Resumo não disponível.

Introdução: A doença de Machado-Joseph, também conhecida como ataxia espinocerebelar tipo 3 (DMJ/SCA3), é uma doença neurodegenerativa autossômica dominante, causada por uma expansão da repetição CAG no gene ATXN3 que tem início, em média, dos 32 aos 40 anos. Embora a disfagia seja uma das principais causas de morte na fase terminal da doença, pouco se sabe sobre suas características e progressão. Objetivos: Este estudo teve como objetivos: (1) caracterizar a disfagia na DMJ/SCA3, por meio da videofluoroscopia da deglutição (VF), considerado o exame padrão-ouro da deglutição; (2) correlacionar disfagia com critérios de gravidade - para demonstrar se, quanto pior a disfagia, pior a DMJ/SCA3; (3) correlacionar a disfagia com uma potencial consequência, a perda de peso; e (4) comparar os resultados da VF com os do questionário Quality of life in Swallowing (SWAL-QOL), em busca de validação externa para seu uso em DMJ/SCA3. Métodos: Estudo transversal em pacientes com diagnóstico molecular de DMJ/SCA3, acima de 18 anos de idade. Após o consentimento, dados clínicos e Índice de Massa Corporal (IMC) foram obtidos e escalas clínicas foram aplicadas: Índice de Barthel, WHO-QOL BREF, SWAL-QOL, Beck Depression Inventory (BDI), NESSCA e SARA. O número de expansões da repetição CAG no gene ATXN3 (CAGexp) foi medido anteriormente. Os indivíduos foram submetidos à VF, do qual foram obtidos os escores DOSS (Dysphagia Outcomes Severity Scale) e PAS (Penetration Aspiration Scale). Comparações entre os grupos foram feitas pelo Mann-Whitney (MW) e Spearman, com p <0,05 e poder do teste de 80%. Resultados: 34 pacientes foram incluídos. As variáveis avaliadas apresentaram os seguintes resultados [mediana (EPE)]: idade de 53 (2,6) anos; idade de início de 38 (2) anos; duração da doença (DD) de 10 (1) anos; CAGexp de 74 (0,6); IMC de 23 (0,8). NESSCA de 18,4 (0,9); SARA de 15 (1.5), SWALQOL total de 65,5 (2,7); Índice de Barthel de 85 (3,6); WHO-QOL de 50 (3,1); DOSS de 5 (0,2) e PAS de 1 (0,4). Escores DOSS e PAS se correlacionaram, com um rho=-0,8; p = 0,0001, e a maioria dos pacientes apresentou disfagia leve. Indivíduos com escores graves de DOSS tiveram SARA e NESSCA significativamente mais elevados do que o grupo com disfagia leve (p = 0,003 e 0,02, MW); aqueles com escores PAS graves apresentaram escores SARA significativamente maior que o grupo com escore PAS leve (p = 0,007, MW). Ambos DOSS (rho = 0,454, p = 0,007) e PAS (rho = -0,453, p = 0,007) se correlacionaram com o IMC. O escore SWAL-QOL total não se associou com os escores da VF, mas um dos seus domínios,“duração da alimentação" se associou com DOSS (rho = 0,446, p = 0,008) e PAS (rho = -0,497, p = 0,003). Discussão: A disfagia não se associa à DD ou à CAGexp, mas tem correlação com escores clínicos SARA e NESSCA. Os indivíduos com escores maiores de disfagia apresentaram menor IMC, provavelmente decorrente da perda de peso. O questionário SWAL-QOL completo não parece adequado para avaliar a DMJ/SCA3; no entanto, não se pode rejeitar sua aplicabilidade. Escores menores de 20% no domínio duração da alimentação mostraram associação com disfagia grave. A fim de evitar a aspiração, propõe-se que a VF seja realizada em qualquer paciente DMJ/SCA3 que apresente pelo menos uma das seguintes características: SARA ≥15 pontos, e / ou domínio “duração da alimentação” do SWAL-QOL ≤ 50%. No caso de pacientes brasileiros, um IMC de 23kg/m² poderia ser utilizado como cutoff para o mesmo processo. Estes cutoffs alcançaram 100% de sensibilidade para detectar disfagia significativa na VF. Nesses casos, é necessário que seja ofertado manejo nutricional adequado. / Introduction: Machado-Joseph disease, also known as Spinocerebellar Ataxia type 3 (MJD/SCA3), is an autosomal dominant neurodegenerative disease, caused by an expanded CAG repeat in ATXN3 gene, with an age at onset between 32-40 years old. Although one of the main causes of death in terminal phase, dysphagia characteristics and progression are not fully known yet. Objectives: This study aimed (1) to characterize dysphagia in MJD/SCA3, through videofluoroscopy of swallowing (VF), considered a gold-standard examination of swallowing; (2) to correlate dysphagia with severity criteria – to demonstrate if dysphagia worsens as the disease worsens; (3) to correlate dysphagia with a potential consequence: the weight loss; and (4) to compare the results of VF with the results of SWAL-QOL, searching for external validation for its use in MJD/SCA3. Methods: Cross-sectional study on patients over 18 years old with a molecular diagnosis of MJD/SCA3. After consent, general clinical data and body mass index (BMI) were obtained, and clinical scales were applied: Barthel Index, WHO-QOL BREF, Quality of life in Swallowing (SWAL-QOL), Beck Depression Inventory (BDI), NESSCA and SARA. The length of the expanded CAG (CAGexp) repeat in ATXN3 gene was previously measured. Subjects were submitted to VF, from which the scores Dysphagia Outcomes Severity Scale (DOSS) and Penetration Aspiration Scale (PAS) were obtained. Comparisons between groups were made by Mann-Whitney U (M-W) and Spearman tests, with p < 0.05 and power of the test of 80%. Results: 34 patients were included. The variables evaluated showed the following results [median(SEM)]: age was 53 (2,6); age at onset was 38 (2); disease duration was 10 (1); CAG exp was 74 (0,6); BMI was 23 (0,8). NESSCA was 18,4 (0,9); SARA was 15 (1.5), SWAL-QOL total 65,5 (2,7); Barthel Index was 85 (3,6); WHO-QOL was 50 (3,1); DOSS was 5 (0,2) and PAS was 1 (0,4). DOSS and PAS scores were correlated with a rho= -0.8 (p = 0.0001); the majority of patients presented mild scores of dysphagia severity. Subjects with severe DOSS scores showed SARA and NESSCA scores significantly higher than the mild group (p = 0.003 and 0.02, MW); those with severe PAS scores presented SARA scores significantly higher than the mild PAS group (p = 0.007, M-W). Both DOSS (rho=0.454, p=0.007) and PAS (rho=-0.453, p=0.007) correlated with BMI. SWAL-QOL scores as a whole were not associated with the VF scores, but one of its domains, “eating duration”, was associated with DOSS (rho=0.446, p=0.008) and PAS (rho=-0.497, p=0.003) scores. “Eating duration” scores lower than 20% were associated with severe dysphagia. Discussion: Dysphagia was not associated with duration of disease or with CAGexp, but with clinical scores SARA and NESSCA. Subjects with higher scores of dysphagia presented lower BMI probably because they lose weight. SWAL-QOL as a whole does not seem appropriate to evaluate this disease, however we cannot reject its applicability. In order to prevent aspiration, we propose a VF study in any MJD/SCA3 patient presenting at least one of the following: SARA scores ≥15, and/or a eating duration item-SWAL-QOL ≤ 50%. In the case of Brazilian patients, a BMI of 23kg/m² could also be used as a cutoff for the same decision making process. These cutoffs presented 100% sensitivities to detect important dysphagia at DOSS and PAS scores. In those cases where an important dysphagia is detected at VF, appropriate nutritional management should be offered.

O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.

O ácido quinolínico (AQ) é um metabólito do metabolismo do triptofano produzido na via das quinureninas. Demonstrou-se ser um fraco agonista de receptores NMDA, porém capaz de produzir morte em neurônios susceptíveis via ativação à sua ação excitatória. O envolvimento do AQ tem sido sugerido como um mecanismo patológico em diversas doenças neurodegenerativas, incluindo-se as doenças de Huntington, Alzheimer e no complexo de demência induzida pela síndrome da imunodeficiência adquirida. As propriedades neurotóxicas do AQ têm sido atribuídas principalmente à excitotoxicidade e ao estresse oxidativo, enquanto muito pouco se sabe sobre seus efeitos sobre o metabolismo energético cerebral. Assim, no presente estudo investigamos o efeito da administração intraestriatal de AQ (150 nmol) em ratos de 30 dias de vida sobre as atividades de enzimas fundamentais do metabolismo energético, tais como os complexos IIV da cadeia respiratória, creatina quinase e citrato sintase, além da produção de 14CO2 a partir de [1-14C]acetato 3, 6 ou 12 horas após a injeção de AQ. Observamos que a injeção de AQ inibiu significativamente a atividade dos complexos II (50%), III (46%) e II-III (35%), bem como da enzima creatina quinase (27%), mas não alterou as atividades dos complexos I e IV em estriados preparados 12 horas após a injeção de AQ. Além disso, não observamos quaisquer alterações nessas atividades enzimáticas 3 ou 6 horas após o tratamento com AQ. A produção de 14CO2 a partir de [1-14C]acetato também foi inibida significativamente (27 %) pelo AQ somente em estriados preparados 12 horas após a injeção. As atividades dos complexos da cadeia respiratória e da creatina quinase foram também medidas em homogeneizados de estriado expostos a 100 μM de AQ. Não foram observadas alterações nessas atividades na presença de AQ. Essas observações in vitro juntamente com os achados ex vivo sugerem que a ação do AQ comprometendo o metabolismo energético em estriado de ratos é provavelmente indireta. Novos experimentos foram realizados para elucidar os mecanismos envolvidos nas inibições das atividades das enzimas do metabolismo energético induzidas pelo AQ. O pré-tratamento dos ratos com MK-801, um antagonista de receptores NMDA, ou com creatina preveniu completamente os efeitos inibitórios induzidos pelo AQ. Além disso, os seqüestradores de radicais livres α-tocoferol mais ascorbato e o inibidor da óxido nítrico sintase L-NAME preveniram completamente as inibições provocadas pelo AQ nas atividades do complexo III e da creatina quinase, indicando que esses efeitos inibitórios são provavelmente devido à geração de espécies reativas. Por outro lado, o pré-tratamento com piruvato bloqueou completamente os efeitos inibitórios causados pela injeção de AQ na atividade do complexo II e parcialmente a inibição da atividade da creatina quinase indicando que esses efeitos foram provavelmente devido à formação de espécies reativas Tomadas em conjunto, esses resultados indicam fortemente que a fosforilação oxidativa e a transferência energética celular estão comprometidas por altas concentrações de AQ no estriado de ratos jovens e que os efeitos inibitórios em enzimas chave do metabolismo energético causados pela injeção de AQ são provavelmente devido à ativação de receptores NMDA. / Quinolinic acid (QA), an endogenous metabolite produced in kynurenine pathway of tryptophan metabolism, is a weak agonist at the NMDA receptor, and selectively kills susceptible neurons via activation of the NMDA receptors The neurotoxic capacity of QA in vivo has implicated it in a variety of neurodegenerative disorders, including Huntington’s disease, Alzheimer’s disease and AIDS dementia complex. Most of QA toxic properties have been attributed to excitotoxicity and oxidative stress, whereas very little is known about its effects on brain energy metabolism. Therefore, in the present study we investigated the ex vivo effect of intrastriatal administration of 150 nmol QA to 30-day-old rats on critical enzyme activities of energy metabolism, including the respiratory chain complexes I-IV, creatine kinase and citrate synthase, as well as on 14CO2 production from [1-14C]acetate at distinct periods after QA injection. We observed that QA injection significantly inhibited complexes II (50%), III (46%) and II-III (35%), as well as creatine kinase (27 %), but not complexes I and IV activities in striatum prepared 12 hours after QA treatment. In contrast, no alterations of these enzyme activities were observed 3 or 6 hours after QA treatment. 14CO2 production from [1-14C]acetate was also significantly inhibited (27 %) by QA only in rat striatum prepared 12 hours after injection. The respiratory chain complexes and creatine kinase activities were also measured in striatum homogenates exposed to 100 μM QA. No alterations of these activities were observed in the presence of QA. These in vitro observations allied to the ex vivo findings suggest that QA compromises energy metabolism in the rat striatum indirectly rather than due to a direct action of QA on the enzymes. New experiments were therefore designed to elucidate the involved mechanisms of QA-induced inhibition on the enzymatic activities of energy metabolism. Pretreatment with the NMDA receptor antagonist MK-801 and with creatine totally prevented the inhibitory effects elicited by QA. In addition, the free-radical scavengers α-tocopherol plus ascorbate and the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME completely abolished the inhibitions provoked by QA on CK and complex III, indicating that these effects were probably due to generation of reactive species. On the other hand, pyruvate pretreatment totally blocked the inhibitory effects of QA injection on complex II activity and partially prevented QA-induced CK inhibition. Taken together, these observations strongly indicate that oxidative phosphorylation and cellular energy transfer are compromised by high concentrations of QA in the striatum of young rats and that the inhibitory effects caused by QA injection on critical steps of energy metabolism were probably mediated by NMDA stimulation.

Introdução: A doença de Machado-Joseph, também conhecida como ataxia espinocerebelar tipo 3 (DMJ/SCA3), é uma doença neurodegenerativa autossômica dominante, causada por uma expansão da repetição CAG no gene ATXN3 que tem início, em média, dos 32 aos 40 anos. Embora a disfagia seja uma das principais causas de morte na fase terminal da doença, pouco se sabe sobre suas características e progressão. Objetivos: Este estudo teve como objetivos: (1) caracterizar a disfagia na DMJ/SCA3, por meio da videofluoroscopia da deglutição (VF), considerado o exame padrão-ouro da deglutição; (2) correlacionar disfagia com critérios de gravidade - para demonstrar se, quanto pior a disfagia, pior a DMJ/SCA3; (3) correlacionar a disfagia com uma potencial consequência, a perda de peso; e (4) comparar os resultados da VF com os do questionário Quality of life in Swallowing (SWAL-QOL), em busca de validação externa para seu uso em DMJ/SCA3. Métodos: Estudo transversal em pacientes com diagnóstico molecular de DMJ/SCA3, acima de 18 anos de idade. Após o consentimento, dados clínicos e Índice de Massa Corporal (IMC) foram obtidos e escalas clínicas foram aplicadas: Índice de Barthel, WHO-QOL BREF, SWAL-QOL, Beck Depression Inventory (BDI), NESSCA e SARA. O número de expansões da repetição CAG no gene ATXN3 (CAGexp) foi medido anteriormente. Os indivíduos foram submetidos à VF, do qual foram obtidos os escores DOSS (Dysphagia Outcomes Severity Scale) e PAS (Penetration Aspiration Scale). Comparações entre os grupos foram feitas pelo Mann-Whitney (MW) e Spearman, com p <0,05 e poder do teste de 80%. Resultados: 34 pacientes foram incluídos. As variáveis avaliadas apresentaram os seguintes resultados [mediana (EPE)]: idade de 53 (2,6) anos; idade de início de 38 (2) anos; duração da doença (DD) de 10 (1) anos; CAGexp de 74 (0,6); IMC de 23 (0,8). NESSCA de 18,4 (0,9); SARA de 15 (1.5), SWALQOL total de 65,5 (2,7); Índice de Barthel de 85 (3,6); WHO-QOL de 50 (3,1); DOSS de 5 (0,2) e PAS de 1 (0,4). Escores DOSS e PAS se correlacionaram, com um rho=-0,8; p = 0,0001, e a maioria dos pacientes apresentou disfagia leve. Indivíduos com escores graves de DOSS tiveram SARA e NESSCA significativamente mais elevados do que o grupo com disfagia leve (p = 0,003 e 0,02, MW); aqueles com escores PAS graves apresentaram escores SARA significativamente maior que o grupo com escore PAS leve (p = 0,007, MW). Ambos DOSS (rho = 0,454, p = 0,007) e PAS (rho = -0,453, p = 0,007) se correlacionaram com o IMC. O escore SWAL-QOL total não se associou com os escores da VF, mas um dos seus domínios,“duração da alimentação" se associou com DOSS (rho = 0,446, p = 0,008) e PAS (rho = -0,497, p = 0,003). Discussão: A disfagia não se associa à DD ou à CAGexp, mas tem correlação com escores clínicos SARA e NESSCA. Os indivíduos com escores maiores de disfagia apresentaram menor IMC, provavelmente decorrente da perda de peso. O questionário SWAL-QOL completo não parece adequado para avaliar a DMJ/SCA3; no entanto, não se pode rejeitar sua aplicabilidade. Escores menores de 20% no domínio duração da alimentação mostraram associação com disfagia grave. A fim de evitar a aspiração, propõe-se que a VF seja realizada em qualquer paciente DMJ/SCA3 que apresente pelo menos uma das seguintes características: SARA ≥15 pontos, e / ou domínio “duração da alimentação” do SWAL-QOL ≤ 50%. No caso de pacientes brasileiros, um IMC de 23kg/m² poderia ser utilizado como cutoff para o mesmo processo. Estes cutoffs alcançaram 100% de sensibilidade para detectar disfagia significativa na VF. Nesses casos, é necessário que seja ofertado manejo nutricional adequado. / Introduction: Machado-Joseph disease, also known as Spinocerebellar Ataxia type 3 (MJD/SCA3), is an autosomal dominant neurodegenerative disease, caused by an expanded CAG repeat in ATXN3 gene, with an age at onset between 32-40 years old. Although one of the main causes of death in terminal phase, dysphagia characteristics and progression are not fully known yet. Objectives: This study aimed (1) to characterize dysphagia in MJD/SCA3, through videofluoroscopy of swallowing (VF), considered a gold-standard examination of swallowing; (2) to correlate dysphagia with severity criteria – to demonstrate if dysphagia worsens as the disease worsens; (3) to correlate dysphagia with a potential consequence: the weight loss; and (4) to compare the results of VF with the results of SWAL-QOL, searching for external validation for its use in MJD/SCA3. Methods: Cross-sectional study on patients over 18 years old with a molecular diagnosis of MJD/SCA3. After consent, general clinical data and body mass index (BMI) were obtained, and clinical scales were applied: Barthel Index, WHO-QOL BREF, Quality of life in Swallowing (SWAL-QOL), Beck Depression Inventory (BDI), NESSCA and SARA. The length of the expanded CAG (CAGexp) repeat in ATXN3 gene was previously measured. Subjects were submitted to VF, from which the scores Dysphagia Outcomes Severity Scale (DOSS) and Penetration Aspiration Scale (PAS) were obtained. Comparisons between groups were made by Mann-Whitney U (M-W) and Spearman tests, with p < 0.05 and power of the test of 80%. Results: 34 patients were included. The variables evaluated showed the following results [median(SEM)]: age was 53 (2,6); age at onset was 38 (2); disease duration was 10 (1); CAG exp was 74 (0,6); BMI was 23 (0,8). NESSCA was 18,4 (0,9); SARA was 15 (1.5), SWAL-QOL total 65,5 (2,7); Barthel Index was 85 (3,6); WHO-QOL was 50 (3,1); DOSS was 5 (0,2) and PAS was 1 (0,4). DOSS and PAS scores were correlated with a rho= -0.8 (p = 0.0001); the majority of patients presented mild scores of dysphagia severity. Subjects with severe DOSS scores showed SARA and NESSCA scores significantly higher than the mild group (p = 0.003 and 0.02, MW); those with severe PAS scores presented SARA scores significantly higher than the mild PAS group (p = 0.007, M-W). Both DOSS (rho=0.454, p=0.007) and PAS (rho=-0.453, p=0.007) correlated with BMI. SWAL-QOL scores as a whole were not associated with the VF scores, but one of its domains, “eating duration”, was associated with DOSS (rho=0.446, p=0.008) and PAS (rho=-0.497, p=0.003) scores. “Eating duration” scores lower than 20% were associated with severe dysphagia. Discussion: Dysphagia was not associated with duration of disease or with CAGexp, but with clinical scores SARA and NESSCA. Subjects with higher scores of dysphagia presented lower BMI probably because they lose weight. SWAL-QOL as a whole does not seem appropriate to evaluate this disease, however we cannot reject its applicability. In order to prevent aspiration, we propose a VF study in any MJD/SCA3 patient presenting at least one of the following: SARA scores ≥15, and/or a eating duration item-SWAL-QOL ≤ 50%. In the case of Brazilian patients, a BMI of 23kg/m² could also be used as a cutoff for the same decision making process. These cutoffs presented 100% sensitivities to detect important dysphagia at DOSS and PAS scores. In those cases where an important dysphagia is detected at VF, appropriate nutritional management should be offered.

Orientador: Iscia Lopes-Cendes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T06:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_DanielaMedeirosde_M.pdf: 23763981 bytes, checksum: e8d873d8f839f0dd4f2d31d57c4088c4 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Doenças mitocondriais são entidades clínica e geneticamente heterogêneas, variando consideravelmente com relação à idade de início, ao quadro clínico e à evolução. São subdivididas entre defeitos do DNA nuclear ou do DNA mitocondrial (mtDNA). Mutações de ponto são comumente encontradas no genoma mitocondrial, e dentre estas, os quadros clínicos mais fteqüentemente associados são: MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes), MERRF (myoclonic epilepsy and ragged-red fibers), NARP (neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa), :MILS (matemally inherited Leigh syndrome) e LHON (Leber hereditary optic neuropathy). Este projeto teve como objetivos: a) pesquisar a presença das principais mutações de ponto no mtDNA de pacientes com quadro clínico sugestivo de MELAS, MERRF, NARP, :MILS e LHON; b) estabelecer a correlação genótipo-fenótipo tendo em vista a significativa variabilidade clínica destas entidades; c) quantificar a porcentagem de mtDNA mutante e normal em indivíduos afetados. O DNA foi obtido de amostras de sangue periférico. As regiões de interesse do mtDNA foram amplificadas pela reação em cadeia da polimerase (PCR). A detecção das mutações de ponto foi realizada pela triagem com enzimas de restrição e posteriormente confirmadas pelo seqüenciamento manual das regiões envolvidas. A quantificação foi feita pelo sistema Kodak EDAS 290. Foram triados 120 pacientes para as principais mutações responsáveis pelas síndromes MELAS, MERRF, NARP, :MILSe LHON. Em sete pacientes foram observadas mutações de ponto no mtDNA. Entre oito pacientes com suspeita de Leber, dois apresentaram a mutação G11778A e um a mutação G3460A. Um paciente com suspeita de MELAS e quatro familiares assintornáticos deste apresentaram a mutação A3243G; uma paciente apresentou a mutação A8344G responsável por MERRF; dois irmãos com suspeita de NARP apresentaram a mutação G11778A responsável por Leber; nenhuma mutação no nucleotídeo 8993 foi encontrada / Abstract: Mitochondrial disease are genetic and clinic heterogeneous entities that are variable in age of onset, clinical severity and evolution. They are classified in abnormalities of nuclear DNA or mitochondrial DNA (mtDNA). Point mutations are found in mitochondrial genomes and most frequent phenotypes are MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes), MERRF (myoclonic epilepsy and ragged-red fibers), NARP (neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa), MILS (maternally inherited Leigh syndrome) e LHON (Leber Hereditary Optic Neuropathy). The objectives ofthis study were: a) To search for the presence of the most frequently described point mutations in the mtDNA in patients with clinical features suggesting MELAS, MERRF, NARP, MILS or LHON. b) To study the relationship between genotype and phenotype in patients with mutation. c) Quantify the heteroplasmy in atIected individuals. Mitochondrial DNA was isolated &om peripheralleukocytes and was purified by use of the phenol clorophormio method. PCR was used to amplify the critical regions. Restriction-fragment analysis was used to screen for mtDNA point mutations, that was confinned by DNA sequencing. The percentage of mutant mtDNA was determined by the system Kodak EDAS 290. We screened 120 patients for seven points ofmutation responsible for MELAS, MERRF, NARP, MILS and LHON and we identified seven patients with a mtDNA point mutation. Eight patients were suspected of Leber disease, in two of them, we found the G11778 mutation, and another patient presented the G3460A mutation. One patient with the clinical diagnosis of MELAS, as well as his mother and three asymptomatic sisters, showed the A3243G mutation. One patient had the A8344G mutation responsible for MERRF and two brothers with NARP features had the G11778A mutation that was associated with Leber disease. No mutation at 8993 nucleotide was observed. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422465-Texto+Completo-0.pdf: 2691735 bytes, checksum: 1455a538e61f307699a636bd9041725c (MD5) Previous issue date: 2010 / Systemic and cellular iron homeostasis is regulated by a series of proteins that control iron uptake, transport, storage and utilization. The neonatal period is critical for the establishment of iron content in the adult brain; also it is known that iron content increases in brain regions during the aging process. Abnormally high levels of iron are observed in the brain of patients suffering from neurodegenerative disorders however; the mechanisms involved in iron accumulation are poorly understood. In the present study we investigated the effects of aging and neonatal iron overload on the mRNA expression of proteins critically involved in controlling iron homeostasis: Transferrin Receptor (TfR), H-ferritin, IRP2, Divalent Metal Transporter 1 (DMT1), Ceruloplasmin (CP) and Hepicidin. Wistar rat pups received a single daily dose of vehicle (5% sorbitol in water) or iron (10 mg/kg of b. w. of Fe2+), at postnatal days 12-14. The mRNA expression of these proteins was analyzed by a semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction assay in cortex, hippocampus and striatum of rats sacrificed at three different ages (15-day-old; 90-day-old and 2-year old rats). Results indicate that TfR, H-ferritin and IRP2 mRNA expression was differentially affected by aging and by neonatal iron treatment in all three brain regions. We also found that DMT1 and CP mRNA expression is influenced by age in control rats. Moreover, our results suggest that neonatal iron treatment differentially impacts DMT1 mRNA expression in the cortex and striatum of young rats; and CP mRNA expression in the cortex of young rats, and in the hippocampus of aged rats. Hepcidin results indicate that neonatal iron treatment induced an increase in mRNA levels in hippocampus of young rats. These findings might have implications for the understanding of iron homeostasis misregulation associated with neurodegenerative disorders. / A homeostasia sistêmica e celular do ferro é regulada por uma série de proteínas que controlam a captação, o transporte, o armazenamento e a utilização deste metal. O período neonatal é crítico para o estabelecimento da concentração de ferro no cérebro adulto. Além disso, também se sabe que a concentração de ferro aumenta nas regiões cerebrais durante o processo de envelhecimento. Níveis anormalmente elevados de ferro são observados no cérebro de pacientes que apresentam doenças neurodegenerativas, entretanto os mecanismos envolvidos no acúmulo de ferro ainda não são claros. Neste estudo nós investigamos os efeitos do envelhecimento e da sobrecarga de ferro neonatal na expressão de RNAm de proteínas criticamente envolvidas no controle da homeostasia do ferro: Receptor de Transferrina (TfR), H-ferritina, IRP2, Transportador de Metal Divalente 1 (DMT1), Ceruloplasmina (CP) e Hepicidina. Ratos Wistar filhotes receberam uma única dose diária de veículo (5% sorbitol em água) ou ferro (10 mg/kg de peso corporal de Fe2+), do 12° ao 14° dia de vida pós-natal. As expressões de RNAm destas proteínas foram analisadas por RT-PCR, um método semi-quantitativo, no córtex, hipocampo e estriado de ratos sacrificados em três diferentes idades (15 dias; 90 dias e 2 anos de idade). Os resultados indicaram que a expressão de RNAm de TFR, H-ferritina a IRP2 foram diferentemente afetadas pelo envelhecimento e pelo tratamento neonatal com ferro nas diferentes regiões do cérebro estudadas. Também se observou que a expressão de RNAm de DMT1 e CP é influenciada pela idade nos ratos controle. Além disso, nossos resultados sugerem que o tratamento neonatal com ferro afeta de forma diferente a expressão de RNAm de DMT1 no córtex e estriado de ratos jovens; e a expressão de RNAm de CP no córtex de ratos jovens, e no hipocampo de ratos velhos. Com relação à Hepicidina, os resultados indicam que o tratamento com ferro no período neonatal induz um aumento nos níveis de RNAm no hipocampo de animais jovens. Estes resultados podem ajudar a entender de que maneira as alterações na homeostasia do ferro podem estar associadas à patogênese das doenças neurodegenerativas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448467-Texto+Completo-0.pdf: 1354318 bytes, checksum: e98c36f8757b493a6c1604f1618bfb2d (MD5) Previous issue date: 2013 / Iron accumulation in the brain has been observed in both normal aging and in several neurodegenerative diseases. We have previously shown that brain iron loading results in persistent memory deficits, which are accompanied by oxidative stress. Due to the high metabolic rate of the nervous system, mitochondria are present in large numbers in nerve cells. It has been demonstrated that through fission and fusion of mitochondria, these organelles promote changes in their structure and this dynamic can affect mitochondrial function and vice-versa. Deficits in supplying energy to the synapses have been linked to neurodegenerative diseases and once the functionality of neural circuits is reduced, these cells may activate neuronal death cascades. Here, we analyzed the effects of neonatally iron treatment on the following targets: Dynamin-1-like protein (DNM1L) and Optic atrophy 1 (OPA1), proteins involved in regulating mitochondrial fission and fusion, respectively; Caspase 3, a key protease of the effector phase of apoptosis; and Synaptophysin, as a synaptic marker. Additionally, we investigated the effects of Cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, previously shown to improve memory in iron-treated rats, in reversing iron-induced effects on DNM1L, OPA1, caspase 3, and synaptophysin. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30mg/kg) at postnatal days 12-14. At adulthood, they were treated with vehicle or CBD (10 mg/kg) for 14 days. Hippocampal and cortical protein levels and gene expression were quantified using western blotting analysis and RT-qPCR, respectively. Quantitative measurements of proteins were made using densities of individual proteins, normalized to the density of β-actin. On RT-qPCR, samples were normalized to three reference genes (GAPDH, HPRT1 and RPL13A). Western blotting results indicated that neonatal iron treatment induced a significant reduction of DNM1L in the hippocampus and OPA1 in the cortex. Iron was also shown to increase caspase 3 both in the hippocampus and cortex, which was accompanied by a significant reduction of synaptophysin levels in the hippocampus. CBD reversed iron-induced effects, bringing hippocampal DNM1L, caspase 3 and synaptophysin levels back to values comparable to the control group. The present results suggest that iron may affect mitochondrial dynamics, possibly trigging synaptic loss and apoptotic cell death. The reversion of these effects by CBD, indicates its potential neuroprotective effect. / O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Previamente, mostramos que a sobrecarga de ferro no cérebro resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. Devido à elevada taxa metabólica do sistema nervoso, as mitocôndrias estão presentes em grande número em células nervosas. Tem sido demonstrado que, por meio da fissão e fusão, essas organelas promovem alterações na sua estrutura e essa dinâmica pode afetar a função mitocondrial e vice-versa. Déficits no fornecimento de energia para as sinapses têm sido associados a doenças neurodegenerativas e com a redução da funcionalidade de circuitos neurais essas células podem ativar cascatas de morte neuronal. No presente trabalho, foram analisados os efeitos do tratamento do ferro neonatal sobre os seguintes alvos: proteína 1 semelhante à dinamina (DNM1L) e proteína atrófica óptica 1 (OPA1), envolvidas na regulação de fissão e de fusão mitocondrial, respectivamente; caspase 3, uma protease essencial da fase efetora da apoptose; e sinaptofisina, um marcador sináptico. Além disso, nós investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, já mostrado capaz de melhorar a memória de ratos tratados com ferro, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre as proteínas DNM1L, OPA1, caspase 3 e sinaptofisina. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal. Na idade adulta, foram tratados com veículo ou CBD (10mg/kg) durante 14 dias. Os níveis proteicos e a expressão gênica no hipocampo e córtex foram quantificados através de Western blotting e RT-qPCR, respectivamente. A quantificação das proteínas foi realizada através da medida das densidades das bandas individuais, normalizadas pela densidade de β-actina. Para o RT-qPCR, as amostras foram normalizadas para 3 genes de referência (GAPDH, HPRT1 e RPL13A). Os resultados da análise protéica indicaram que o tratamento com ferro no período neonatal induziu redução de DNM1L no hipocampo e OPA1 no córtex. O ferro também aumentou os níveis de caspase 3 tanto no hipocampo quanto no córtex, acompanhado por redução dos níveis de sinaptofisina no hipocampo. O CBD reverteu os efeitos induzidos pelo ferro, trazendo os níveis hipocampais de DNM1L, caspase 3 e sinaptofisina de volta aos valores comparáveis ao grupo controle. Os resultados sugerem que o ferro pode afetar a dinâmica mitocondrial, possivelmente desencadeando perda sináptica e morte celular por apoptose. A reversão desses efeitos pelo CBD indica o seu potencial efeito neuroprotetor.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438584-Texto+Completo-0.pdf: 476074 bytes, checksum: 0144120e5040772f4dc29057d0403105 (MD5) Previous issue date: 2011 / Iron accumulation in the brain has been associated to the pathogenesis of neurodegenerative disorders. We have previously demonstrated that iron overload in the neonatal period results in severe and persistent memory deficits in adult rats. Here, using the animal model of cognitive impairment induced by iron overload we tested the effects of NaBut in ameliorating memory. Rats received vehicle or 10. 0 mg/kg Fe+2 orally at postnatal days 12-14. When animals reached the age of 2 months, they received an acute intraperitoneal injection of vehicle or NaBut (1. 2 g/kg) immediately after the training session in either novel object recognition or inhibitory avoidance tasks. Retention test sessions were performed 24 hours after training. Animals that received iron in the neonatal period showed severe memory deficits. A single acute injection of NaBut was able to recover memory deficits in iron-treated rats. The results provide evidence that NaBut may be considered for the treatment of cognitive decline associated with neurodegenerative disorders. / O excesso de ferro no encéfalo tem sido relacionado com a patogênese de diversas doenças neurodegenerativas, como por exemplo, as doenças de Alzheimer e de Parkinson. Reconhece-se o período neonatal como crítico para o estabelecimento do conteúdo normal de ferro no cérebro adulto, podendo, de forma determinante alterar a distribuição cerebral deste metal de acordo com o grau de absorção apresentado. Estudos realizados anteriormente em nosso laboratório indicaram que a administração de ferro no período neonatal prejudica severamente a memória em ratos adultos. Muitos estudos demonstram que a transcrição gênica é um processo necessário para a plasticidade e a consolidação da memória de longa duração. A acetilação das histonas ocorre nos resíduos lisina, neutralizando sua carga positiva, diminuindo a afinidade entre a proteína e o DNA, levando o relaxamento da estrutura da cromatina, permitindo o recrutamento da maquinaria transcricional. A deacetilação das histonas é um processo reversível, que ocorre pela ação das histonas deacetilases (HDACs), as quais representam a principal via de manipulação farmacológica do epigenoma, com promissores valores terapêuticos. Nos últimos anos ocorreu um aumento no número de estudos sugerindo que o Butirato de sódio (NaBut), um inibidor específico de HDACs, apresenta um possível potencial como agente terapêutico no tratamento de doenças neurodegenerativas. No entanto, a caracterização de seus efeitos é limitada pela falta de estudos utilizando modelos animais adequados que reproduzam aspectos de doenças neurodegenerativas. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar se os déficits de memória induzidos pelo tratamento neonatal com ferro podem ser revertidos pela administração de NaBut. Para tanto, ratos machos receberam veículo (5% de sorbitol em água) ou ferro (10,0 mg/kg) via oral do 12° ao 14° dia pós-natal. Ao atingirem a idade adulta, ambos os grupos foram divididos em grupos experimentais que receberam injeções agudas de NaBut (1,2g/Kg) ou veículo por via intraperitoneal, imediatamente após a sessão de treino nas tarefas de esquiva inibitória e reconhecimento do objeto novo. Os resultados mostraram que uma injeção aguda imediatamente após a sessão de treino não afetou a memória em ratos controles, mas foi capaz de reverter os déficits de memória induzidos pelo tratamento neonatal com ferro, tanto na tarefa de reconhecimento de objeto quanto na tarefa de esquiva inibitória. A partir dos resultados obtidos nos testes de memória de reconhecimento de objeto, e no teste relacionado à memória aversiva, a esquiva inibitória, podemos sugerir que o NaBut apresenta resposta satisfatória como modulador da memória, permitindo-nos inferir sua potencialidade como agente terapêutico para o tratamento dos prejuízos de memória que acompanham muitas doenças neurodegenerativas.

A via das quinureninas é a principal rota de degradação do aminoácido triptofano. Os metabólitos dessa via, comumente chamados de quinureninas, estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos e, recentemente, algumas quinureninas foram relacionadas à fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas. Tendo em vista que dados da literatura são contraditórios no que se refere à geração de espécies reativas a partir de algumas quinureninas e considerando que as concentrações de alguns desses metabólitos estão elevadas em várias doenças neurodegenerativas, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro de alguns intermediários da via das quinureninas, particularmente a 3-hidroxiquinurenina (3HKyn), a quinurenina (Kyn), o ácido 3-hidroxiantranílico (3HAA), o ácido antranílico (AA) e o ácido quinolínico (QA) sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos de 30 dias de idade. Verificamos que a 3HKyn e o 3HAA diminuíram as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a quimiluminescência em córtex cerebral de ratos jovens, o que indica um efeito antioxidante desses compostos, ao passo que a Kyn e o AA não alteraram os parâmetros de lipoperoxidação. Por outro lado, o QA aumentou a peroxidação lipídica nesta estrutura cerebral por aumentar significativamente as medidas de TBA-RS e quimiluminescência. Além disso, se pode verificar uma prevenção significativa da oxidação da GSH causada pelo 3HAA, enquanto o QA, na presença de íon ferroso e ácido ascórbico, diminuiu significativamente as concentrações de glutationa reduzida, o que indica que esse efeito seja mediado por radicais hidroxila gerados através da reação de Fenton. Já a 3HKyn, a Kyn e o AA não alteraram significativamente as concentrações de GSH. Também se verificou que a 3HKyn diminuiu a oxidação do diacetato de 2, 7-diclorofluoresceína, além de mostrar a propriedade de seqüestrar radicais peroxila e hidroxila. Por outro lado, o 3HAA somente seqüestrou radicais peroxila, sugerindo que a estrutura orto-aminofenólica é essencial para o composto possuir propriedades antioxidantes. Com o objetivo de verificar se o tempo de exposição à 3HKyn alterava a sua atividade antioxidante, determinamos a reatividade antioxidante total (TAR) e os valores de TBA-RS em células C6 cultivadas de glioma de ratos ao longo de 48 h na ausência (controle) ou presença de 3HKyn. Os resultados demonstraram um aumento da TAR e uma diminuição das TBA-RS pela 3HKyn em tempos curtos de exposição (1-6 horas), sendo que o metabólito não alterou significativamente esses parâmetros em tempos maiores de exposição, sugerindo uma diminuição da capacidade antioxidante da 3HKyn ao longo do tempo. Também verificamos uma diminuição do potencial antioxidante total (TRAP) e da TAR pelo QA em homogeneizado de córtex cerebral Finalmente, foi evidenciado qua a 3HKyn, na concentração de 100 µM, foi capaz de prevenir os efeitos tóxicos causados pelo QA e pelo ácido glutárico (GA). O GA é a principal neurotoxina que se encontra acumulada na acidemia glutárica tipo I. Em resumo, nossos resultados sugerem um efeito antioxidante da 3HKyn e do 3HAA e um efeito pró-oxidante do QA in vitro em córtex cerebral de ratos jovens. As alterações provocadas pelas várias quinureninas foram obtidas nas concentrações de 10, 100 e 500 µM. Embora não saibamos as concentrações dessas substâncias em doenças neurodegenerativas em que eles se acumulam, é possível que, em uma situação in vivo, a produção de substâncias antioxidantes através da rota das quinureninas poderia contrabalançar os efeitos tóxicos causados por outros metabólitos como o QA.