansoni avec B. glabrata. Cette thèse avait pour objectif de montrer l’implication des modifications épigénétiques dans la production des variants phénotypiques dans un contexte de coévolution de l’interaction entre S. mansoni et B. glabrata. Les deux principaux buts c’étaient : (i) Déterminer le poids relatif épigénétique / génétique dans l’expression des variants phénotypiques chez le parasite. (ii) Initier l’investigation autour des mécanismes épigénétiques chez l’hôte. Les résultats de nos travaux ont montré que les modifications des histones constituent en effet une origine des variants phénotypiques chez S. mansoni. Ces variants phénotypiques exprimés sont à la base d’une meilleure fitness voire d’une virulence pour le parasite. Finalement, l’étude de l’héritabilité des modifications épigénétiques a montré une transmission qui ne respecte pas les lois mendéliennes. En ce qui concerne B. glabrata, nous étions les premiers à mettre en évidence la méthylation de l’ADN chez ce mollusque. Au niveau du génome, 2% des cytosines totales sont méthylées. / Phenotypic variability is defined by the capacity of a given species to produce phenotypic variants from one genotype under the influence of the environment. There is several thinking about the origin of phenotypic variability. It was generally assumed that the genetic variations are the sole source of phenotypic variants. However, recent studies show that epigenetic variations can provide alternative source for phenotypic variants without change in DNA sequence. Epigenetic is one of the two components of the « Dual inheritance system », theory that evokes the existence of two inheritance system: genetics and epigenetics. In host / parasite interactions, parasites exert selective pressures on their hosts and vice versa, leading to a genuine arms race between both partners. Such interaction requires rapid adaptation where each partner has to evolve the capacity to express new phenotypic variants. We propose that epigenetic variations play an important role in the genesis of phenotypic variability. Schistosoma mansoni is a human parasite that causes intestinal schistosomiasis. Thisdisease is ranking second in the world according to the WHO. Schistosome is characterized by a life cycle that is complex requiring passage by two hosts: the intermediate host Biomphalaria glabrata and the definitive host that could be humansor rodents. During the PhD project, we are interested to the interaction of B. glabrata with S. mansoni. This PhD project aimed to show the involvement of epigenetic changes in the production of phenotypic variants in the context of coevolution of the interaction between S. mansoni and B. glabrata. The two main goals were: (i) To determine the relative weight epigenetic / genetic in the expression of phenotypic variants in the parasite. (ii) To initiate the investigation of epigenetic mechanisms in the host. The results have shown that histone modifications are indeed a source of phenotypic variants in S. mansoni. These phenotypic variants are the basis for better fitness and / or virulence of the parasite. Finally, studying the heritability of epigenetic changes showed a non-mendelian transmission. For B. glabrata, we were the first to highlight the DNA methylation in the snail. 2% of total cytosines are methylated in his genome.

A doença de Alzheimer (DA) é a causa mais comum de demência na população, sendo responsável por cerca de 50 a 60% dos casos. Embora o diagnóstico clínico da doença na maioria das vezes seja acurado, a confirmação da DA só é feita post mortem através principalmente da caracterização dos dois tipos principais de lesões neurais: depósitos extracelulares de placas de β amiloide e emaranhados de proteína tau hiperfosforilada. Até o momento, o envolvimento de apenas quatro genes foi confirmado na etiologia da DA, três deles (APP, PSEN1 e PSEN2) associados à forma familial de herança mendeliana, que corresponde a um tipo raro e grave. No entanto, apesar de inúmeros trabalhos de associação genômica, (Genome wide association studies- GWAS) sugerirem uma possível participação de vários outros genes na suscetibilidade à manifestação da forma multifatorial da DA, o gene APOE, ainda é o único consistente e reproduzivelmente associado à doença. As descobertas derivadas dos GWAS investigando o papel de SNPs coletivamente explicam somente uma pequena porcentagem da variação herdada que contribui para o risco de desenvolver a DA. Atualmente, há novas abordagens para investigar a base genética do restante da variabilidade fenotípica herdada e que pode influenciar a suscetibilidade ao desenvolvimento de doenças complexas. O papel da variação do número de cópias de segmentos de DNA (Copy Number Variation - CNV) na genética de doenças complexas foi demonstrado por diversos estudos nos últimos anos e evidencia que desequilíbrios genômicos também podem contribuir significantemente para a resistência ou susceptibilidade a várias patologias. Outro aspecto que vem assumindo crescente importância é a análise de modificações epigenéticas que podem constituir um mecanismo molecular básico e contribuir diretamente para a patogênese da DA. Logo, este trabalho teve como objetivo principal investigar dois aspectos relacionados à DA: (1) a identificação de CNVs que podem estar contribuindo para o desenvolvimento da forma multifatorial da DA, usando a técnica de array-CGH, e (2) a análise de alterações do padrão global de metilação do DNA no córtex frontal de indivíduos com a forma multifatorial da DA, usando um microarranjo que interroga o status de metilação de 450.000 sítios CpGs. Em nossa investigação sobre desequilíbrios genômicos na DA, identificamos 6 CNVs raras com conteúdo gênico relevante para o fenótipo investigado. Dois indivíduos distintos do grupo DA apresentam microduplicações em genes que codificam diferentes subunidades do mesmo tipo de canal de Ca2+ dependente de voltagem, o tipo L. Além disso, dos outros genes selecionados como especialmente interessantes, 4 estão envolvidos em diferentes processos inflamatórios e 1 é responsável por codificar a enzima nicotinamida fosforibosiltransferase, participante importante da via de biossíntese da molécula nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD). A implicação de um possível envolvimento de mediadores da sinalização celular do Ca2+ e da via de biossíntese da NAD na etiologia da DA também foi reforçada pelos nossos resultados sobre o padrão de metilação do DNA na DA. Dois genes importantes para a homeostasia intracelular do Ca2+ e via de biossíntese da NAD apresentaram sítios CpGs diferenciamente metilados nos sujeitos com DA / Alzheimer\'s disease (AD) is the most common form of dementia in the population, corresponding to 50-60% of all cases. Although clinical diagnosis seems to be accurate, the definitive diagnosis of the disease can only be made by a post mortem neuropathological exam that certifies the presence of the two hallmarks of AD: the accumulation of extracellular senile plaques containing β-amyloid (Aβ) and the intracellular neurofibrillary tangles containing hyperphosphorylated tau protein. Four genes are known to be involved in the etiology of AD, three of them (APP, PSEN1 and PSEN2) are associated to the familial form of the disease, which show autosomal dominant inheritance and correspond to the more severe and rare type of AD. Despite many genome wide association studies (GWAS), APOE still remains the only unequivocal genetic risk factor associated to the multifactorial form of AD. The discoveries from GWAS using SNPs collectively explain only a small percentage of heritable variation that may contribute in AD risk. Currently, new approaches have been used to investigate the genetic basis of the phenotypical variability inheritance that can influence the susceptibility of complex diseases. The important role of DNA copy number variation (CNV) has been demonstrated by several studies over the last years and shows that genomic imbalances may also significantly contribute to resistance or susceptibility to various complex diseases. Additionally, there is now increasing interest in exploring how epigenetic modifications, in particular DNA methylation, could influence complex diseases etiology. Thus, the major aim of this work were to investigate two aspects related to the multifactorial form of AD: (1) identification of rare CNVs, using array-CGH, that could contribute to the development of the disease, and (2) analysis of the DNA methylation pattern in frontal cortex of individuals with AD. In our study, we identified 6 rare CNVs with relevant gene content to the investigated phenotype. Two distinct subjects with AD from our casuistic presented microduplications in genes that encode different subunits of the same type of Ca2+ voltage channel, the L-type. Furthermore, among the other selected genes, four are involved in different inflammatory process and one encodes the nicotinamide phosphoribosyltransferase enzyme, important mediator of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) biosynthesis. The implication of a possible involvement of Ca2+ intracellular signaling mediators and NAD biosynthesis pathway in the etiology of AD was also reinforced by our analysis of DNA methylation pattern. Interestingly, two important genes, one to intracellular Ca2+ homeostasis and the other to NAD biosynthesis pathway presented CpGs sites differently methylated in the AD subjects

Les cellules placentaires portent un génome différent du génome maternel, puisque 50% de leurs gènes proviennent du génome paternel. Cependant, comme les cellules cancéreuses après la transformation néoplasique, elles réussissent à envahir les tissus de leur hôte, échapper à son système immunitaire et induire une angiogenèse afin d’établir la grossesse. Les cellules cancéreuses et placentaires arborent aussi une différence majeure : alors que de tels mécanismes typiques des cancers sont incontrôlés dans les cellules cancéreuses, ils sont spatialement et temporairement contrôlés dans les cellules placentaires saines. Ainsi, le recherche sur le « concept cancer/placenta » – l’utilisation du placenta pour mieux comprendre le cancer – peut aboutir à l’identification de biomarqueurs et d’approches thérapeutiques innovantes en oncologie, tout comme en gynécologie-obstétrique. Par exemple, les efforts de recherche portant sur l’expression des gènes CGB, codant pour la sous-unité ß de l’hormone chorionique gonadotrope humaine, dans les cellules cancéreuses et placentaires a mené au développement d’un biomarqueur largement utilisé pour la prise en charge de multiples cancers. Il est aussi intéressant de noter que ce même biomarqueur est aussi utilisé pour le dépistage d’aneuploïdies fœtales. De même, le clonage d’INSL4, codant pour le précurseur du peptide placentaire précoce ressemblant à l’insuline (pro-EPIL), dans des cellulaires placentaires précoces, a mené au développement d’un biomarqueur faisant actuellement l’objet d’études cliniques. Avec l’émergence de l’épigénétique, des études de la méthylation de l’ADN, la caractéristique épigénétique la mieux comprise, ont montré que les loci de gènes CGB et INSL4 sont hypométhylés dans les cellules cancéreuses et placentaires ; ce qui pourrait refléter l’hypométhylation globale caractéristique de ces deux types cellulaires. Par conséquent, le projet doctoral présenté dans cette thèse a exploré les modifications des paysages épigénétiques des cellules placentaires au cours de la grossesse et des cellules cancéreuses au cours de la transformation néoplasique. Ce projet a contribué initialement au développement d’un test d’immunoanalyse qui détecte l’hCGß de type II, spécialement codée par un sous-groupe de gènes CGB et détectée dans le sérum de patients atteints de cancers non-placentaires et de trisomie 21 fœtale. Ce test d’immunoanalyse, avec un test similaire développé pour la détection de pro-EPIL, a aussi été utilisé pour des études de preuve de concept précoces quant à l’effet de la méthylation de l’ADN sur l’expression de l’hCGß de type II et de pro-EPIL dans des surnageants de culture cellulaire. En fin de compte, ce projet a mené à la première comparaison directe et pan-génomique de la méthylation de l’ADN dans des cellules cancéreuses au cours de la transformation néoplasique et dans des cellulaires placentaires au cours de la grossesse. Cette étude a porté sur des données, disponibles publiquement, générées à partir de biopsies de 13 types de tumeurs, de villosités choriales (tissus placentaires) et d’autres tissus sains. Elle a également porté sur des données originales générées par nos soins à partir d’échantillons placentaires uniques : des cellules cytotrophoblastiques isolées de villosités choriales ex vivo. Toutes les données inclus dans cette étude ont été générées sur une plateforme de puces à ADN pour la mesure de la méthylation au niveau de 485 512 sites CpG pour chaque échantillon. En combinant, des logiciels innovants reposant sur la puissance d’algorithmes de lissage statistique et sur un solide rationnel biologique, cette étude a ainsi contribué à l’identification de motifs d’hypométhylation à l’échelle du mégabase distinguant les cellules placentaires du début de la grossesse de celles de la fin de la grossesse tout comme ils distinguent les cellules cancéreuses des cellules normales. (...) / Placental cells carry a genome different from the maternal genome, as 50% of it originate from the paternal genome. However, like cancer cells after neoplastic transformation, they successfully invade their host tissues, escape its immune system and induce angiogenesis in order to establish the pregnancy. Cancer and placental cells also display a major discrepancy: while such hallmarks of cancer mechanisms are uncontrolled in cancer cells, they are spatially and temporally controlled in healthy placental cells. Thus, research on the “cancer/placenta concept” – the use of the placenta to better understand cancer – can lead to innovative biomarkers and therapeutic approaches in oncology as well as in gynecology and obstetrics. For example, research efforts on the expression of the CGB genes, encoding for the human chorionic gonadotropin beta subunit (hCGß), in cancer and placental cells have led to the development of a biomarker widely used for the management of various cancers. Interestingly, this same biomarker is also used for the screening of fetal aneuploidies. Likewise, the cloning of INSL4, encoding for the precursor of the early placenta insulin-like peptide (pro-EPIL) in early pregnancy placental cells, has led to the development of a biomarker currently investigated in the clinical setting. Following the rise of epigenetic, studies on DNA methylation, the most well understood epigenetic mark, showed that the loci of CGB genes and INSL4 are hypomethylated in cancer and placental cells, which may reflect a global hypomethylation also characteristic of these cells. Therefore, the doctoral project presented in this dissertation had explored modifications in the epigenetic landscape of placental cells throughout pregnancy and cancer cells throughout neoplastic transformation. This project initially contributed to the development of an immunoassay detecting type II hCGß, specifically encoded by a subset of CGB genes and detected in the serum of patients with non-placental cancers and fetal Down Syndrome. This immunoassay, along with another one directed to pro-EPIL, was also used for an early proof of concept study regarding the effect of DNA methylation on the expression of type II hCGß and pro-EPIL in cell culture supernatants. Ultimately, this project led to the first direct genome-wide comparison of DNA methylation in cancer cells throughout neoplastic transformation and in placental cells throughout pregnancy. It included publically available data generated from biopsies of 13 types of tumors, chorionic villi (placental tissues) and other normal tissues. It also included original data generated from unique placental samples: villous cytotrophoblastic cells isolated ex vivo from chorionic villi. All datasets were generated on a microarray platform measuring DNA methylation at 485,512 CpG sites in each sample. Combining innovative software that leverages the power of statistical smoothing algorithms and a strong biological rationale, this study thus contributed to the identification of megabase-scale patterns of hypomethylation distinguishing early pregnancy from late pregnancy placenta cells as they distinguish normal from cancers cells. Strikingly, the affected genomic regions encompassed genes related to hallmarks of cancer mechanisms such as epithelial-mesenchymal transition (EMT), innate and acquired immune response, and hypoxia. Taken together, these results suggest the hypothesis that patterns of DNA methylation might contribute to “cancer/placenta epigenetic switches” allowing placental implantation and neoplastic transformation when turned “on”, while preventing the placenta to degenerate into an aggressive tumor when turned “off”.

RNA interference (RNAi) is an important mechanism regulating gene expression. In plants, RNAi is triggered by double-stranded RNA (dsRNA) which is processed into small RNAs (sRNAs), usually 21-24 nt long. The sRNAs are loaded into Argonaut (AGO) protein and recognize the target based on sequence complementarity. When the target is mRNA, they can slice it or block translation leading to posttranscriptional gene silencing (PTGS). When the target is DNA, they can induce DNA methylation and chromatin changes, which when present in the promoter can lead to transcriptional gene silencing (TGS). The individual components of RNAi are well described, but less is known about the impact of different types of dsRNA precursors on the dynamics of RNAi. To study these aspects of RNAi, we used tobacco BY-2 cell line expressing GFP reporter and inducible silencers. The silencers used different ways of triggering the dsRNA formation by transcripts from antisense (AS), unterminated sense (UT) and inverted repeat (IR) GFP sequence to initiate PTGS. Additionally, one IR silencer based on the CaMV 35S promoter initiated TGS. This allowed us to study RNAi from the beginning throughout the steady state level and till the recovery phase, all in the highly homogeneous system. Using this system, we described several features...

This master's thesis deals with the creation of a tool for the extraction of methylation level from transposon sequences. Transposons are DNA elements with ability to move or copy themselves and their activity is regulated by DNA methylation. Sequence methylation information is stored in the bisulfite data and their processing is done with parts of two existing tools in a combination with implemented modules. Created tool takes into consideration unique challenges brought in the methylation calling process by transposable elements and it's functionality is presented on a set of experiments with simulated and real data.

La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une pathologie clonale de la cellule souche hématopoïétique qui touche principalement les personnes âgées. Le seul traitement curatif de cette maladie est la greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques, souvent difficile à mettre en oeuvre. Les patients qui ne peuvent être greffés et dont la maladie présente des critères de gravité se voient proposer un agent déméthylant de l'ADN. Chez 30 à 40% d'entre eux, ce traitement induit une réponse objective dont le bénéfice en termes de survie n'est pas démontré. Le séquençage de gènes candidats a identifié une trentaine de gènes mutés de façon récurrente. Il s'agit de gènes codant des régulateurs épigénétiques, des facteurs d'épissage, des facteurs de transcription, et des protéines de la signalisation intracellulaire. Cette approche ne donnait qu'une vision partielle des événements génétiques associés à la maladie.Le premier objectif de cette thèse a été de recenser l'ensemble des mutations touchant les régions codantes et non codantes de l'ADN dans les cellules leucémiques des patients.Le séquençage de l'exome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 49 patients. Nos analyses ont montré qu'en moyenne, un patient porte 14 mutations somatiques dans les régions codantes. Nous avons confirmé que les mutations récurrentes les plus fréquentes affectaient les gènes TET2, SRSF2 et ASXL1. Nous avons aussi identifié 8 nouveaux gènes mutés de façon récurrente à une faible fréquence. En moyenne, 3 des 14 mutations affectent des gènes touchés de façon récurrente.Le séquençage du génome de cellules malades et de cellules contrôles a été réalisé chez 17 patients. L'analyse réalisée a détecté 475 mutations par patient dans les régions non répétées du génome. Dans l'exome, comme dans le reste du génome, les altérations principales sont des transitions. Deux signatures mutationnelles ont été identifiées et sont observées dans de nombreux cancers, traduisant probablement des altérations de la méthylation des cytosines au cours du vieillissement. Une troisième signature, jamais observée jusqu'alors et de signification indéterminée, a été détectée chez 2 patients.Nous avons alors répété l'analyse de l'exome dans les monocytes triés de 17 patients prélevés de façon séquentielle sur plus de 2 années : 6 n'ont pas été traités et 11 ont été traités par un agent déméthylant, parmi lesquels 6 sont restés stables et 5 ont montré une réponse clinique et biologique objective. L'analyse montre que 1) l'accumulation de mutations est un événement rare ; 2) l'hétérogénéité génétique du clone malade est limitée ; 3) la charge allélique des mutations reste inchangée, même chez les répondeurs ; 4) de nouvelles mutations peuvent apparaître alors que le patient est répondeur.Nous avons alors sélectionné 9 patients, 3 non traités, 3 stables sous traitement sans réponse objective, et 3 répondeurs. Nous avons collecté leurs monocytes avant tout traitement et quelques mois plus tard, alors que 6 d'entre eux étaient traités par un agent déméthylant. Nous avons analysé l'expression des gènes et la méthylation globale de l'ADN à ces deux temps. Chez les patients non traités, nous avons observé une remarquable stabilité de l'expression des gènes et de la méthylation de l'ADN. Chez les patients répondeurs, le traitement induit un changement significatif du niveau d'expression d'environ 500 gènes et la déméthylation d'environ 35,000 régions de l'ADN. Chez les patients stables sous traitement, le traitement induit un changement d'expression d'une soixantaine de gènes et du niveau de méthylation d'une centaine de régions seulement. Ces résultats suggèrent que les agents déméthylants n'affectent l'expression des gènes et la méthylation de l'ADN que chez les répondeurs, fournissant un argument important pour un effet essentiellement épigénétique et très peu cytotoxique de ces médicaments. / Chronic myelomonocytic leukemia is a clonal disorder of the hematopoietic stem cell, affecting mainly the elderly. The only curative therapeutic is allogeneic stem cell transplantation, which is rarely feasible. When transplantation is not an option, patients with a severe disease can be treated with a demethylating agent. Thirty to 40% of these patients show hematological improvement, but it remains unknown if these drugs increase overall survival. Analysis of candidate genes by Sanger sequencing, then by New Generation Sequencing, identified about thirty genes that are frequently mutated. These genes encode epigenetic regulators, splicing factors, transcription factors and cell signalling regulators. However, this approach catched only part of the genetic events that characterize this disease.The first objective of this study was to determine the mutational landscape of CMML cells by analyzing the coding and non coding regions of leukemic cell genome.We first performed whole exome sequencing analysis of leukemic and control cells in 49 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 14 somatic mutations in its coding regions. We confirmed that the most frequent mutations were in TET2, SRSF2 and ASXL1 genes. We identified also recurrent mutations in 8 new genes, these recurrent mutations occurring at a low frequency. In average, 3 out of the 14 mutations identified in each patient affected recurrently mutated genes.Secondly, we performed whole genome sequencing of leukemic and control cells in 17 patients. These analyses showed that in average, a patient carries 475 somatic mutations in the non repeated regions of the genome. In both the coding and non coding sequences, alterations were observed to be mainly transitions. As a signature of CMML, two mutational processes were identified in all 17 patients and are found in various other cancer types, most likely resulting from the cytosine methylation observed with ageing. A third process, never seen before and without known significance, was also detected in two patients.We collected several samples from 17 patients on a more than two year period: 6 of these patients remained untreated whereas 11 were treated with demethylating agent, among which 6 showed a stable disease and 5 fulfilled criteria of hematological improvement. These sequential analyses showed that 1) the occurence of new mutations is a relatively rare event ; 2) the genetic heterogeneity of the malignant clone is limited ; 3) the mutation allele burden remains unchanged under treatment, whatever the response ; 4) new mutations can appear, even in responding patients.We selected 9 patients, 3 untreated, 3 stable on therapy and 3 responders. We collected monocytes before treatment and a few months later and we analyzed gene expression and DNA methylation in sorted monocytes at these two time points. We did not detect any significant change in gene expression and DNA methylation pattern in untreated patients. In those who responded to treatment, we noticed significant changes in both gene expression, with about 500 deregulated genes, and the DNA methylation pattern, with about 35,000 demethylated regions. In stable patients, the treatment had a limited effect with changes in the expression of about 60 genes, and in the DNA methylation pattern of about 100 regions. These results show that demethylating agents affect gene expression and DNA methylation of responding patients only, suggesting they have mostly an epigenetic effect rather than a cytotoxic one.

Le domaine de l'épigénétique couvre l'ensemble des phénomènes héritables et transmissibles qui interviennent dans l'expression du génome sans modifier la séquence nucléotidique. L'information épigénétique est régulée par les modifications de la chromatine impliquant les histones et l'ADN. La méthylation de l'ADN est un phénomène réversible jouant un rôle crucial dans l'expression des gènes puisque la méthylation des promoteurs de gènes empêche leur transcription. La modulation aberrante de cette marque épigénétique est associée à diverses pathologies telles que le cancer. Cette méthylation étant réversible, elle peut être ciblée afin de reprogrammer la cellule cancéreuse. Les méthyltransferases d'ADN (DNMT), étant les enzymes responsables de la méthylation, représentent la cible principale de notre stratégie de recherche. Leur inhibition par des petites molécules est au centre de nos recherches de thérapies anticancéreuses dont les bases sont représentées par deux catégories d'inhibiteurs de DNMT existant. Les premiers sont des analogues de cytosine qui est la cible de la méthylation. Ils sont connus pour s'intégrer dans l'ADN et former un complexe covalent irréversible avec l’enzyme (complexe suicide) mais ils souffrent d'un manque de stabilité et de certains effets indésirables dus à leur incorporation dans l’ADN. Les seconds sont les inhibiteurs non nucléosidiques qui sont divers et parfois connus pour cibler d’autres enzymes. Ils ont l’avantage de pouvoir être utilisés comme sondes pour comprendre plus précisément le mécanisme d'inhibition mais ils manquent de spécificité et de sélectivité. Au cours de cette thèse, une banque de molécules a été criblée à partir de la combinaison d'un test enzymatique et d'un test cellulaire visant à inhiber ces enzymes. Les synthèses de trois familles de molécules potentiellement inhibitrices de DNMT issus de ce criblage sont décrites en expliquant le chemin de drug design emprunté pour obtenir des informations mécanistiques d’inhibition de la méthylation d’ADN, notamment de réactivité avec la cible. Les découvertes ont été inspirées par des études de modélisation permettant de mettre en évidence une sélectivité de certains inhibiteurs. La synthèse chimique a également abouti à une nouvelle voie de synthèse d’accès aux diaminopyrimidines dont l’impact permet de faciliter les études chimiques de dérivés quinazolines comme inhibiteur non nucléosidiques utiles pour les thérapies anticancéreuses. / Epigenetic is defined as the study of heritable changes in the genes expression without altering the DNA sequence. Two main processes are implicated in this field, the histones modifications and the DNA methylation. By introducing an acetyl or a methyl group on the histone tails or by methylation of DNA, the chromatin state is modified and the gene expression is controlled. Aberrant epigenetic modifications are associated with several diseases, in particular with cancer. In cancer cells, the whole DNA is hypomethylated, thus promoting genome instability, while the promoter region is hypermethylated, inducing silencing of these genes. Overall, these observations indicate that DNA methylation is a central epigenetic process in cancerogenesis. Since DNA methylation is reversible, it is possible to target the methylation process in order to reactivate tumor suppressor genes. The DNA methyltransferases (DNMTs), the enzymes responsible for DNA methylation, use the SAM co-factor at specific CpG sites to product 5-methylcytosine. Three main isoforms (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) are described to ensure efficient methylation process during replication. Two families of DNMT inhibitors already exist, the nucleosidiques analogues are cytidine derivatives and are toxic molecules because of their incorporation into DNA, and the non-nucleosidic analogues are less toxic but also less potent. Our strategy of drug design is based on docking study and high throughput screening (HTS) information. First, novel potent derivatives of reference inhibitors are designed from molecular modelling. Then, three different families of compounds from HTS are described with appropriate structure-activity relationship studies. Mechanistic information on DNA methylation process are described through the discovery of a reactive inhibitor of DNMT3A. The study on a family of hydrazone derivatives of gallic acid is depicted and shows its selectivity for DNMT3A, compared to DNMT1, based on docking study. An alternative chemical pathway to diaminopyrimidines is described and extended to the synthesis of quinazolone in order to synthesize new quinazoline derivatives as potent inhibitors of DNMT. Promising informations are described in this thesis to enrich epigenetic knowledge of tumor genesis and to provide new molecules for anticancer therapy.

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