Objective: To determine the association between smoking and occupational exposures, and DNA methylation levels in the lung cancer-related genes, AHRR and F2RL3. Methods: CARTaGENE is the largest ongoing prospective cohort study in Quebec, Canada. Currently, a nested case-control study in CARTaGENE is examining the association between AHRR and F2RL3 gene methylation and lung cancer risk (200 cases; 400 controls). Using the methylation data measured from this nested case-control study, information on participants’ smoking behavior and longest-held occupation were obtained from questionnaires. Information on smoking status and, where applicable, the average number of cigarettes smoked, duration of smoking, and time since cessation, was parameterized into a cumulative smoking index (CSI, continuous). Occupational exposures were estimated using the Canadian Job Exposure Matrix. Eighteen agents present in the occupational environment that are also found in cigarette smoke were of interest. In DNA isolated from blood samples collected at baseline, methylation ratios of 40 CpG sites in the AHRR and F2RL3 genes were measured using the Sequenom Epityper. In each gene, average methylation levels across all CpG sites were calculated and parametrized as a continuous variable. Separate least squares regression models were used to estimate the associations between smoking and occupational exposures, and AHRR and F2RL3 methylation levels while adjusting for potential confounders identified using directed acyclic graphs. Results: In both genes, smoking was associated with lower average methylation levels after adjusting for confounding factors (AHRR: -0.014 per standard deviation increase in CSI, 95% CI: -0.019, -0.010; F2RL3: -0.019 per standard deviation increase in CSI, 95% CI: -0.025, -0.012). No association was found between the selected occupational exposures and average DNA methylation levels in the two genes. Conclusion: Our findings support the hypothesis that tobacco smoking is associated with DNA hypomethylation of the AHRR and F2RL3 genes. / Objectif: Déterminer l’association entre le tabagisme et les expositions professionnelles, et les niveaux de méthylation dans les gènes AHRR et F2RL3, deux gènes impliqués dans le cancer du poumon. Méthodes : CARTaGENE est la plus grande étude de cohorte prospective au Québec, Canada. Actuellement, une étude de cas-témoin nichée dans CARTaGENE examine l’association entre la méthylation des gènes AHRR et F2RL3 et le risque de cancer du poumon (200 cas; 400 témoins). En utilisant les données de méthylation mesurées à partir de cette étude de cas-témoin nichée, les informations à propos du comportement tabagique et de l’emploi avec la plus longue durée des participants ont été obtenues à partir de questionnaires. Les informations concernant le statut tabagique, le nombre moyen de cigarettes fumées, la durée du tabagisme et le temps depuis la cessation (quand applicable) ont été paramétrées sous la forme d’un index cumulatif de tabagisme (continu). Les expositions professionnelles ont été estimées à partir de la matrice canadienne de l’exposition professionnelle. Dix-huit agents présents dans les milieux professionnels et également présents dans la fumée de tabac ont été retenus. Les ratios de méthylation de 40 sites CpG dans les gènes AHRR et F2RL3 ont été mesurés avec le Sequenom Epityper. La moyenne des ratios de méthylation de tous les sites CpG a été calculée par gène et paramétrée comme une variable continue. Des modèles séparés de régression des moindres carrés ont été utilisés pour estimer les associations entre chacun des facteurs de risque et les niveaux de méthylation des gènes AHRR et F2RL3 tout en ajustant pour des variables confondantes identifiées à l’aide de graphes acycliques dirigés. Résultats : Le tabagisme est associé avec des niveaux moyens de méthylation plus faible dans chacun des gènes après ajustement pour les variables confondantes (AHRR : -0.014 par augmentation de l’écart-type de l’index cumulatif de tabagisme, 95% IC : -0.019, -0.010; F2RL3 : -0.019 par augmentation de l’écart-type de l’index cumulatif de tabagisme, 95% IC : -0.025, -0.012). Aucune association n’a été observée entre les expositions occupationnelles sélectionnéeset les niveaux de méthylation dans ces deux gènes. Conclusion : Nos observations indiquent que le tabagisme est associé avec une hypométhylation des gènes AHRR et F2RL3.

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L'encéphalomyélite myalgique (EM), communément appelée syndrome de fatigue chronique (SFC), est une maladie chronique complexe, impliquant divers facteurs biochimiques, métaboliques, génétiques et épigénétiques dans sa pathogenèse. L'EM se caractérise par une fatigue persistante et débilitante, un malaise post-effort (PEM), des douleurs, des troubles du sommeil, des troubles cognitifs et d'autres symptômes. L'EM constitue un problème de santé important, compte tenu de sa prévalence dans la population générale. Cependant, notre compréhension des origines de l’EM reste limitée; son diagnostic est difficile et il n’existe aucun traitement curatif définitif ni de biomarqueur officiellement approuvé. Les approches de prise en charge actuelles visent principalement à soulager les symptômes, soulignant le besoin urgent de mieux comprendre ses causes sous-jacentes. Le développement de l’EM est reconnu comme une confluence de prédispositions génétiques et d’expositions environnementales, compte tenu de l’hétérogénéité clinique de cette pathologie. Ces dernières années, de nombreuses voies étiologiques ont été suggérées, notamment un développement post-infectieux de l’EM, qui reste l’une des principales hypothèses. L'implication de mécanismes épigénétiques, principalement la méthylation de l'ADN, un régulateur bien documenté de l'expression des gènes, est également apparu comme un acteur essentiel dans la pathogenèse de l'EM. Il est intéressant de noter, et avec une note d’inquiétude, que près de deux ans après la pandémie de SRAS-CoV-2 à l’origine du COVID-19, une cohorte croissante d’individus auparavant en bonne santé souffre du Long COVID (LC), une manifestation de symptômes persistants provenant de l’infection initiale. Il est remarquable de constater qu’il existe un chevauchement évident entre les présentations cliniques de l’EM et de la LC. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ce chevauchement restent encore à élucider. Dans le cadre de cette thèse, je me suis intéressée dans un premier temps à identifier les changements épigénétiques associés à l'EM à partir de la salive. Le choix d’utiliser la salive représente une approche non-invasive et découle également du fait que des études précédentes ont mis en évidence que les profils de méthylation de l’ADN obtenu des cellules buccales présentes dans la salive étaient assez similaires aux profiles observés au niveau du cerveau et des muscles (des tissus difficilement accessibles mais pourtant atteints dans l’EM) comparativement aux cellules mononuclées du sang périphériques (PBMCs). Cette approche pourrait aider à établir une signature épigénétique susceptible de combler le fossé conceptuel entre la génétique et l'influence environnementale dans la pathogenèse de l'EM. En effet, les sites CpG/gènes identifiés avec une méthylation différentielle pourraient être impliqués dans des mécanismes physiopathologiques associés au développement et/ou à la gravité de l'EM. Après correction de Bonferroni, mes travaux ont révélé un seul site CpG, "cg19803194", différentiellement méthylé chez les patients atteints d'EM par rapport aux sujets sains appariés pour l’âge. Ce site CpG est situé dans le corps du gène PTPRN2 codant pour la tyrosine phosphatase receptor type N2. De plus, le gène PTPRN2 contient un microARN intronique, le miR-153-3p (miR-153-2), qui est corégulé avec son gène hôte. En raison des défis éthiques et logistiques liés à l'accès aux tissus cérébraux ou musculaires, nous avons mesuré les niveaux circulants en miR-153-3p dans le plasma comme mesure de substitution pour évaluer les fluctuations de l'expression de PTPRN2. Nous avons donc analysé ce miARN comme un proxy prometteur pour mieux comprendre la dynamique d’expression de PTPRN2. Notre stratification des patients atteints d'EM basée sur les niveaux de méthylation de l'ADN cg19803194 (hypo vs hyper) a révélé qu'une réduction des niveaux circulants du miR-153-3p a été observée dans le groupe hypo-méthylé, ce qui concorde avec de précédentes études montrant que l'hypométhylation au niveau du corps des gènes, entraine habituellement une diminution de leur transcription. Cependant, l’intrigue a été amplifiée par un schéma contre-intuitif observé chez un sous-ensemble de patients. Cette découverte inattendue, nous a incité à découvrir un mécanisme alternatif régissant la régulation des niveaux de miR-153-3p en circulation, qui implique de manière complexe une interaction dynamique des niveaux nucléaires de PHB2 (Prohibitine 2) dans le contrôle de la maturation de certains miARN dont le miR-153-3p. La LC est un trouble complexe avec des symptômes prolongés et hétérogènes qui s’apparentent avec l’EM. Dans le cadre de ma seconde étude, nous avons utilisé une manoeuvre de provocation standardisée pour induire un malaise post-effort (PEM), ce qui nous a permis de stratifier les patients LC en deux groupes : LC1 (sévère) et LC2 (léger à modéré) en fonction de la gravité du PEM. Les patients LC1 présentaient des scores de gravité de la maladie significativement plus élevés et des scores neurocognitifs plus mauvais que les patients classés dans le groupe LC2. Ceci était étroitement lié aux scores PEM élevés chez les patients LC1 et aux scores PEM réduits chez les patients LC2. Nous avons également utilisé le profilage de la méthylation de l'ADN des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) pour étudier les changements dans la méthylation de l'ADN associés aux symptômes de la LC (n = 24) par rapport aux participants ayant eu la COVID-19, suivie d’une rémission complète (SC pour Short COVID en anglais) (n = 4). Il est intéressant de noter que nous avons identifié des altérations de plusieurs gènes impliqués dans le dysfonctionnement neurocognitif et le changement de la réponse immunitaire liés à la persistance des symptômes de la LC. En outre, dans le cadre de ma troisième étude, nous avons effectué une analyse complète de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome, à partir d'échantillons de salive provenant du même groupe de patients LC (n=24) LC, de 4 participants SC et de 13 témoins sains (HC) pré-pandémiques. Nous avons étudié les signatures épigénétiques associées à la LC. Nous avons constaté que les patients LC présentaient une hypométhylation significative de trois gènes communs, MEST, DDR1 et LRP1, par rapport aux participants SC et HC. Ces gènes sont impliqués dans la cascade de l’inflammation, l’altération de la réponse immunitaire et des maladies neurologiques. Nous avons également signalé des altérations de la méthylation de LGR6, ZFAND2A et TDG dans les PBMCs et la salive chez les mêmes individus associés à la sévérité de la LC. Plus précisément, nous avons constaté une hypométhylation au niveau des gènes LGR6 et ZFAND2A et une hyperméthylation au niveau du gène TDG dans les cas graves (groupe LC1) par rapport aux cas légers à modérés (groupe LC2). Cette convergence de profils entre la salive et les PBMCs souligne l'importance de LGR6, ZFAND2A et TDG dans la gravité des LC. L’ensemble des résultats obtenus dans le cadre de cette thèse apporte un éclairage nouveau et pertinent sur les mécanismes épigénétiques qui sous-tendent l’EM et la COVID longue. Les nouvelles connaissances présentées dans les trois manuscrits ci-joints devraient nous permettre de mieux comprendre l’EM et la COVID longue, de développer de futures stratégies diagnostiques, thérapeutiques et préventives, mais également de mieux gérer les effets à long terme de ces conditions. En effet, les altération épigénétiques identifiées dans ces deux contextes pathologiques, plus précisément au niveau de la méthylation de l’ADN, pourraient être impliquées dans la sévérité et la persistance des symptômes de ces pathologies complexes, distinctes et présentant tout de même des similitudes. / Myalgic encephalomyelitis (ME), also known as chronic fatigue syndrome (CFS), is a complex chronic disease involving various biochemical, metabolic, genetic, and epigenetic factors. Patients with ME experience persistent and debilitating fatigue, post-exertional malaise (PEM), pain, sleep disturbances, cognitive impairment, and other symptoms. ME is a significant health problem, with an estimated prevalence of 0.2% to 0.5% in the general population. However, our understanding of the origins of ME remains limited; its diagnosis is complex, and there is no definitive cure or officially approved biomarker. Current management approaches focus primarily on relieving symptoms, highlighting the urgent need to understand its underlying causes better. The development of ME is thought to be a confluence of genetic predispositions and environmental exposures. In recent years, many etiological pathways have been suggested, including a post-infectious development of ME, which remains one of the main hypotheses. The involvement of epigenetic mechanisms, primarily DNA methylation, a well-documented regulator of gene expression, has also emerged as a critical player in the pathogenesis of ME. Interestingly, and with a note of concern, nearly two years after the SARS-CoV-2 pandemic that caused COVID-19, a growing cohort of previously healthy individuals suffer from Long COVID (LC), a manifestation of persistent symptoms from the initial infection. Remarkably, there is a clear overlap between the clinical presentations of ME and LC. However, the mechanisms underlying this overlap remain to be elucidated. This thesis investigated the epigenetic mechanisms underlying ME and LC. As part of this thesis, I was initially interested in identifying the epigenetic changes associated with ME from saliva. Saliva is a non-invasive sample that can be easily collected, and previous studies have shown that the DNA methylation profiles obtained from buccal cells present in saliva are similar to those observed in the brain and muscles. This suggests that saliva could be used as a proxy for these tissues, which are difficult to access but are thought to be involved in the pathogenesis of ME. I used Bonferroni's correction to identify a single CpG site, "cg19803194", differentially methylated in ME patients compared to age-matched healthy subjects. This CpG site is located in the body of the PTPRN2 gene, which encodes the tyrosine phosphatase receptor type N2. The PTPRN2 gene also contains an intronic microRNA, miR-153-3p (miR-153-2), which is co-regulated with its host gene. Due to ethical and logistical challenges, I measured circulating levels of miR-153-3p in plasma as a surrogate measure to assess fluctuations in PTPRN2 expression. This miRNA is a promising proxy for understanding the expression dynamics of PTPRN2 because it is located in the same gene and is co-regulated with it. My stratification of ME patients based on cg19803194 DNA methylation levels (hypo vs hyper) revealed that a reduction in circulating levels of miR-153-3p was observed in the hypo-methylated group. These findings agree with previous studies showing that hypomethylation in the body of genes usually decreases their transcription. However, a counterintuitive pattern was observed in a subset of patients. This unexpected finding prompted me to discover an alternative mechanism governing the regulation of circulating miR-153-3p levels. This mechanism involves a dynamic interaction of nuclear PHB2 (Prohibitin 2) levels in controlling the maturation of certain miRNAs, including miR-153-3p. LC is a complex disorder with prolonged and heterogeneous symptoms that resemble myalgic encephalomyelitis (ME). In my second study, we used a standardized provocative maneuver to induce post-exertional sickness (PEM), which allowed us to stratify LC patients into two groups: LC1 (severe) and LC2 (mild to moderate), depending on the severity of the PEM. LC1 patients had significantly higher disease severity scores and worse neurocognitive scores than patients classified in the LC2 group. This was closely related to high PEM scores in LC1 patients and reduced PEM scores in LC2 patients. We also used peripheral blood mononuclear cell (PBMC) DNA methylation profiling to investigate changes in DNA methylation associated with LC symptoms (n=24) compared to participants who had COVID followed by complete remission Short COVID (SC) (n = 4). Interestingly, we identified alterations in several genes implicated in neurocognitive dysfunction and changes in immune response related to the persistence of LC symptoms. In my third study, we also performed a comprehensive genome-wide DNA methylation analysis of saliva samples from the same group of LC patients (n=24), 4 SC participants, and 13 pre-pandemic healthy controls (HC). We studied the epigenetic signatures associated with LC. We found that LC patients showed significant hypomethylation of three common genes, MEST, DDR1, and LRP1, compared to SC and HC participants. These genes are involved in the cascade of inflammation, impaired immune response, and neurological disease. We also reported LGR6, ZFAND2A, and TDG methylation alterations in PBMCs and saliva in the same individuals associated with CL severity. Specifically, we found hypomethylation at the LGR6 and ZFAND2A genes and hypermethylation at the TDG gene in severe cases (LC1 group) compared to mild to moderate cases (LC2 group). This convergence of profiles between saliva and PBMCs highlights the importance of LGR6, ZFAND2A, and TDG in the severity of CL. All the results obtained in this thesis shed new and relevant light on the epigenetic mechanisms underlying ME and LC. The new knowledge in the three attached manuscripts allowed us to understand ME and LC better, develop future diagnostic, therapeutic, and preventive strategies, and better manage these conditions' long-term effects. Epigenetic alterations, more precisely at the level of DNA methylation, have been identified in both ME and long-term COVID. These alterations could be involved in the severity and persistence of the symptoms of these complex pathologies, which are distinct but share some similarities. The findings of this thesis suggest that epigenetics could be a promising target for developing new treatments for ME and long-term COVID. Further research is needed to confirm these findings and to develop effective therapeutic interventions.

Schizophrenia is a severe neuropsychiatric disorder of largely unknown etiology that is often accompanied by high rates of cigarette smoking, reduced quit success, and high relapse rates. Dysregulated dopamine signaling and aberrant synaptic plasticity in the mesocorticolimbic pathway are implicated in the pathophysiology of schizophrenia and conferred substance abuse disorder and relapse vulnerability. Genetic factors are presumed to play a significant role in the development of schizophrenia, with a 40-50% concordance rate for monozygotic twins, although genetic markers are inconsistent. As such, epigenetic factors have instead been implicated. Specifically, there is strong evidence to suggest DNA methylation at several candidate genes contributes significantly to the pathophysiology of schizophrenia. To investigate this heritable component, our laboratory has developed a novel heritable model of drug abuse vulnerability in psychosis. This model is the first to show heritable increases in dopamine D2 receptor sensitivity via several behavioral and neurobiological markers, including enhanced behavioral responding to nicotine and changes in D2 signaling cascades in brain regions associated with psychosis and comorbid drug abuse. Increased D2 receptor sensitivity is the most consistent biomarker of psychosis found in preclinical animal models and postmortem brain tissue of individuals diagnosed with schizophrenia, lending considerable strength to the validity of the model. This study aimed to further validate the model as a useful and valuable tool for better understanding the pathophysiology of comorbid nicotine use and relapse in psychosis, and to explore more effective therapeutic targets than current antipsychotic medications. Results reveal DNA methylation as an epigenetic mechanism conferring heritability of the psychosis-like phenotype in the model. We additionally demonstrate altered relapse-like behavior, clinically consistent with reduced quit success and elevated relapse vulnerability. Interestingly, changes in relapse-like behavior were correlated to elevated protein levels of brain derived neurotrophic factor (BDNF), a marker of activity-dependent plasticity, in brain areas associated with drug reward. Further, modulation of the metabotropic glutamate type 5 (mGlu5) receptor alleviates the enhanced nicotine conditioned place preference observed in the model. Mechanistically, mGlu5 modulation restores normal dopamine D2 signaling and mitigates aberrant plasticity responses that are thought to drive the behavior in a region-specific manner.

Das Prostatakarzinom (PCa) ist die häufigste Krebsneuerkrankung und die zweithäufigste Krebstodesursache des Mannes in Deutschland. Die etablierten Tumormarker führen aufgrund ihrer unzureichenden diagnostischen Sensitivität und Spezifität zu Überdiagnosen mit folglich unnötigen Prostatabiopsien und den damit verbundenen klinischen Komplikationen. Darüber hinaus kann die derzeitige PSA-basierte Screeningpraxis nicht zuverlässig zwischen indolenter Erkrankung und therapienotwendigem Krebs unterscheiden. Auf DNA-Methylierung basierende Biomarker haben ein erhebliches Potenzial für die klinisch-chemische Labordiagnostik sowohl als tumorspezifische Biomarker für die Früherkennung oder posttherapeutische Überwachung von Krebs als auch als prognostische und prädiktive Biomarker für die therapeutische Stratifizierung. In dieser Arbeit erfolgte die Entwicklung neuer krebsspezifischer Methylierungs-Biomarker unter Anwendung OBBPA-ddPCR-basierter Assays. Diese neue Methode ermöglicht die Identifizierung geringster Mengen methylierter zellfreier-Tumor-DNA vor einem hohen Hintergrund von unmethylierter Wildtyp-DNA in Form einer minimal invasiven Blutprobenentnahme (liquid biopsy). Die Methylierungs-Biomarker beruhen auf Gensequenzen, welche zwischen gesunden Probanden und Patienten mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) und PCa signifikante Methylierungsunterschiede aufweisen. Die Methylierungs-Biomarker RASSF1, SOX8, GSTP1, mir129-2, CCDC181, PAI1 und NRIP3, welche eine hohe diagnostische Sensitivität bei hoher diagnostischer Spezifität aufweisen, wurden zu einem Marker-Panel kombiniert. Anschließend wurde die Eignung dieses Panels als diagnostische Tumormarker in einer weiteren Probenserie validiert. Die Proben der Optimierungs- und Validierungsprobenserie beruhten auf Serumproben von 52 gesunden Probanden, sechs BPH-Patienten und 43 PCa-Patienten. Dabei erreichte das Biomarker-Panel eine diagnostische Sensitivität von 81,40 % bei einer diagnostischen Spezifität von 100 %. Die Methylierungsanalyse der cfDNA könnte deshalb als sinnvolles Hilfsmittel, ergänzend zur PSA-Bestimmung im Serum, bei der PCa-Frühdiagnose eingesetzt werden. Außerdem legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass die Anzahl der methyliert vorliegenden epigenetischen Biomarker des Panels als prognostischer Parameter sowie zur Verlaufskontrolle und Risiko-Stratifizierung der Tumorerkrankung dienen könnte. Um diese Daten zu bestätigen und das Potenzial der cfDNA-Methylierungsanalyse weiter einschätzen zu können, bedarf es jedoch weiterer Untersuchungen mit größerer Stichprobenanzahl, verbesserter Präanalytik und größeren Probenvolumen.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Prostatakarzinom 1.2 Benigne Prostatahyperplasie 1.3 Tumor-/Biomarker 1.3.1 Flüssigbiopsie „Liquid biopsy“ 1.3.2 Zirkulierende zellfreie (Tumor-)DNA 1.3.3 Methylierung der cfDNA 1.3.4 Etablierte Tumor-Biomarker – Das Prostataspezifisches Antigen 1.4 Verfahren zu DNA-Methylierungsanalyse 1.4.1 Experimentelle Tumor-Biomaker 1.4.2 State-of-the-Art Methylierungsanalyse-Methoden 1.4.3 OBBPA-ddPCR 1.5 Motivation und Hintergrund 2 Material 2.1 Biologisches Material 2.2 Primer und Sonden 2.3 Chemikalien und Reagenzien 2.4 Puffer und Lösungen 2.5 Kitsysteme 2.6 Laborgeräte 2.7 Software 2.8 Verbrauchsmaterial 3 Methoden 3.1 Biomarker-Recherche 3.2 Primer- und Sondendesign 3.3 Whole genome amplification (WGA) des 0%-DNA-Standards (0%-SD) 3.4 Methyltransferase-Behandlung des 100%-SD 3.5 Aufreinigung der Standards 3.6 Quantitative real-time PCR (qPCR) und Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM)-PCR 3.7 Agarose-Gelelektrophorese 3.8 Isolierung zellfreier DNA aus Blutproben 3.9 DNA-Konzentrationsbestimmung 3.10 Bisulfitkonversion 3.11 Optimierte Bias-basierte Prä-Amplifikation mit anschließender ddPCR (OBBPA-ddPCR) 3.11.1 Präamplifikation 3.11.2 Droplet Digital PCR (ddPCR) 3.12 Datenanalyse 3.13 Statistische Analyse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der Biomarker-Recherche 4.2 Ergebnisse der qPCR und MS-HRM-PCR 4.2.1 Ermittlung der qPCR TA, TM und Cq-Werte der neuen Marker 4.2.2 Testung der neuen Marker in der MS-HRM-PCR an Serumproben von gesunden Probanden und PCa-Patienten 4.3 Ergebnisse der Primer- und Sondenbedingungen der OBBPA-ddPCR 45 4.3.1 ddPCR-Bedingungen 4.3.2 Präamplifikationsbedingungen 4.4 Ergebnisse der Datenanalyse und Auswertungsoptimierung 4.4.1 Datenanalyse 4.4.2 OBBPA-ddPCR-Bedingungen des Marker-Panels 4.5 Ergebnisse der Blutuntersuchungen 4.5.1 Vergleich der PCa-, BPH- und GM-Kohorten hinsichtlich ihres DNA-Methylierungsanteils 4.5.2 Vergleich der PCa-Subkohorten unterschiedlicher PSA-Wertbereiche hinsichtlich ihres Methylierungsanteils 4.5.3 Vergleich der Marker hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei 100 %iger diagnostischer Spezifität 4.5.4 Vergleich der diagnostischen Sensitivität der einzelnen Marker und des Marker-Panels hinsichtlich PCa-Proben unterschiedlicher PSA-Konzentrationsbereiche 4.5.5 Vergleich der Optimierungs- und Validierungsprobenserie hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei einer diagnostischen Spezifität von 100 % 5 Diskussion 5.1 Limitierungen etablierter PCa-Tumormarker 5.2 Suche und Etablierung eines neuen Biomarker-Panels 5.3 Ergebnisse des neu entwickelten Biomarker-Panels 5.3.1 GSTP1 5.3.2 RASSF1A 5.3.3 SOX8 5.3.4 CCDC181 5.3.5 MIR129-2 5.3.6 PAI-1 5.3.7 NRIP3 5.4 Gesamt-Performance des Biomarker-Panels 5.5 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Referenzen 9 Anhang Danksagung Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben / Prostate cancer (PCa) is the most common newly diagnosed cancer and the second leading cause of cancer-related deaths among men in Germany. The insufficient diagnostic sensitivity and specificity of established tumor markers, lead to overdiagnosis, resulting in unnecessary prostate biopsies and associated clinical complications. Furthermore, the current PSA-based screening practice cannot reliably distinguish between indolent disease and clinically significant cancer. DNA methylation-based biomarkers have significant potential for clinical laboratory diagnostics, both as tumor-specific biomarkers for early detection or post-therapeutic monitoring of cancer, and as prognostic and predictive biomarkers for therapeutic stratification. This study aimed to develop novel cancer-specific methylation biomarkers using OBBPA-ddPCR-based assays. This new method enables the identification of minute amounts of methylated cell-free tumor DNA amidst a high background of unmethylated wild-type DNA, using a minimally invasive blood sample collection (liquid biopsy). The methylation biomarkers are based on gene sequences that exhibit significant methylation differences between healthy individuals and patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) and PCa. The methylation biomarkers RASSF1, SOX8, GSTP1, mir129-2, CCDC181, PAI1, and NRIP3, which demonstrate high diagnostic sensitivity with high diagnostic specificity, were combined into a marker panel. Subsequently, the suitability of this panel as diagnostic tumor marker was validated in an additional series of samples. The optimization and validation sample series consisted of serum samples from 52 healthy individuals, six BPH patients, and 43 PCa patients. The biomarker panel achieved a diagnostic sensitivity of 81.40% with a diagnostic specificity of 100%. Therefore, the methylation analysis of cfDNA could serve as a valuable addition to serum PSA determination in the early diagnosis of prostate cancer. Additionally, the results of this study suggest that the number of hypermethylated epigenetic biomarkers of the selected panel could serve as a prognostic parameter, as well as for disease monitoring and risk stratification. However, further investigation with larger sample sizes, improved pre-analytical procedures, and larger sample volumes is needed to confirm these findings and assess the potential of cfDNA methylation analysis.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Prostatakarzinom 1.2 Benigne Prostatahyperplasie 1.3 Tumor-/Biomarker 1.3.1 Flüssigbiopsie „Liquid biopsy“ 1.3.2 Zirkulierende zellfreie (Tumor-)DNA 1.3.3 Methylierung der cfDNA 1.3.4 Etablierte Tumor-Biomarker – Das Prostataspezifisches Antigen 1.4 Verfahren zu DNA-Methylierungsanalyse 1.4.1 Experimentelle Tumor-Biomaker 1.4.2 State-of-the-Art Methylierungsanalyse-Methoden 1.4.3 OBBPA-ddPCR 1.5 Motivation und Hintergrund 2 Material 2.1 Biologisches Material 2.2 Primer und Sonden 2.3 Chemikalien und Reagenzien 2.4 Puffer und Lösungen 2.5 Kitsysteme 2.6 Laborgeräte 2.7 Software 2.8 Verbrauchsmaterial 3 Methoden 3.1 Biomarker-Recherche 3.2 Primer- und Sondendesign 3.3 Whole genome amplification (WGA) des 0%-DNA-Standards (0%-SD) 3.4 Methyltransferase-Behandlung des 100%-SD 3.5 Aufreinigung der Standards 3.6 Quantitative real-time PCR (qPCR) und Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM)-PCR 3.7 Agarose-Gelelektrophorese 3.8 Isolierung zellfreier DNA aus Blutproben 3.9 DNA-Konzentrationsbestimmung 3.10 Bisulfitkonversion 3.11 Optimierte Bias-basierte Prä-Amplifikation mit anschließender ddPCR (OBBPA-ddPCR) 3.11.1 Präamplifikation 3.11.2 Droplet Digital PCR (ddPCR) 3.12 Datenanalyse 3.13 Statistische Analyse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der Biomarker-Recherche 4.2 Ergebnisse der qPCR und MS-HRM-PCR 4.2.1 Ermittlung der qPCR TA, TM und Cq-Werte der neuen Marker 4.2.2 Testung der neuen Marker in der MS-HRM-PCR an Serumproben von gesunden Probanden und PCa-Patienten 4.3 Ergebnisse der Primer- und Sondenbedingungen der OBBPA-ddPCR 45 4.3.1 ddPCR-Bedingungen 4.3.2 Präamplifikationsbedingungen 4.4 Ergebnisse der Datenanalyse und Auswertungsoptimierung 4.4.1 Datenanalyse 4.4.2 OBBPA-ddPCR-Bedingungen des Marker-Panels 4.5 Ergebnisse der Blutuntersuchungen 4.5.1 Vergleich der PCa-, BPH- und GM-Kohorten hinsichtlich ihres DNA-Methylierungsanteils 4.5.2 Vergleich der PCa-Subkohorten unterschiedlicher PSA-Wertbereiche hinsichtlich ihres Methylierungsanteils 4.5.3 Vergleich der Marker hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei 100 %iger diagnostischer Spezifität 4.5.4 Vergleich der diagnostischen Sensitivität der einzelnen Marker und des Marker-Panels hinsichtlich PCa-Proben unterschiedlicher PSA-Konzentrationsbereiche 4.5.5 Vergleich der Optimierungs- und Validierungsprobenserie hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei einer diagnostischen Spezifität von 100 % 5 Diskussion 5.1 Limitierungen etablierter PCa-Tumormarker 5.2 Suche und Etablierung eines neuen Biomarker-Panels 5.3 Ergebnisse des neu entwickelten Biomarker-Panels 5.3.1 GSTP1 5.3.2 RASSF1A 5.3.3 SOX8 5.3.4 CCDC181 5.3.5 MIR129-2 5.3.6 PAI-1 5.3.7 NRIP3 5.4 Gesamt-Performance des Biomarker-Panels 5.5 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Referenzen 9 Anhang Danksagung Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben

No / Male-mediated developmental toxicity has been of concern for many years. The public became aware of male-mediated developmental toxicity in the early 1990s when it was reported that men working at Sellafield might be causing leukemia in their children. Human and animal studies have contributed to our current understanding of male-mediated effects. Animal studies in the 1980s and 1990s suggested that genetic damage after radiation and chemical exposure might be transmitted to offspring. With the increasing understanding that there is histone retention and modification, protamine incorporation into the chromatin and DNA methylation in mature sperm and that spermatozoal RNA transcripts can play important roles in the epigenetic state of sperm, heritable studies began to be viewed differently. Recent reports using molecular approaches have demonstrated that DNA damage can be transmitted to babies from smoking fathers, and expanded simple tandem repeats minisatellite mutations were found in the germline of fathers who were exposed to radiation from the Chernobyl nuclear power plant disaster. In epidemiological studies, it is possible to clarify whether damage is transmitted to the sons after exposure of the fathers. Paternally transmitted damage to the offspring is now recognized as a complex issue with genetic as well as epigenetic components.

DNS-Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, der essentiell für die Differenzierung embryonaler Stammzellen ist, über dessen Funktion in somatischen Zellen allerdings wenig bekannt ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei Mausmodelle analysiert, um die Rolle der durch DNS Methyltransferase 1 (DNMT1) hergestellten DNS-Methylierung im adulten hämatopoetischen System zu untersuchen. Als erstes wurde ein „Knockout“-Modell gewählt, um DNMT1 im hämatopoetischen System zu eliminieren. Des Weiteren wurde eine Mausmutante mit reduzierter DNMT1 Expression analysiert. Die vollständige Entfernung von DNMT1 aus dem hämatopoetischen System adulter Mäuse resultierte in Zytopenie und Anämie, gefolgt vom raschen Tod aller Tiere. Die Analyse des Knochenmarks dieser Mäuse zeigte einen fast vollständigen Verlust von hämatopoetischen Stamm- sowie Vorläuferzellen. Dies zeigt, dass die durch DNMT1 erzeugte DNS-Methylierung essentiell für Homöostase und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen ist. Mäuse mit reduzierter DNMT1 Expression hingegen sind lebensfähig und zeigen einen niedrigen Grad an DNS-Methylierung in verschiedensten Geweben, einschließlich des hämatopoetischen Systems. Durch eine detaillierte phänotypische und funktionelle Analyse der hämatopoetischen Stammzellen zeigte sich, dass der veränderte DNS-Methylierungsgrad ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial zur Folge hat. Interessanterweise fehlen DNMT1 hypomorphen Mäusen lymphoide Vorläuferzellen sowie reife lymphoide Zellen, wohingegen myeloide und erythroide Zellpopulationen keine Veränderungen zeigten. Genomweite Expressionsanalysen von Stammzellen sowie myeloiden Vorläuferzellen zeigten, dass hypomethylierte Stammzellen eine verfrühte myeloerythroide Entwicklung vollziehen und liefern damit eine Erklärung für den Verlust des Selbsterneurungspotenzials und der lymphoiden Entwicklung. Diese Resultate identifizieren eine bis hierhin unbekannte Funktion von spezifischen DNS-Methylierungsgraden für die Steuerung von funktionellen Programmen wie Selbsterneuerung und Differenzierung in hämatopoetischen Stammzellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic mechanisms which is known to play a role in embryonic stem cell fate, but its function in somatic stem cells is not well understood. In this thesis two different genetic mouse models were chosen to address the role of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) controlled DNA methylation in adult hematopoiesis. First, a conditional knockout approach was used to delete DNMT1 in the adult hematopoietic system. Second, DNMT1 hypomorphic mice with reduced DNMT1 expression were analyzed. Complete DNMT1 deletion in hematopoietic cells led to severe cytopenia and anemia causing rapid lethality of all animals. Bone marrow analysis revealed an almost complete absence of hematopoietic stem and progenitor cells in DNMT1 ablated primary mice as well as in secondary chimeric mice. These results indicated that DNMT1 controlled maintenance of DNA methylation is indispensable for HSCs preservation and differentiation. In contrast to complete DNMT1 deletion, mice with hypomorphic DNMT1 expression were viable, but showed low methylation levels in multiple tissues including the hematopoietic system. Detailed phenotypical and functional analysis of the hypomethylated hematopoietic stem cell (HSCs) compartment revealed an impaired homeostasis and self-renewal capacity. Intriguingly, mutant animals had profoundly reduced lymphoid cell compartments, whereas myeloid and erythroid compartments were unchanged. Expression profiling of stem and myeloid progenitor cells unexpectedly demonstrated that reduced DNA methylation forces the HSC to adopt a myeloid lineage identity. These results, showing the inability of hypomethylated HSCs to maintain an undifferentiated state, provided an explanation for their disturbed capability to self-renew and produce lymphocytes. Taken together, these findings suggest that distinct levels of DNA methylation are required to control different functional programs such as self-renewal and alternative lineage choices in HSCs, thus uncovering a previously unrecognized function for DNMT1 activity.

DNA Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, welcher entscheidend an der Organisation von Genregulation beteiligt ist. Dieser Vorgang ist wichtig für die Funktion sowohl von embryonalen als auch von Gewebs-Stammzellen. Krebszellen weisen häufig veränderte DNA Methylierungsmuster auf, was auf eine ähnlich wesentliche Rolle der DNA Methylierung in Krebsstammzellen (KSZ) hindeutet. Diese These wurde hier mit Hilfe eines Mausmodells mit verringerter Expression der DNA Methyltransferase Dnmt1 anhand verschiedener Leukämiemodelle untersucht. In einem bi-linearen B-lymphatischen/myeloischen Leukämiemodell konnte gezeigt werden, dass hypomethylierte leukämieinitiierende (Stamm-)zellen (LSZ) myeloische Krebszellen hervorbringen, allerdings nicht zur Bildung von B-lymphatischen Leukämiezellen befähigt sind. Darüber hinaus konnte in einem T-Zell-spezifischen Leukämiemodell gezeigt werden, dass reduzierte Dnmt1 Expression nicht mit der Bildung von T-Zelllymphomen vereinbar ist. Detaillierte Analysen eines myeloischen Leukämiemodells ergaben, dass hypomethylierte LSZs ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial aufweisen. Im Gegensatz zu den starken Funktionseinschränkungen hypomethylierter LSZs, hatten hypomethylierte Knochenmarks-Stromazellen keinen Effekt auf die Entwicklung von Leukämien. Außerdem führte die Behandlung leukämischer Zellen mit demethylierenden Agenzien zu einer teilweisen Aufhebung methylierungsvermittelter Genrepression. Die dadurch verstärkte Expression von Differenzierungsfaktoren verminderte das Leukämiewachstum, was einen möglichen Erklärungsansatz für das eingeschränkte Potenzial hypomethylierter Leukämien darstellt. Diese Ergebnisse demonstrieren eine zentrale Rolle der DNA Methylierung für die Selbsterneuerung und Linienwahl von LSZs, und erlauben somit neue Einblicke in die epigenetische Regulation von KSZs. Diese Erkenntnisse implizieren, dass KSZs möglicherweise ein geeignetes Ziel für epigenetische Therapieansätze darstellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic processes which is crucially involved in orchestrating gene regulation primarily by repression of gene expression. DNA methylation plays an important role in controlling functional programs of embryonic and tissue stem cells. As altered DNA methylation patterns are a hallmark of cancer, we hypothesized that DNA methylation might be equally important for cell fate determinations of cancer stem/initiating cells (CSC). To test this, I analyzed a genetic knockdown mouse model of the main somatic DNA methyltransferase Dnmt1 in the context of three different leukemia models. In a bilinear B-lymphoid/myeloid leukemia model hypomethylated bi-potential leukemia stem/initiating cells (LSCs) were shown to be capable of forming a myeloid leukemia, whereas the generation of B-lymphoid blasts was almost entirely abrogated. Moreover, failure of hypomethylated cells to develop T-cell lymphomas in a Notch1-based leukemia model demonstrated their profound lack of T-lineage commitment capacities. Furthermore, detailed analyses of a myeloid leukemia model revealed a severely impaired self-renewal potential in LSCs with reduced Dnmt1 expression. However, contrasting the drastic cell-intrinsic impairments of LSC function by reduced DNA methylation, leukemia development was found to be unaffected by hypomethylated bone marrow stroma. Mechanistically, treatment of cell lines with a demethylating drug led to enhanced expression of differentiation factors due to loss of methylation mediated gene silencing. This was followed by inhibition of leukemia cell growth, thus providing a potential mechanism for impaired functions of hypomethylated leukemias. Collectively, this thesis revealed a critical role for DNA methylation levels in malignant self-renewal and lineage fate choices. These new insights into epigenetic regulation of CSCs suggest that epigenetic therapy displays a potential treatment concept specifically targeting CSCs.

Endotoxin-tolerante Zellen zeigen über mehrere Tage eine verminderte Produktion pro-inflammatorischer Zytokine, sodass epigenetische Veränderungen ein Grund für die Endotoxintoleranz sein könnte. Im 1. Teil wurden epigenetische Veränderungen an gezielten LPS-tolerisierbaren Genen mithilfe eines in-vitro-Modells mit humanen Monozyten untersucht. Die Gene kodierend für TNF und CXCL10 zeigten eine Reduktion der transkriptionsaktivierenden Histonmarker H3K27ac und H4ac, die durch eine stark reduzierte Genexpression in toleranten Monozyten begleitet wurde. Demgegenüber wiesen Gene wie IL6 und IL1B eine Zunahme an H4ac und H3K27ac auf, während ihre Genexpression in widersprüchlicher Weise reduziert war. Repressive epigenetische Marker (H3K9me2, H3K27me3, H4K20me3, DNA-Methylierung) konnten in den untersuchten Genen nicht nachgewiesen werden. Zudem war die IL6-Genexpression verstärkt abhängig von der Signaltransduktion toleranter Monozyten, was auf unterschiedliche Repressionsmechanismen schließen lässt. Im 2. Teil konnte gezeigt werden, dass die genomweite transkriptionelle Reprogrammierung durch eine globale Verschiebung von aktiven H3K27ac und H4ac in naiven Monozyten zu repressiven H3K9me2, H3K27me3 und H4K20me3 in toleranten, restimulierten Zellen einherging. Mehr als 10000 Genombereiche wiesen Veränderungen an Histonmarkern auf, obwohl nur 3638 Gene unterschiedlich exprimiert waren. Circa 27% der differentiell exprimierten Gene zeigten ein Expressionsmuster, welches mit Veränderungen an aktiven und/oder repressiven Markern innerhalb der Promoterregion korrelierte. Zudem zeigten intergenische Regionen einen verstärkten Anstieg an repressiven Histonmarkern, was auf eine mögliche regulatorische Funktion dieser Bereiche in der Endotoxintoleranz schließen lässt. Die Studie zeigt, dass die Epigenetik der Monozyten stark von der Endotoxintoleranzinduktion betroffen ist, wenn auch nicht alle Veränderungen dem beobachteten Genexpressionsmuster zugeordnet werden konnten. / Endotoxin-tolerant cells show a reduced ability to produce pro-inflammatory cytokines for several days, which assumes an impact of epigenetic changes in endotoxin tolerance induction. Using an in vitro model with human monocytes, the first part focused on the analysis of epigenetic changes in specific LPS-tolerizable genes. The genes encoding for TNF and CXCL10 showed a reduction in the transcription-activating histone marks H3K27ac and H4ac in tolerant monocytes, which was accompanied by a strongly reduced gene expression. In contrast, the IL6 and IL1B genes showed an increase in activating histone modifications, while their gene expressions were moderately reduced. Repressive epigenetic marks (H3K9me2, H3K27me3, H4K20me3, DNA methylation) were not specifically enhanced in the genes studied. Particularly the IL6 gene expression was more susceptible to the signaling strength in tolerant monocytes implying distinct mechanisms in the repression of the genes analyzed. Within the second part, genome-wide reprogramming of tolerant monocytes was accompanied by a global shift from activating H3K27ac and H4ac in naive monocytes to repressive H3K9me2, H3K27me3 and H4K20me3 in tolerant cells treated with LPS. More than 10000 genomic regions were distinctly regulated by histone marks, though only 3638 genes were differentially expressed. Correlation analyses identified 27 % of the differentially expressed genes that showed a transcriptional level consistent with changes in activating and/or repressive histone marks within their promoter regions. Intergenic regions were highly enriched for repressive histone marks in LPS-tolerant monocytes implying a regulatory function in endotoxin tolerance. The data indicate that the epigenetic environment of monocytes is highly affected by endotoxin tolerance induction, though not all changes are directly linked to the gene expression pattern observed.