L’autoassemblage de diverses biomolécules pour former des complexes moléculaires est à la base de la machinerie cellulaire et des processus biologiques qui s’y rattachent. Il est typiquement considéré qu’un assemblage de plusieurs protéines offre des avantages régulatifs comparativement à une structure protéique similaire construite avec une ou un nombre inférieur de composantes. Ces assemblages offrent, par exemple, la possibilité de contrôler l’activité d’un complexe grâce à la dépendance directe de l’assemblage sur la concentration de ces composantes. De plus, la coopérativité d’interaction entre ces diverses composantes ouvre la voie vers l’obtention de nouveaux mécanismes de régulation. Toutefois, les avantages et les inconvénients directement reliés au nombre de composantes impliquées dans un assemblage ne sont pas totalement bien compris puisque les protéines ont évolué et ont divergé suivant des millions d’années d’évolution. L’objectif principal de cette thèse est d’abord de créer un modèle moléculaire simplifié permettant de mieux comprendre les avantages coopératifs des autoassemblages biologiques pour ensuite s’en inspirer afin de mettre au point de nouveaux mécanismes moléculaires permettant d’optimiser la plage dynamique d’interrupteurs moléculaires autoassemblés. En même temps, il sera possible de mettre en lumière certains avantages évolutifs qui ont poussé les protéines à acquérir plus de composantes moléculaires. Tout d’abord, la création d’assemblages moléculaires fut effectuée en fragmentant une structure unimoléculaire en plusieurs fragments qui pourront, grâce à leurs interactions, reformer la structure originale. Grâce à une nanostructure simple d’ADN, c.-à-d. une jonction à trois branches, il fut possible d’étudier directement l’impact du nombre de composantes sur la fonctionnalité et la régulation d’assemblages multimériques. Il fut observé, malgré l’association plus lente d’un assemblage de trois composantes, que ce même assemblage s’associe de manière plus coopérative tout en permettant la création de nouveaux mécanismes de régulation (p. ex. plage dynamique étendue, auto-inhibition et minuterie moléculaire). Ce système simplifié d’ADN a donc permis de conclure que la fragmentation d’une nanostructure en plusieurs composantes est une méthode simple permettant d’optimiser un nanosystème artificiel ou naturel. Ensuite, une autre méthode de création d’assemblages moléculaires fut étudiée. Celle-ci consiste à fusionner des domaines interagissant par le biais d’un espaceur. Dans une telle stratégie, l’espaceur est appelé à jouer un rôle important dans les propriétés de l’assemblage. Ainsi, en utilisant le même modèle d’ADN à trois composantes, il fut en effet observé que les propriétés de l’espaceur (p. ex. sa longueur, sa composition ou sa nature chimique) affectent grandement les propriétés d’assemblage d’un système à trois composantes (p. ex. sa stabilité, son niveau de coopérativité ou sa plage dynamique d’assemblage). En effectuant une étude thermodynamique approfondie sur divers assemblages trimériques d’ADN, il fut découvert qu’un espaceur optimal stabilise l’association des diverses composantes en créant une structure plus compacte où les espaceurs se cachent au coeur de la jonction. Il fut aussi démontré qu’en optimisant l’espaceur, il est possible de programmer précisément la plage dynamique d’un assemblage moléculaire à trois composantes. Finalement, ces découvertes sur les avantages d’un assemblage à trois composantes ont permis la création d’une nouvelle stratégie afin d’optimiser la plage dynamique d’interrupteurs moléculaires. À l’inverse des activateurs allostériques classiques qui altèrent la force d’interaction d’un ligand, c.-à-d. le KD, en modifiant la conformation de l’interrupteur, un activateur multivalent permet de programmer précisément la plage dynamique de l’interrupteur en exploitant une nouvelle surface d’interaction grâce à la formation d’un assemblage à trois composantes. Cette nouvelle stratégie d’optimisation des interrupteurs moléculaires fut validée grâce à une tige-boucle d’ADN servant comme balise moléculaire. Cette preuve de concept permet de démontrer la viabilité des assemblages moléculaires pour conceptualiser de nouvelles nanotechnologies avec une plage dynamique optimisée. Il est donc possible d’imaginer que les assemblages moléculaires auront un impact immédiat dans divers domaines de la nanotechnologie comme en diagnostic médical, en délivrance contrôlée de médicaments ou en imagerie moléculaire. / The self-assembly of various biomolecules to form molecular complexes is at the basis of the cellular machinery and their related biological processes. It is typically thought that an assembly of several proteins provides regulatory advantages compared to a similar protein built with one or fewer molecular components. These molecular assemblies offer, for example, the possibility to control their activity through the direct dependency of the assembly on the concentration of its components. Moreover, the cooperativity of interaction between their multiple components opens the door to acquiring novel regulation mechanisms. However, the advantages and disadvantages directly related to the number of components involved in an assembly are not totally understood since proteins have evolved and diverged over millions of years of evolution. The main objective of this thesis is to first create a simplified molecular model that will enable to better understand the cooperative advantages of biological self-assemblies. Then, inspired by these new understandings, novel molecular mechanisms will be developed to enable the optimization of the dynamic range of self-assembled molecular switches. Meanwhile, it will be possible to highlight some advantages that have pushed proteins to acquire more molecular components. The creation of molecular assemblies was demonstrated by fragmenting a nanostructure into multiple fragments which, through their intermolecular interactions, reassemble into the original structure. Using a simple DNA-based nanostructure, i.e., a three-way junction, it was possible to directly study the impact of the number of components on the functionality and regulation of multimeric assemblies. It was found that despite the slower assembly rate of a three-component assembly, this same assembly undergoes a more cooperative assembly enabling the creation of new regulatory mechanisms (e.g., extended dynamic range, self-inhibition and molecular timers). This simplified DNA-based system has therefore made it possible to conclude that fragmenting a nanostructure into multiple components is a simple method to optimize an artificial or a natural nanosystem. Next, another method to create molecular assemblies was studied. This method consists in fusing interacting domains through a linker. In this strategy, the linker will play an important role in dictating the properties of the assembly. Therefore, by using the same three-component DNA-based model, it has been observed that the chemical properties of the linker (e.g., its length, its composition, or its chemical nature) considerably affect the assembly properties of a three-component system (e.g., its stability, its level of cooperativity, or its dynamic range). Through an exhaustive thermodynamic study on various trimeric DNA-based assemblies, it was determined that the optimal linker stabilizes the association of all components by creating a more compact assembly where the linkers are buried within the core of the junction. It was also demonstrated that the optimization of the linkers allows to precisely program the dynamic range of the assembly. Finally, these discoveries on the advantages of a three-component assembly have enabled the creation of a new design strategy to optimize the dynamic range of molecular switches. In contrast to the classic allosteric activator which alters the affinity of a ligand (i.e., the KD) by changing the conformation of the switch, a multivalent activator enables to precisely program the dynamic range of a switch by exploiting a new interacting interface through the formation of a three-component assembly. This new strategy to optimize molecular switches was validated using a DNA-based molecular beacon. This proof of concept demonstrates the viability of molecular assemblies to design novel nanotechnologies with optimized dynamic range. It is possible to imagine that these molecular assemblies could have a direct impact on multiple fields of nanotechnology including medical diagnostics, controlled drug delivery and molecular imaging.

Fluoreszenzmarkierungstechniken für lebende Zellen ermöglichen es Biologen, einen Blick in eine komplexe biologische Umgebung zu werfen und Informationen über ein bestimmtes Ziel in einer nahezu natürlichen Umgebung zu erhalten. Dank der konzertierten Bemühungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft gibt es eine Fülle von kommerziell erhältlichen, genetisch kodierbaren Markern und Reportern für die Fluoreszenzmikroskopie. Allerdings gibt es nur wenige Lebendzellmethoden, die eine direkte Konjugation von Nukleinsäuren mit Proteinen erlauben, obwohl es robuste DNA-Technologien gibt, die mit Oligo-Antikörper-Konjugaten auf Zelloberflächen durchgeführt werden. Ein weiterer, oft einschränkender Aspekt der Markierung ist die Fähigkeit, Ziele selektiv zu multiplexen. In dieser Studie wurde eine Methode der Tag-Probe-Markierung entwickelt, die eine selektive, gleichzeitige Markierung von zwei verschiedenen Zielen mit zwei Peptid-Nukleinsäure-Strängen (PNA) ermöglicht. Diese Methode verwendet ein Paar von Coiled-Coil-Peptiden, um die Konjugation einer PNA-Gruppe an ein Zielprotein zu steuern, das ein Peptid-Tag exprimiert. Die Verwendung orthogonaler Coiled-Coils ermöglicht Multiplexing. Die Markierung von synthetischen Tag-Peptiden, die mittels Flüssigchromatographie analysiert wurden, hat gezeigt, dass der orthogonale duale Transfer von PNA selektiv, quantitativ und schnell ist. Die PNA-Konjugation von exemplarischen Membranrezeptoren, gefolgt von der Hybridisierung mit komplementären Fluorophor-DNAs, ermöglichte eine unkomplizierte Visualisierung von dualen Rezeptoren in lebenden Zellen. Durch den Einsatz einfacher molekularer Hilfsmittel, die die Grundlage der DNA-Nanotechnologie bilden, konnte durch die Rekrutierung mehrerer DNAs eine zunehmend hellere Markierung erreicht werden und die löschbare Oberflächenmarkierung ermöglichte eine quantitative Untersuchung der Rezeptorinternalisierung. / Live-cell fluorescent labelling techniques allow biologists to glimpse into a complex biological environment and derive information about a specific target in a near-native environment. Thanks to a concerted effort from the scientific community, a plethora of commercially available, genetically encodable tags and reporters for fluorescence microscopy exist. However, few live-cell methods allow direct conjugation of nucleic acids with proteins despite the robust DNA technologies carried out on cell surfaces using oligo-antibody conjugates. Another aspect of labelling which is often limiting is the ability to selectively multiplex targets. In this study, a method of tag–probe labelling was developed that accomplishes selective, simultaneous labelling of two distinct targets with two peptide nucleic acid (PNA) strands. The technique uses a pair of coiled-coil peptides to guide conjugation of a PNA group to a target protein expressing a peptide tag and using orthogonal coiled-coil enables multiplexing. Initially, the labelling of synthetic tag-peptides analysed by liquid chromatography revealed the orthogonal dual transfer of PNA to be selective, quantitative, and rapid. PNA conjugation of exemplar membrane receptors followed by hybridization with complementary fluorophore-DNAs achieved straightforward live-cell dual receptor visualization. Finally, using simple molecular tools that form the basis of DNA nanotechnology, recruitment of multiple DNAs facilitated progressively brighter labelling, and erasable surface labelling allowed quantitative study of receptor internalisation.

Manipulating light by controlling surface plasmons on metals is being discussed as a means for bridging the size gap between micrometer-sized photonic circuits and nanometer-sized integrated electronics. Plasmonic waveguides based on metal nanoparticles are of particular interest for circumventing the diffraction limit, thereby enabling high-speed communication over short-range distances in miniaturized micro-components. However, scalable, inexpensive fine-tuning of particle assemblies remains a challenge and near-field probing is required to reveal plasmonic interactions. In this thesis, self-assembled waveguides should be produced on DNA scaffolds. DNA origami is an extremely versatile and robust self-assembly method which allows scalable production of nanostructures with a fine control of assemblies at the nanoscale. To form the plasmonic waveguides, six-helix bundle DNA origami nanotubes are used as templates for attachment of highly monodisperse and monocrystalline gold nanoparticles with an inter-particle distance of 1-2 nm. In the first part of this thesis, the effects of parameters which are involved in assembly reactions are systematically investigated. The assembly yield and binding occupancy of the gold nanoparticles are determined by an automated, high-throughput image analysis of electron micrographs of the formed complexes. As a result, unprecedented binding site occupancy and assembly yield are achieved with the optimized synthesis protocol. In addition, waveguides with different sizes of gold nanoparticles and different inter-particle distances, quantum dots attachments to the waveguides and multimerization of the waveguides are successfully realized. In the second part of this thesis, direct observation of energy transport through a self-assembled waveguide towards a fluorescent nanodiamond is demonstrated. High-resolution, near-field mapping of the waveguides are studied by electron energy loss spectroscopy and cathodoluminescence imaging spectroscopy. The experimental and simulation results reveal that energy propagation through the waveguides is enabled by coupled surface plasmon modes. These surface plasmon modes are probed at high spatial and spectral resolutions. The scalable self-assembly approach presented here will enable the construction of complex, sub diffraction plasmonic devices for applications in high-speed optical data transmission, quantum information technology, and sensing. / Die Manipulation des Lichts durch die Kontrolle von Oberflächenplasmonen auf metallischen Oberflächen und Nanopartikeln gilt als vielversprechende Methode zur Überbrückung der Größen-Lücke zwischen Mikrometer-großen photonischen und nanometer-großen elektronischen Schaltkreisen. Plasmonische Wellenleiter basierend auf metallischen Nanopartikeln sind vom besonderen Interesse, da sie die Umgehung des Beugungslimits und somit eine Hochgeschwindigkeitskommunikation über kurze Distanzen in immer kleiner werdenden Schaltkreisen ermöglichen könnten. Allerdings ist die skalierbare und kostengünstige Anordnung von Partikeln eine große Herausforderung und es werden Nahfelduntersuchungen benötigt um plasmonische Interaktionen detektieren zu können. Das Ziel dieser Arbeit ist die Selbstassemblierung von multi-partikel Wellenleitern auf DNA Gerüsten. Die Verwendung von DNA-Origami bietet eine äußerst vielseitige Plattform zur skalierbaren Herstellung von Nanostrukturen mittels Selbstassemblierung und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Anordnungen im Nanobereich. Für den Aufbau der plasmonischen Wellenleiter werden DNA-Origami Nanoröhren, bestehend aus sechs Helices als Templat für die Anbindung von monodispersen und monokristallinen Goldnanopartikeln mit einem interpartikulären Abstand von 1-2 nm verwendet. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit werden die beeinflussenden Faktoren dieser Assemblierungsreaktion systematisch untersucht. Die Ausbeute der assemblierten Strukturen und die Besetzung der Bindungsstellen werden durch eine automatisierte und effiziente Bildanalyse von Elektronenmikroskopieaufnahmen ausgewertet. Durch die Entwicklung eines optimierten Syntheseprotokolls werden bisher unerreichte Assemblierungsausbeuten ermöglicht. Zusätzlich erfolgen die experimentelle Realisierung von Strukturen mit verschieden großen Goldnanopartikeln und unterschiedlichen interpartikulären Abständen, sowie die Anbindung von Quantenpunkten an die Wellenleiter und eine Verknüpfung der assemblierten Strukturen. Der zweite Abschnitt dieser Dissertation befasst sich mit der Untersuchung des Energietransports in selbstassemblierten Wellenleitern über einen fluoreszierenden Nanodiamanten. Dazu erfolgen hochaufgelöste Nahfeldmessungen der Wellenleiter mittels Elektronenenergieverlustspektroskopie und Kathodolumineszenz-mikroskopie. Die experimentellen Ergebnisse und zusätzlich durchgeführte Simulationen bestätigen eine durch gekoppelte Oberflächenplasmonenmoden induzierte Weitergabe der Energie innerhalb des Wellenleiters. Diese Oberflächenplasmonenmoden werden bei hoher räumlicher und spektraler Auflösung untersucht. Das hier umgesetzte Konzept der Selbstassemblierung wird den Aufbau komplexer plasmonischer Geräte für Anwendungen im Bereich der optischen Hochgeschwindigkeitsdatenübertragung, der Quanteninformations-technolgie und der Sensorik ermöglichen.

Manipulating light by controlling surface plasmons on metals is being discussed as a means for bridging the size gap between micrometer-sized photonic circuits and nanometer-sized integrated electronics. Plasmonic waveguides based on metal nanoparticles are of particular interest for circumventing the diffraction limit, thereby enabling high-speed communication over short-range distances in miniaturized micro-components. However, scalable, inexpensive fine-tuning of particle assemblies remains a challenge and near-field probing is required to reveal plasmonic interactions. In this thesis, self-assembled waveguides should be produced on DNA scaffolds. DNA origami is an extremely versatile and robust self-assembly method which allows scalable production of nanostructures with a fine control of assemblies at the nanoscale. To form the plasmonic waveguides, six-helix bundle DNA origami nanotubes are used as templates for attachment of highly monodisperse and monocrystalline gold nanoparticles with an inter-particle distance of 1-2 nm. In the first part of this thesis, the effects of parameters which are involved in assembly reactions are systematically investigated. The assembly yield and binding occupancy of the gold nanoparticles are determined by an automated, high-throughput image analysis of electron micrographs of the formed complexes. As a result, unprecedented binding site occupancy and assembly yield are achieved with the optimized synthesis protocol. In addition, waveguides with different sizes of gold nanoparticles and different inter-particle distances, quantum dots attachments to the waveguides and multimerization of the waveguides are successfully realized. In the second part of this thesis, direct observation of energy transport through a self-assembled waveguide towards a fluorescent nanodiamond is demonstrated. High-resolution, near-field mapping of the waveguides are studied by electron energy loss spectroscopy and cathodoluminescence imaging spectroscopy. The experimental and simulation results reveal that energy propagation through the waveguides is enabled by coupled surface plasmon modes. These surface plasmon modes are probed at high spatial and spectral resolutions. The scalable self-assembly approach presented here will enable the construction of complex, sub diffraction plasmonic devices for applications in high-speed optical data transmission, quantum information technology, and sensing. / Die Manipulation des Lichts durch die Kontrolle von Oberflächenplasmonen auf metallischen Oberflächen und Nanopartikeln gilt als vielversprechende Methode zur Überbrückung der Größen-Lücke zwischen Mikrometer-großen photonischen und nanometer-großen elektronischen Schaltkreisen. Plasmonische Wellenleiter basierend auf metallischen Nanopartikeln sind vom besonderen Interesse, da sie die Umgehung des Beugungslimits und somit eine Hochgeschwindigkeitskommunikation über kurze Distanzen in immer kleiner werdenden Schaltkreisen ermöglichen könnten. Allerdings ist die skalierbare und kostengünstige Anordnung von Partikeln eine große Herausforderung und es werden Nahfelduntersuchungen benötigt um plasmonische Interaktionen detektieren zu können. Das Ziel dieser Arbeit ist die Selbstassemblierung von multi-partikel Wellenleitern auf DNA Gerüsten. Die Verwendung von DNA-Origami bietet eine äußerst vielseitige Plattform zur skalierbaren Herstellung von Nanostrukturen mittels Selbstassemblierung und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Anordnungen im Nanobereich. Für den Aufbau der plasmonischen Wellenleiter werden DNA-Origami Nanoröhren, bestehend aus sechs Helices als Templat für die Anbindung von monodispersen und monokristallinen Goldnanopartikeln mit einem interpartikulären Abstand von 1-2 nm verwendet. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit werden die beeinflussenden Faktoren dieser Assemblierungsreaktion systematisch untersucht. Die Ausbeute der assemblierten Strukturen und die Besetzung der Bindungsstellen werden durch eine automatisierte und effiziente Bildanalyse von Elektronenmikroskopieaufnahmen ausgewertet. Durch die Entwicklung eines optimierten Syntheseprotokolls werden bisher unerreichte Assemblierungsausbeuten ermöglicht. Zusätzlich erfolgen die experimentelle Realisierung von Strukturen mit verschieden großen Goldnanopartikeln und unterschiedlichen interpartikulären Abständen, sowie die Anbindung von Quantenpunkten an die Wellenleiter und eine Verknüpfung der assemblierten Strukturen. Der zweite Abschnitt dieser Dissertation befasst sich mit der Untersuchung des Energietransports in selbstassemblierten Wellenleitern über einen fluoreszierenden Nanodiamanten. Dazu erfolgen hochaufgelöste Nahfeldmessungen der Wellenleiter mittels Elektronenenergieverlustspektroskopie und Kathodolumineszenz-mikroskopie. Die experimentellen Ergebnisse und zusätzlich durchgeführte Simulationen bestätigen eine durch gekoppelte Oberflächenplasmonenmoden induzierte Weitergabe der Energie innerhalb des Wellenleiters. Diese Oberflächenplasmonenmoden werden bei hoher räumlicher und spektraler Auflösung untersucht. Das hier umgesetzte Konzept der Selbstassemblierung wird den Aufbau komplexer plasmonischer Geräte für Anwendungen im Bereich der optischen Hochgeschwindigkeitsdatenübertragung, der Quanteninformations-technolgie und der Sensorik ermöglichen.

Caractériser la fonction des protéines est crucial pour notre compréhension des mécanismes moléculaires de la vie, des maladies, et aussi pour inspirer de nouvelles applications en bionanotechnologie. Pour y arriver, il est nécessaire de caractériser la structure et la dynamique de chaque état occupé par la protéine durant sa fonction. La caractérisation expérimentale des états transitoires des protéines représente encore un défi majeur parce que les techniques à haute résolution structurelle, telles que la spectroscopie RMN et la cristallographie aux rayons X, peuvent difficilement être appliquées à l’étude des états de courte durée. De plus, les techniques à haute résolution temporelle, telles que la spectroscopie de fluorescence, nécessitent généralement une chimie complexe pour introduire des fluorophores à des endroits spécifiques dans la protéine. Dans cette thèse nous introduisons l’utilisation des nanoantennes fluorescentes en tant que nouvelle stratégie pour détecter et signaler les changements de conformation des protéines via des interactions non covalentes entre des fluorophores spécifiques et la surface de la protéine. En utilisant des expériences et des simulations moléculaires, nous démontrons que des fluorophores chimiquement divers peuvent se lier et être utilisés pour sonder différentes régions d’une enzyme modèle, la phosphatase alcaline (PA). Ces nanoantennes peuvent être fixées directement aux protéines ou utilisées à l'aide du système de fixation simple et modulaire, le complexe biotine-streptavidine (SA), qui permet un criblage rapide et efficace de la nanoantenne optimale tant dans sa composition que sa longueur. Dans le cas de la PA, nous montrons que nos nanoantennes permettent la détection et la caractérisation des conformations distinctes incluant les changements conformationnels nanoscopiques produisant durant la catalyse du substrat. Nous démontrons également que les signaux fluorescents émis par la nanoantenne peuvent également permettre de caractériser la cinétique enzymatique d’une protéine en une seule expérience tout en incluant la détermination des paramètres « Michaelis-Menten » de ses substrats et inhibiteurs. Nous avons également exploré l'universalité de la stratégie ces nanoantennes fluorescentes en utilisant une autre protéine modèle, la Protéine G et son interaction avec les anticorps, et avons démontré son utilité pour mettre au point un essai permettant de détecter les anticorps. Ces nanoantennes simples et faciles à utiliser peuvent être appliquées pour détecter et analyser les changements conformationnels de toutes tailles et nos résultats suggèrent qu'elles pourraient être utilisées pour caractériser n’importe quel type de fonction. / The characterisation of protein function is crucial to understanding the molecular mechanisms of life and disease, and inspires new applications in bionanotechnology. To do so, it is necessary to characterise the structure and dynamics of each state that proteins adopt during their function. Experimental study of protein transient states, however, remains a major challenge because high-structural-resolution techniques, including NMR spectroscopy and X-ray crystallography, can often not be directly applied to study short-lived protein states. On the other hand, high-temporal-resolution techniques, such as fluorescence spectroscopy, typically require complicated site-specific labelling chemistry. This thesis introduces the use of fluorescent nanoantennas as a new strategy for sensing and reporting on protein conformational changes through noncovalent dye-protein interactions driven by a high local concentration. Using experiments and molecular simulations, we first demonstrate that chemically diverse dyes can bind and be used to probe different regions of a model enzyme, intestinal alkaline phosphatase (AP). These nanoantennas can be attached directly to proteins or employed using the simple and modular biotin-streptavidin (SA) attachment system, which enables rapid and efficient screening for high sensitivity by tuning their length and composition. We show that these nanoantennas enable the detection and characterisation of distinct conformational changes of AP, including nanoscale conformational changes that occur during substrate catalysis. We also show that the fluorescent signal emitted by the nanoantenna enables complete characterisation of enzyme kinetics in one experiment, including determination of Michaelis-Menten parameters of substrates and inhibitors of AP. We then explored the universality of the nanoantenna strategy by using a different model protein system. Protein G was shown to interact with antibodies, using a rapid screening strategy for antibody detection. These effective and easy-to-use nanoantennas could potentially be employed to monitor various conformational changes, and our results offer potential for characterising various protein functions.