Nucleic-based acid technology (NAT) is a reliable and well-established method in molecular diagnosis for the detection of bacterial infection. Specifically, PCR (polymerase chain reaction) is the most popular technique to amplify the number of DNA or RNA copies in the sample. However, due to the thermal cycles in the PCR method, advanced equipment and technologies are required to precisely control the temperature during the cycles. To overcome this limitation, isothermal amplification methods have been developed which function at constant temperatures and help reduce the need for state-of-the-art machines to perform the amplification. Among isothermal amplification methods, LAMP (loop mediated isothermal amplification) has demonstrated robustness and sensitivity compared to PCR. Additionally, microfluidic lab-on-a-chip (LOC) technology can facilitate the intensive processes which have been used traditionally in laboratories by automating the required procedures, reducing the volume of the reagents and minimizing the cost and the time of experiments. Although many microfluidic LOC devices have been developed in order to be used in resource poor settings, there is still a need for a simple setup which is inexpensive, accurate and can be performed without the need for a trained technician. In this thesis, a disposable microfluidic device was developed which is capable of performing high-throughput DNA amplification by using a simple segmentation method in order to digitize the sample into multiple micro-wells. Moreover, design and fabrication of a disposable, inexpensive flexible heater which is an inevitable part of the setup using a direct write process was introduced in order to provide the required energy for the LAMP reaction. Parallel real-time DNA amplification with limit of detection down to few copies per micro-well in less than an hour was illustrated. Using E. coli 0157, it was demonstrated that the detection time of E.coli can be as quick as 11 to 55 minutes with sample concentrations varying from 700,000 copies/micro-well (11 minutes), 70,000 copies/micro-well (18 minutes), 700 copies/micro-well (31 minutes), 7 copies/micro-well (40 minutes) and 0.07 copies/micro-well (55 minutes). Finally, the capability of the device for on chip reagent storage up to 3 days without using any coating methods was illustrated. / Thesis / Master of Applied Science (MASc)

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo127_1.pdf: 5135920 bytes, checksum: 7ce3b83de0b3c66828d195aba8d141ea (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Araceae pertence às monocotiledôneas estimando-se que inclua cerca de 3.500 espécies e 105 gêneros, com ampla distribuição mundial, exceto na Antártida. O gênero Anthurium Schott concentra o maior número de espécies (ca. de 800), seguido de Philodendron Schott que inclui cerca de 400 espécies, no qual concentra-se a maioria das análises deste trabalho. A presente avaliação inclui análises citogenéticas de 40 espécies da família Araceae, enquanto 19 espécies foram amostradas pela primeira vez através de marcadores moleculares (DNA Amplification Fingerprinting DAF). Coletas incluíram áreas de floresta amazônica (estados de Manaus e Pará) e de Mata Atlântica incluindo quatro estados brasileiros (Alagoas, Bahia, Minas Gerais e Pernambuco). Para 32 espécies tratam-se das primeiras informações citológicas. O número cromossômico 2n=32 foi observado em 21 espécies, seguido por 2n=34 em oito espécies. O número 2n=30 foi observado apenas em quatro espécies, porém, o mais incomum foi o número 2n=46, observado numa única espécie. Quanto à morfologia cromossômica, observou-se uma conservação entre as populações da maioria das espécies estudadas, com predominância de pares submetacêntricos e metacêntricos, com poucos acrocêntricos. Com base nas atuais análises e em dados da literatura, a disploidia parece ser o principal mecanismo citoevolutivo, sobretudo em Philodendron, o qual pode ser considerado como um gênero paleopoliplóide. Em 13 espécies, a coloração com fluorocromos, antes ou após o tratamento para bandeamento C, evidenciou variações qualitativas (CMA3/DAPI e CB-CMA3 Palavras-chave: Araceae, Cromossomos, Disploidia, Hibridização, Fluorocromos, DNA Amplification Fingerprinting, UPGMA. /DAPI, respectivamente), quantitativas e de posição da heterocromatina constitutiva, revelando tratar-se de um importante marcador carioevolutivo. A impregnação argêntica revelou a variação da quantidade de nucléolos em quatro espécies, que apresentaram no máximo quatro, seis ou oito nucléolos. O presente trabalho apresenta também os primeiro dados com técnicas de bandeamento para Philodendron e Anthurium (e para a família Araceae), assim como hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 45S para A. gracile. Polimorfismos revelados pelo marcador DAF e analisados pelo método de UPGMA permitiram uma distinção entre os 16 taxa analisados, com níveis significativos de polimorfismo. Dendrogramas gerados por esta metodologia foram consistentes com informações taxonômicas e dados populacionais. As relações intra, interespecíficas e intergenéricas (Philodendron e Dieffenbachia) são discutidas, revelando possíveis tendências evolutivas

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:03:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3701_1.pdf: 924546 bytes, checksum: 6684872417d2bf8760fc0c94e37a5e14 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Philodendron (Araceae) apresenta destacada importância não apenas devido a seu contingente populacional, mas também pela ampla utilização ornamental, devido à beleza e diversidade de formas e cores de suas folhagens. Conta com aproximadamente 600 espécies já registradas, distribuindo-se endemicamente nas Américas e apresentando grande diversidade na região Amazônica na Mata Atlântica, onde os exemplares do presente estudo foram coletados. Marcadores DAF (DNA Amplification Fingerprinting) são úteis na geração de polimorfismos especialmente em nível intra e interespecífico, sendo informativos em análises de diversidade genética. No presente trabalhos 37 primers foram avaliados em uma amostragem inicial incluindo seis espécies de Philodendron (dois acessos de P. megalophyllum, e um acesso de cada espécie: P. imbe, P. ornatum, P. pedatum e P. sphalerum), bem como em dois táxons testados como grupo externo: Dieffenbachia elegans e Monstera dubia. A partir desta seleção, 12 iniciadores decâmeros foram selecionados como mais informativos. Em uma avaliação mais abrangente usando-se os primers selecionados, foram avaliados membros de 26 acessos de 18 espécies de Philodendron, comparados a representantes de Dieffenbachia (2 spp.) Monstera (3 spp.) e Scaphispatha (1 spp.). Todas as espécies de Philodendron estudadas pertencem ao subgênero Philodendron, com exceção de P. goeldi e P. solimoesense do sbg. Meconostigma. No total 1108 bandas polimórficas foram incluídas na matriz de dados para a geração do dendrograma usando o método de Neighbour-Joining (bootstrap de 1000 replicações, programa MEGA 4). O dendrograma foi associado a números cromossômicos das espécies analisadas, permitindo uma avaliação comparativa de tendências cariotípicas à luz dos grupamentos gerados pelos marcadores DAF. Espécies com 2n=32 agruparam-se no dendrograma, enquanto espécies com 2n=30 e 34 uniram-se em um clado separado. Considerações adicionais sobre as relações reveladas no presente trabalho com relação ao sbg. Philodendron são também discutidas

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6319_1.pdf: 813959 bytes, checksum: ac0fdfeef1e3a6adeb19be879b540aad (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / O Brasil ocupa mundialmente a terceira posição na produção de mamona (Ricinus communis L.). Embora existam muitos estudos moleculares voltados às proteínas expressas nas sementes, não existem até o momento análises com marcadores moleculares avaliando a diversidade genética dessa espécie. O presente trabalho estudou a variabilidade genética de 16 genótipos de populações subespontâneas de mamona adquiridas através de coletas em quatro diferentes localidades de Pernambuco e em duas outras regiões do Brasil, comparando-as a acessos cultivados de quatro outros países. Para isso a metodologia de DAF (DNA amplification Fingerprinting) foi utilizada, permitindo a geração de em média 14 bandas por primer, sendo 10,72 polimórficas, a partir de 11 primers. Para a construção da matriz de dados 143 bandas foram analisadas, perfazendo 2.288 caracteres. A análise filogenética de máxima parsimônia revelou uma diversidade genética significativa, entre genótipos da mesma população, considerando os diferentes pontos de coleta no Brasil, bem como comparativamente com acessos cultivados no exterior. O estudo confirma a variabilidade sugerida pelos melhoristas para as populações subespontâneas de mamona e demonstra a eficiência deste tipo de marcador para estudos de caracterização de germoplasma desta importante cultura vegetal.

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<div>The eradication of yaws a neglected tropical disease caused by Treponema pallidum subsp. pertenue, which affects children living in very deprived hard to reach rural communities is constrained by the lack of rapid, accurate diagnosis. I sought to develop a molecular point-of-care test for the diagnosis of yaws. A Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay with primers targeting the conserved gene, tp0967, with visual detection by lateral flow test strip was developed and optimized. The limit of detection was evaluated while 63 samples from clinical cases of yaws and 5 samples with PCR-confirmed syphilis were used to determine the sensitivity and specificity of the assay compared to the current molecular testing protocol. Reagents were dried in tubes and tested up to 14 days. The developed LAMP assay was found to be optimal when run at 65oC in a water bath for 30 minutes. The limit of detection was 2.7*104 DNA copies/ml. The sensitivity of the LAMP assay using unextracted and DNA extracted samples were 0.67 and 1.00 respectively. None of the syphilis samples tested positive in any of the assays. We show the development of a fast and sensitive LAMP assay for yaws detected by lateral flow test strip. Using extracted DNA, the assay sensitivity is at par with gold standard detection. The assay can be adapted to minimal sample processing required for in-field detection without DNA extraction.</div><div><br></div>

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T12:53:20Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Nathália Leite.pdf: 1163803 bytes, checksum: ed3fcb6e6b34f0c3e3452518a29c3263 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T12:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Nathália Leite.pdf: 1163803 bytes, checksum: ed3fcb6e6b34f0c3e3452518a29c3263 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / CNPq / O presente estudo foi realizado com os objetivos de identificar acessos de feijão-caupi tolerantes ao caruncho (C. maculatus) e caracterizar esses acessos a nível molecular, em conjunto a acessos de V. unguiculata ssp. cylindrica e V. radiata, por meio de marcadores DAF (DNA Amplification Fingerprinting) e ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), visando identificar parentais promissores para futuros trabalhos de melhoramento, bem como para mapeamento, pela associação com o nível de resposta ao caruncho. Para identificação da tolerância ao caruncho em feijão-caupi, 27 acessos foram avaliados em ensaios de laboratório, utilizando-se o Delineamento Experimental Inteiramente Casualizado. Para cada acesso, uma amostra com 30 grãos de feijão-caupi foi infestada com cinco casais de caruncho com até 24 h de idade, sendo os resultados obtidos submetidos à análise estatística e suas médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Para as duas variáveis estudadas, o acesso INHUMA comportou-se como suscetível, enquanto os acessos PATATIVA e MNC99-537F-4 apresentaram-se tolerantes para ambas as variáveis. Os demais acessos testados apresentaram comportamento intermediário, o que não os diferencia em relação à INHUMA, PATATIVA e MNC99-537F-4. Na caracterização molecular dos acessos, 25 primers geraram um total de 239 amplicons, dos quais 163 foram polimórficos. Os fragmentos amplificados foram incluídos em uma matriz de dados para análise pelo método de Neighbor-Joining. No fenograma obtido, V. radiata e V. unguiculata ssp. cylindrica assumiram uma posição basal isolada dos subgrupos formados, enquanto que os acessos de V. unguiculata subdividiram-se em dois grupos, nos quais os acessos contrastantes quanto à tolerância ao caruncho se distribuíram em subgrupos distintos, o que evidencia a existência de diferenças genéticas significativas entre alguns candidatos. Nesse sentido, os resultados obtidos demonstraram que os ensaios de tolerância ao caruncho associados à aplicação de marcadores moleculares foram capazes de identificar genótipos contrastantes de feijão-caupi promissores para aplicação em trabalhos de melhoramento vegetal, bem como para a geração de populações segregantes adequadas ao mapeamento genético.

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Since the emergence of biology as a quantitative science in the past century, a lot of biological discoveries have been driven by milestone technical advances such as X-ray crystallography, fluorescence microscopy and high-throughput sequencing. Fluorescence microscopy is widely used to explore the nanoscale cellular world because of its superb sensitivity and spatial resolution. However, many species (e.g. lipids, small proteins) are non-fluorescent and are difficult to label without disturbing their native functions. In the first part of the dissertation, we explore using three different contrast mechanisms for label-free imaging of these species – absorption and stimulated emission (Chapter 2), heat generation and diffusion (Chapter 3) and nonlinear scattering (Chapter 4). We demonstrate label-free imaging of blood vessels, cytochromes, drugs for photodynamic therapy, and muscle and brain tissues with three dimensional optical sectioning capability. With the rapid development of high throughput genotyping techniques, genome analysis is currently routinely done genome-wide with single nucleotide resolution. However, a large amount of starting materials are often required for whole genome analysis. The dynamic changes in DNA molecules generate intra-sample heterogeneity. Even with the same genome content, different cells often have very different transcriptome profiles in a functional organism. Such intra-sample heterogeneities in the genome and transcriptome are often masked by ensemble analysis. In this second part of the dissertation, we first introduce a whole genome amplification method with high coverage in sequencing single human cells (Chapter 6). We then use the technique to study meiotic recombinations in sperm cells from an individual (Chapter 7). We further develop a technique that enables digital counting of genome fragments and whole genome haplotyping in single cells (Chapter 8). And we introduce our ongoing efforts on single cell transcriptome analysis (Chapter 9). In the end, we introduce our initial effort in exploring the genome accessibility at the single cell level (Chapter 9). Through the development of techniques probing the single cell genome, transcriptome and possibly epigenome, we hope to provide a toolbox for studying biological processes with genome-wide and single cell resolution. / Chemistry and Chemical Biology

The thesis has optimized DNA isolation from pure yoghurt cultures and yoghurt products. The isolated DNA was than subjected to RT-PCR analysis. In the first part of the thesis, DNA isolation from pure yoghurt cultures using a commercial kit was evaluated as more effective than isolation by phenol extraction and magnetic microparticles. To assess the quality and quantity of DNA obtained the spectrophotometric determination of concentration and purity and qPCR were used. DNA of a total of ten pure yoghurt cultures in a quality suitable for PCR was obtained using the commercial kit. In the second part of the thesis, bacterial DNA was isolated from yoghurt products using the same commercial kit with a previous sample washing by lysation solution. DNA of six yoghurt products was isolated this way. Furthermore, two packages of homemade yoghurt were mad of each product, of which DNA was isolated in the same way. DNA obtained from yoghurts was subjected to RT-PCR using six pairs of primers (V3_F a V3_R, V6_F a V6_R, V1_F a V1_R, GroHRM_F a GroHRM_R, UPF a UPR, P1V1 a P2V1) and using the pure cultures DNA as a positive controls. The results confirmed the presence of cultures declared in each yoghurt and their ability to multiply after inoculation into a new medium (milk).