A vitamina A (retinol) exerce papéis fundamentais na regulação de processos celulares, tais como crescimento, divisão e apoptose. Os efeitos do retinol a nível celular são classicamente atribuídos à ativação de receptores nucleares da família dos receptores esteroides, RAR e RXR, ativados por diferentes isômeros do AR, considerado o produto mais biologicamente ativo da metabolização do retinol. Trabalhos recentes vêm identificando que o retinol também exerce funções biológicas por mecanismos independentes da transcrição gênica através da ativação desses receptores, em uma ação não-clássica ou não-genômica da vitamina A. Vários trabalhos propõem um papel antioxidante da vitamina A, embora alguns resultados demonstrem o papel pró-oxidante da mesma. Neste trabalho, nós avaliamos o papel da vitamina A no contexto das doenças neurodegenerativas. O mecanismo de ação do AR no processo de neurodiferenciação, a modulação da expressão de marcadores de neurodegeneração pelo retinol e o potencial papel da vitamina A na prevenção de danos associados à DP em modelo de ratos foram estudados. Observamos que o AR (10μM) induziu a neurodiferenciação de células SH-SY5Y através da produção de espécies reativas e estresse oxidativo. O retinol em concentrações maiores que a fisiológica (7, 10 e 20μM), atuou de maneira pró-oxidante, aumentando a produção de espécies reativas, a citotoxicidade e o conteúdo do receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE) de maneira redoxdependente, bem como o imunoconteúdo de marcadores de doenças neurodegenerativas como α-sinucleína, peptídeo β-amilóide e tau fosforilada indepedentemente de estresse oxidativo. No entanto, em modelo in vivo, o pré-tratamento com vitamina A (3000 IU/kg/dia) protegeu o dano neuronal induzido pela injeção do agente parkinsoniano 6-hidroxidopamina, e também reduziu o processo inflamatório. Estes resultados demonstram que as ações biológicas dos retinóides no sistema catecolaminérgico podem variar grandemente de acordo com o tipo celular, contexto fisiológico/patológico e modo de administração, demonstrando um amplo espectro de ações e mecanismos celulares. / Vitamin A (retinol) exerts fundamental role in cellular processes regulation, such as growing, cell division and apoptosis. Retinoids effects occur through binding to nuclear retinoid receptors, RAR and RXR, activated by different isomers of retinoic acid, considered the most biologically active product of retinol. Recent studies have shown receptors independent binding effects of retinoids, which was named as a non-genomic, or non-classical action mechanisms of vitamin A. In recent years, several studies have been proposing an antioxidant effect to vitamin A, however, series of pro-oxidant results have been shown a redox-state of this molecule. In this study, we evaluated the role of vitamin A in the context of neurodegenerative diseases. The mechanism of action of retinoic acid in the neurodifferentiation process, the modulation of neurodegeneration markers by retinol and the potential role of vitamin A in the prevention of damage associated to Parkinson’s disease were evaluated. We observed that retinoic acid (10μM) induced the neurodifferentiation of SH-SY5Y cells through reactive species production and oxidative stress. Retinol in concentrations above the physiological range (7, 10 and 20μM) was able to generate reactive species, induce cytotoxicity and modulate RAGE through a oxidative stress mechanism. Also, retinol was able to modulate neurodegenerative disease’s markers such as α-synuclein, β- amyloid and phosphorylation of tau. In our in vivo model, vitamin A (3000IU/kg/dia was able to protect neurons from 6-hydroxydopamine induced degenereration, and also reduced the inflammatory process. These results demonstrate that the biological actions of retinoids in the catecholaminergic system may vary according the cell target, physiopathologic context and administration mode, demonstrating a wide spectrum of actions and cellular mechanisms.

Resumo não disponível.

Introdução: A doença de Machado-Joseph, também conhecida como ataxia espinocerebelar tipo 3 (DMJ/SCA3), é uma doença neurodegenerativa autossômica dominante, causada por uma expansão da repetição CAG no gene ATXN3 que tem início, em média, dos 32 aos 40 anos. Embora a disfagia seja uma das principais causas de morte na fase terminal da doença, pouco se sabe sobre suas características e progressão. Objetivos: Este estudo teve como objetivos: (1) caracterizar a disfagia na DMJ/SCA3, por meio da videofluoroscopia da deglutição (VF), considerado o exame padrão-ouro da deglutição; (2) correlacionar disfagia com critérios de gravidade - para demonstrar se, quanto pior a disfagia, pior a DMJ/SCA3; (3) correlacionar a disfagia com uma potencial consequência, a perda de peso; e (4) comparar os resultados da VF com os do questionário Quality of life in Swallowing (SWAL-QOL), em busca de validação externa para seu uso em DMJ/SCA3. Métodos: Estudo transversal em pacientes com diagnóstico molecular de DMJ/SCA3, acima de 18 anos de idade. Após o consentimento, dados clínicos e Índice de Massa Corporal (IMC) foram obtidos e escalas clínicas foram aplicadas: Índice de Barthel, WHO-QOL BREF, SWAL-QOL, Beck Depression Inventory (BDI), NESSCA e SARA. O número de expansões da repetição CAG no gene ATXN3 (CAGexp) foi medido anteriormente. Os indivíduos foram submetidos à VF, do qual foram obtidos os escores DOSS (Dysphagia Outcomes Severity Scale) e PAS (Penetration Aspiration Scale). Comparações entre os grupos foram feitas pelo Mann-Whitney (MW) e Spearman, com p <0,05 e poder do teste de 80%. Resultados: 34 pacientes foram incluídos. As variáveis avaliadas apresentaram os seguintes resultados [mediana (EPE)]: idade de 53 (2,6) anos; idade de início de 38 (2) anos; duração da doença (DD) de 10 (1) anos; CAGexp de 74 (0,6); IMC de 23 (0,8). NESSCA de 18,4 (0,9); SARA de 15 (1.5), SWALQOL total de 65,5 (2,7); Índice de Barthel de 85 (3,6); WHO-QOL de 50 (3,1); DOSS de 5 (0,2) e PAS de 1 (0,4). Escores DOSS e PAS se correlacionaram, com um rho=-0,8; p = 0,0001, e a maioria dos pacientes apresentou disfagia leve. Indivíduos com escores graves de DOSS tiveram SARA e NESSCA significativamente mais elevados do que o grupo com disfagia leve (p = 0,003 e 0,02, MW); aqueles com escores PAS graves apresentaram escores SARA significativamente maior que o grupo com escore PAS leve (p = 0,007, MW). Ambos DOSS (rho = 0,454, p = 0,007) e PAS (rho = -0,453, p = 0,007) se correlacionaram com o IMC. O escore SWAL-QOL total não se associou com os escores da VF, mas um dos seus domínios,“duração da alimentação" se associou com DOSS (rho = 0,446, p = 0,008) e PAS (rho = -0,497, p = 0,003). Discussão: A disfagia não se associa à DD ou à CAGexp, mas tem correlação com escores clínicos SARA e NESSCA. Os indivíduos com escores maiores de disfagia apresentaram menor IMC, provavelmente decorrente da perda de peso. O questionário SWAL-QOL completo não parece adequado para avaliar a DMJ/SCA3; no entanto, não se pode rejeitar sua aplicabilidade. Escores menores de 20% no domínio duração da alimentação mostraram associação com disfagia grave. A fim de evitar a aspiração, propõe-se que a VF seja realizada em qualquer paciente DMJ/SCA3 que apresente pelo menos uma das seguintes características: SARA ≥15 pontos, e / ou domínio “duração da alimentação” do SWAL-QOL ≤ 50%. No caso de pacientes brasileiros, um IMC de 23kg/m² poderia ser utilizado como cutoff para o mesmo processo. Estes cutoffs alcançaram 100% de sensibilidade para detectar disfagia significativa na VF. Nesses casos, é necessário que seja ofertado manejo nutricional adequado. / Introduction: Machado-Joseph disease, also known as Spinocerebellar Ataxia type 3 (MJD/SCA3), is an autosomal dominant neurodegenerative disease, caused by an expanded CAG repeat in ATXN3 gene, with an age at onset between 32-40 years old. Although one of the main causes of death in terminal phase, dysphagia characteristics and progression are not fully known yet. Objectives: This study aimed (1) to characterize dysphagia in MJD/SCA3, through videofluoroscopy of swallowing (VF), considered a gold-standard examination of swallowing; (2) to correlate dysphagia with severity criteria – to demonstrate if dysphagia worsens as the disease worsens; (3) to correlate dysphagia with a potential consequence: the weight loss; and (4) to compare the results of VF with the results of SWAL-QOL, searching for external validation for its use in MJD/SCA3. Methods: Cross-sectional study on patients over 18 years old with a molecular diagnosis of MJD/SCA3. After consent, general clinical data and body mass index (BMI) were obtained, and clinical scales were applied: Barthel Index, WHO-QOL BREF, Quality of life in Swallowing (SWAL-QOL), Beck Depression Inventory (BDI), NESSCA and SARA. The length of the expanded CAG (CAGexp) repeat in ATXN3 gene was previously measured. Subjects were submitted to VF, from which the scores Dysphagia Outcomes Severity Scale (DOSS) and Penetration Aspiration Scale (PAS) were obtained. Comparisons between groups were made by Mann-Whitney U (M-W) and Spearman tests, with p < 0.05 and power of the test of 80%. Results: 34 patients were included. The variables evaluated showed the following results [median(SEM)]: age was 53 (2,6); age at onset was 38 (2); disease duration was 10 (1); CAG exp was 74 (0,6); BMI was 23 (0,8). NESSCA was 18,4 (0,9); SARA was 15 (1.5), SWAL-QOL total 65,5 (2,7); Barthel Index was 85 (3,6); WHO-QOL was 50 (3,1); DOSS was 5 (0,2) and PAS was 1 (0,4). DOSS and PAS scores were correlated with a rho= -0.8 (p = 0.0001); the majority of patients presented mild scores of dysphagia severity. Subjects with severe DOSS scores showed SARA and NESSCA scores significantly higher than the mild group (p = 0.003 and 0.02, MW); those with severe PAS scores presented SARA scores significantly higher than the mild PAS group (p = 0.007, M-W). Both DOSS (rho=0.454, p=0.007) and PAS (rho=-0.453, p=0.007) correlated with BMI. SWAL-QOL scores as a whole were not associated with the VF scores, but one of its domains, “eating duration”, was associated with DOSS (rho=0.446, p=0.008) and PAS (rho=-0.497, p=0.003) scores. “Eating duration” scores lower than 20% were associated with severe dysphagia. Discussion: Dysphagia was not associated with duration of disease or with CAGexp, but with clinical scores SARA and NESSCA. Subjects with higher scores of dysphagia presented lower BMI probably because they lose weight. SWAL-QOL as a whole does not seem appropriate to evaluate this disease, however we cannot reject its applicability. In order to prevent aspiration, we propose a VF study in any MJD/SCA3 patient presenting at least one of the following: SARA scores ≥15, and/or a eating duration item-SWAL-QOL ≤ 50%. In the case of Brazilian patients, a BMI of 23kg/m² could also be used as a cutoff for the same decision making process. These cutoffs presented 100% sensitivities to detect important dysphagia at DOSS and PAS scores. In those cases where an important dysphagia is detected at VF, appropriate nutritional management should be offered.

Orientadora : Profª. Drª. Cristiane Benincá / Coorientador : Prof. Dr. Ricardo L. R. Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 29/09/2017 / Inclui referências : f. 40-44 / Resumo: As doenças neurodegenerativas de início na infância podem ser de difícil diagnóstico, já que é comum apresentarem heterogeneidade de sintomas, quadro clinico com evolução tardia e bioquímica inconsistente. Uma das ferramentas moleculares que auxilia no diagnóstico dessas doenças é o sequenciamento completo do exoma, capaz de investigar e identificar mutações pontuais, pequenas inserções e deleções em genes codificadores de proteínas que possam estar envolvidas nas patologias pesquisadas. Resultados negativos em exomas nem sempre se devem à ausência de alterações patológicas no DNA. Desta forma, a reanálise é fundamental em casos em que exista uma desconfiança para certa patologia de origem genética. O caso clínico apresentado neste estudo não possui um diagnóstico definido e o exoma foi realizado na tentativa de esclarecer a causa dos sintomas e buscar um tratamento adequado. Durante a reanálise do exoma algumas mutações pontuais foram encontradas e destas, duas alterações no gene SQSTM1 (rs201239306 e rs370874635), responsável por codificar a proteína p62, foram selecionadas para uma investigação mais aprofundada, haja visto que ambas mutações apresentam baixa frequência populacional e poderiam alterar a função proteica. A proteína p62 atua em diversos processos celulares, entre eles a autofagia. Esta é responsável pela remoção de proteínas e organelas em processo de envelhecimento ou disfunção. Erros nesta via de degradação são fontes de uma grande variedade de doenças, incluindo as neurodegenerativas. A análise da variante rs201239306 (A426V), de herança paterna, demonstra uma grande possibilidade de causar deficiências na sua via de sinalização, uma vez que se encontra em domínio conservado em diversas espécies biológicas (UBA) e várias linhas de análise bioinformática suportam essa hipótese. A quantificação da proteína p62 revelou, em primeira análise, uma pequena diminuição da sua expressão na amostra da paciente, o que poderia indicar uma redução na sua tradução devido a alteração estar localizada na região 5'UTR. A quantificação de LC3 demonstrou, inicialmente, que a paciente possui um acúmulo desta proteína, indicando que a via autofágica está sendo afetada de alguma maneira. São necessários alguns testes complementares para concluir a base genética do caso clínico apresentado. Podemos sugerir, não obstante, segundo as análises apresentadas, uma disfunção na via de p62 como a causa da síndrome estudada. Palavras-chave: autofagia, exoma, sequestosome1, neurodegeneração, p62 / Abstract: Early childhood neurodegenerative diseases may be difficult to diagnose, as they can present heterogeneity of symptoms, late evolution on clinical picture and inconsistent biochemistry. Exome sequencing is one of the available molecular tools to help in the diagnosis of these diseases as it is capable to identify point mutations, small insertions and deletions in genes encoding for proteins that may be involved in the pathologies under research. Negative results in exomes are not always due to the absence of pathological changes in DNA. Therefore, the reanalysis is fundamental in cases where there is a suspicion for a certain pathology of genetic origin. The clinical case presented in this study lacks a welldefined diagnosis and the exome was conducted to clarify the cause of the symptoms and search for an appropriate treatment. During this re-analysis, some specific mutations were found and two point mutations in the SQSTM1 gene (rs201239306 e rs370874635), that encodes the p62 protein, were selected for further investigation since they both present low allelic frequency and also can alter the protein function. p62 protein acts on several cellular processes including autophagy. Autophagy is the cellular process responsible for the removal of dysfunctional proteins and organelles in normal homeostasis or during aging. Errors in this pathway of degradation are sources of a wide variety of diseases including neurodegenerative diseases. The analysis of the variant rs201239306 (A426V) presented with a paternal inheritance, showed possibilities of causing deficiencies in its signaling pathway, as it changes a well conserved aminoacid in several biological species (UBA domain). The bioinformatics analysis supported this hypothesis either. The quantification of p62 protein levels showed, a small decrease in the first analysis, and could indicate a decrease in its translation due to the alteration in the 5'UTR region. LC3 quantification initially demonstrated that the patient has an accumulation of this protein, indicating that the autophagic pathway is being affected in some way. Complementary tests are needed to conclude the genetic basis of this clinical case. We can suggest, however, according to the reported analysis, a dysfunction in the p62 pathway as the cause of the studied syndrome. Key-words: autophagy, exome, sequestosome1, neurodegeneration, p62

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo liberado: Resumo, Abstract e Referências. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-23T19:42:27Z No. of bitstreams: 1 2017_HenriqueRodriguesdeOliveira_PARCIAL.pdf: 538871 bytes, checksum: f7256430d87d4d886f00a676e40786b3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-21T20:29:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_HenriqueRodriguesdeOliveira_PARCIAL.pdf: 538871 bytes, checksum: f7256430d87d4d886f00a676e40786b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-21T20:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_HenriqueRodriguesdeOliveira_PARCIAL.pdf: 538871 bytes, checksum: f7256430d87d4d886f00a676e40786b3 (MD5) Previous issue date: 2018-05-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / Várias drogas usadas no tratamento antitumoral são tóxicas para o sistema nervoso central (SNC) e para o sistema nervoso periférico (SNP) e, nesse último, manifesta-se como um dos efeitos adversos mais comuns, a neuropatia periférica induzida por quimioterápicos (NPIQ). Uma dessas drogas é a cisplatina, um dos quimioterápicos mais utilizados na prática clínica por induzir apoptose de células tumorais em decorrência da formação de adutos de platina no DNA. Atualmente já se sabe que os gânglios das raízes dorsais (GRDs) são os alvos dos quimioterápicos no SNP para o desenvolvimento da neuropatia periférica. Essa por sua vez é caracterizada por ser predominantemente sensorial e dose-dependente, e desenvolver sintomas no paciente que incluem parestesia, até mesmo perda sensorial e dor neuropática. Apesar de bastante estudada, os mecanismos pelos quais a NPIQ se desenvolve ainda não estão completamente elucidados, e provavelmente a falta da compreensão desses mecanismos seja uma das razões para atualmente ainda não haver tratamentos terapêuticos preventivos ou curativos. Visto isso, o desenvolvimento de estratégias que visem proteger o sistema nervoso é fundamental para o tratamento da NPIQ. Assim, o receptor ativado por proliferadores peroxissomais do tipo ɣ (PPAR-ɣ) pode ser um potencial candidato, já que sua ativação é neuroprotetora em diversas doenças neurodegenerativas, como por exemplo, a doença de Alzheimer e em modelo de neuropatia periférica (NP) induzida por oxaliplatina. Dessa maneira, a proposta desse trabalho foi avaliar o papel do PPAR-ɣ na neurotoxicidade induzida pela cisplatina em modelo in vitro de neuropatia periférica. E para responder aos objetivos propostos, foram estabelecidas culturas primárias de GRDs de ratos adultos e essas foram tratadas com 30 μM de cisplatina na presença ou ausência de rosiglitazona (agonista de PPAR-ɣ) nas concentrações de 1, 3 e 9 μM. Os efeitos da cisplatina e da rosiglitazona sobre a expressão gênica foram avaliados pela técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-PCRq) e os efeitos da rosiglitazona sobre a redução da sensibilização neuronal foi avaliada pela técnica de imunoabsorção enzimática para a detecção dos níveis do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP). Os resultados de expressão gênica demonstram que o tratamento dos GRDs por 24 horas com 30 μM de cisplatina diminuem a expressão gênica de RNAm Ppar-ɣ e Ppar-β/δ, enquanto o cotratamento com 9 μM de rosiglitazona previne essa redução causada pela cisplatina. Observou-se no ensaio de liberação de CGRP que a cisplatina reduziu a sensibilização neuronal, e essa redução não foi prevenida pela rosiglitazona. Esses achados mostram pela primeira vez que a rosiglitazona pode ser uma promissora ferramenta para o tratamento da NP induzida pela cisplatina. / Several drugs used in anticancer treatment are toxic to central nervous system (CNS) and to peripheral nervous system (PNS) and, in the latter, manifests as one of the most common adverse effects, the chemotherapy induced peripheral neuropathy (CIPN). One of these drugs is cisplatin, one of the most widely chemotherapy drugs used in clinical practice, that induce tumor cells apoptosis due to platinum adducts on DNA. Currently, it is known that dorsal root ganglions (DRG) are the chemotherapy drugs targets in the PNS, which can contribute to the development of peripheral neuropathy. This in turn, is characterized by being predominantly sensorial and dose-dependent, and develops symptoms in patients that include paresthesia, sensory loss and neuropathic pain. Although widely studied, the mechanism by which CIPN develops are still not completely elucidated, and probably the lack of understanding of such mechanisms is one of the reasons why there are currently no preventive or curatives treatments. Thus, design strategies to protect the nervous system is fundamental for CIPN treatment. Therefore, the peroxisome-proliferator activated receptor ɣ (PPAR-ɣ) may be a potential candidate, since its activation is neuroprotective in several neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s disease and in peripheral neuropathy (PN) induced by oxaliplatin. Therefore, the aim of this work was to evaluate the role of PPAR-ɣ in cisplatin-induced neurotoxicity, using an in vitro peripheral neuropathy model. Thus, DRG primary cultures from adult rats was established and treated with 30 μM cisplatin in the presence or absence of rosiglitazone (PPAR- agonist) at concentrations of 1, 3 and 9 μM. The effects of cisplatin and rosiglitazone on genic expression was evaluated by reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and the rosiglitazone effects on the neuronal sensitization was evaluated by ELISA to detect calcitonin gene-related peptide (CGRP) release. The results demonstrate that DRG treatment with 30 μM cisplatin for 24 hours reduce the Ppar-ɣ and Ppar- β/δ mRNA levels, while rosiglitazone 9 μM prevents the cisplatin effect. Also, cisplatin reduced CGRP release, which was not prevented by rosiglitazone. These findings show for the first time that rosiglitazone may be a promising tool for the treatment of cisplatin-induced NP.

O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.

O ácido quinolínico (AQ) é um metabólito do metabolismo do triptofano produzido na via das quinureninas. Demonstrou-se ser um fraco agonista de receptores NMDA, porém capaz de produzir morte em neurônios susceptíveis via ativação à sua ação excitatória. O envolvimento do AQ tem sido sugerido como um mecanismo patológico em diversas doenças neurodegenerativas, incluindo-se as doenças de Huntington, Alzheimer e no complexo de demência induzida pela síndrome da imunodeficiência adquirida. As propriedades neurotóxicas do AQ têm sido atribuídas principalmente à excitotoxicidade e ao estresse oxidativo, enquanto muito pouco se sabe sobre seus efeitos sobre o metabolismo energético cerebral. Assim, no presente estudo investigamos o efeito da administração intraestriatal de AQ (150 nmol) em ratos de 30 dias de vida sobre as atividades de enzimas fundamentais do metabolismo energético, tais como os complexos IIV da cadeia respiratória, creatina quinase e citrato sintase, além da produção de 14CO2 a partir de [1-14C]acetato 3, 6 ou 12 horas após a injeção de AQ. Observamos que a injeção de AQ inibiu significativamente a atividade dos complexos II (50%), III (46%) e II-III (35%), bem como da enzima creatina quinase (27%), mas não alterou as atividades dos complexos I e IV em estriados preparados 12 horas após a injeção de AQ. Além disso, não observamos quaisquer alterações nessas atividades enzimáticas 3 ou 6 horas após o tratamento com AQ. A produção de 14CO2 a partir de [1-14C]acetato também foi inibida significativamente (27 %) pelo AQ somente em estriados preparados 12 horas após a injeção. As atividades dos complexos da cadeia respiratória e da creatina quinase foram também medidas em homogeneizados de estriado expostos a 100 μM de AQ. Não foram observadas alterações nessas atividades na presença de AQ. Essas observações in vitro juntamente com os achados ex vivo sugerem que a ação do AQ comprometendo o metabolismo energético em estriado de ratos é provavelmente indireta. Novos experimentos foram realizados para elucidar os mecanismos envolvidos nas inibições das atividades das enzimas do metabolismo energético induzidas pelo AQ. O pré-tratamento dos ratos com MK-801, um antagonista de receptores NMDA, ou com creatina preveniu completamente os efeitos inibitórios induzidos pelo AQ. Além disso, os seqüestradores de radicais livres α-tocoferol mais ascorbato e o inibidor da óxido nítrico sintase L-NAME preveniram completamente as inibições provocadas pelo AQ nas atividades do complexo III e da creatina quinase, indicando que esses efeitos inibitórios são provavelmente devido à geração de espécies reativas. Por outro lado, o pré-tratamento com piruvato bloqueou completamente os efeitos inibitórios causados pela injeção de AQ na atividade do complexo II e parcialmente a inibição da atividade da creatina quinase indicando que esses efeitos foram provavelmente devido à formação de espécies reativas Tomadas em conjunto, esses resultados indicam fortemente que a fosforilação oxidativa e a transferência energética celular estão comprometidas por altas concentrações de AQ no estriado de ratos jovens e que os efeitos inibitórios em enzimas chave do metabolismo energético causados pela injeção de AQ são provavelmente devido à ativação de receptores NMDA. / Quinolinic acid (QA), an endogenous metabolite produced in kynurenine pathway of tryptophan metabolism, is a weak agonist at the NMDA receptor, and selectively kills susceptible neurons via activation of the NMDA receptors The neurotoxic capacity of QA in vivo has implicated it in a variety of neurodegenerative disorders, including Huntington’s disease, Alzheimer’s disease and AIDS dementia complex. Most of QA toxic properties have been attributed to excitotoxicity and oxidative stress, whereas very little is known about its effects on brain energy metabolism. Therefore, in the present study we investigated the ex vivo effect of intrastriatal administration of 150 nmol QA to 30-day-old rats on critical enzyme activities of energy metabolism, including the respiratory chain complexes I-IV, creatine kinase and citrate synthase, as well as on 14CO2 production from [1-14C]acetate at distinct periods after QA injection. We observed that QA injection significantly inhibited complexes II (50%), III (46%) and II-III (35%), as well as creatine kinase (27 %), but not complexes I and IV activities in striatum prepared 12 hours after QA treatment. In contrast, no alterations of these enzyme activities were observed 3 or 6 hours after QA treatment. 14CO2 production from [1-14C]acetate was also significantly inhibited (27 %) by QA only in rat striatum prepared 12 hours after injection. The respiratory chain complexes and creatine kinase activities were also measured in striatum homogenates exposed to 100 μM QA. No alterations of these activities were observed in the presence of QA. These in vitro observations allied to the ex vivo findings suggest that QA compromises energy metabolism in the rat striatum indirectly rather than due to a direct action of QA on the enzymes. New experiments were therefore designed to elucidate the involved mechanisms of QA-induced inhibition on the enzymatic activities of energy metabolism. Pretreatment with the NMDA receptor antagonist MK-801 and with creatine totally prevented the inhibitory effects elicited by QA. In addition, the free-radical scavengers α-tocopherol plus ascorbate and the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME completely abolished the inhibitions provoked by QA on CK and complex III, indicating that these effects were probably due to generation of reactive species. On the other hand, pyruvate pretreatment totally blocked the inhibitory effects of QA injection on complex II activity and partially prevented QA-induced CK inhibition. Taken together, these observations strongly indicate that oxidative phosphorylation and cellular energy transfer are compromised by high concentrations of QA in the striatum of young rats and that the inhibitory effects caused by QA injection on critical steps of energy metabolism were probably mediated by NMDA stimulation.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A carnosina (β-alanina-L-histidina) é um dipeptídeo encontrado em abundância na musculatura esquelética, no músculo cardíaco e no sistema nervoso central. É um composto utilizado como terapia adjuvante para o tratamento de doenças neurodegenerativas associadas ou não ao envelhecimento, devido ao seu conhecido efeito protetor contra oxidantes gerados na fisiopatologia dessas doenças. Entretanto, até o momento, nenhum estudo avaliou o efeito da administração isolada de carnosina sobre parâmetros de estresse oxidativo em cérebro de ratos. Com o intuito de elucidar os efeitos antioxidantes da carnosina, este estudo investigou os efeitos da administração aguda intracerebroventricular (ICV) de carnosina sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral, cerebelo, hipocampo e estriado de ratos machos com 60 dias de vida. Para tanto, os animais foram submetidos a uma cirurgia estereotáxica com implantação de cânula no ventrículo lateral direito. Três dias após a cirurgia, os animais receberam uma administração única ICV de carnosina (6,4 μmol) através da cânula guia. Os animais do grupo controle receberam 6,4 μmol de NaCl em solução aquosa. Uma hora após a administração, os animais foram eutanasiados por decapitação com guilhotina e as estruturas cerebrais a serem estudadas foram limpas e dissecadas para posteriores análises bioquímicas. Para avaliação da oxidação lipídica e proteica, foram determinados os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e o conteúdo de sulfidrilas, respectivamente. Também foram avaliadas as atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) nas mesmas estruturas cerebrais. Observou-se que os níveis de TBA-RS não foram alterados em nenhuma das estruturas cerebrais avaliadas nos animais que receberam carnosina em comparação ao grupo controle. Por outro lado, o conteúdo de grupos sulfidrila encontrou-se aumentado em cerebelo e hipocampo de ratos submetidos à administração de carnosina, sugerindo uma maior proteção conferida aos compostos tiólicos presentes nas células. Em relação às defesas antioxidantes, pôde-se observar um aumento da atividade da CAT em córtex cerebral dos animais que receberam administração ICV de carnosina. Tais resultados corroboram estudos anteriores que demonstram efeitos antioxidantes para a carnosina. Entretanto, a administração ICV deste dipeptídeo ocasionou uma inibição da atividade da SOD em estriado, o que pode ser um efeito tóxico da carnosina. Tomados em conjunto, os resultados do presente estudo demonstram efeitos ambíguos da carnosina sobre parâmetros de estresse oxidativo. Este trabalho corrobora o efeito antioxidante descrito, mas apresenta uma evidência de um possível efeito tóxico exercido pela carnosina. Estudos complementares são necessários para avaliar a segurança do uso terapêutico desta molécula.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:56:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000394147-Texto+Completo-0.pdf: 537706 bytes, checksum: a795ee035c27f844abd582fecd58d995 (MD5) Previous issue date: 2007 / Excess of iron in the brain has been implicated in the pathogenesis of several human neurodegenerative diseases, for example Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. It has been shown that the neonatal period is critical for the establishment of normal iron content in the adult brain and it is also known that aging alters the cerebral distribution of this metal. We have previously described that neonatal administration of iron severely impairs recognition memory in adult rats. In addition, we also described that old rats present recognition memory deficits. The aim of the present study was to determine if iron- and aging-induced recognition memory deficits could be reverted by three different pharmacological strategies. In Experiment I, male rats received vehicle (5% sorbitol in water) or iron (10. 0 mg/kg orally) at postnatal days 12 to 14. When they reached the age of 3 months both groups were divided in three experimental groups receiving 6 injections of saline or desferroxamine (DFO, an iron chelator agent) (30. 0 or 300. 0 mg/kg ip). The animals were submitted to a novel object recognition task (NOR) 24 h after the last injection. Iron-treated rats showed long-term recognition memory impairment. Iron-treated rats, that received DFO (300. 0 mg/Kg), showed long-term recognition memory indexes similar to those seen in vehicle group. In Experiment II, male Wistar rats (23 months old) received 6 injections of saline or DFO (300. 0 mg/kg ip). The animals were submitted to NOR 24 h after the last injection. DFO-treated rats showed normal recognition memory while the saline group showed long-term recognition memory deficits. It was also demonstrated that DFO reduced the oxidative damage to proteins in cortex and hippocampus. In Experiment III, rats were submitted to the same neonatal treatment with iron performed in Experiment I. When they reached adulthood both groups were divided in three experimental groups receiving vehicle (1% DMSO in saline solution) or SKF 38393 [a dopamine D1 receptor agonist] (5. 0 mg/kg ip) or GBR 12935 [a dopamine reuptake inhibitor] (5. 0 or 10. 0 mg/Kg ip) immediately after NOR training. Iron-treated rats that received SKF 38393 and GBR 12935 (10. 0 mg/Kg) showed normal recognition memory. In Experiment IV, rats were submitted to the same neonatal treatment with iron performed in Experiments I and III. When they reached adulthood both groups were divided in four experimental groups receiving vehicle or rolipram, a phosphodiestase inhibitor, (0. 01, 0. 03 or 0. 1 mg/kg ip) immediately after NOR training. Iron-treated rats, that received rolipram (0. 03 and 0. 1mg/Kg), showed normal recognition memory. In Experiment V, male rats (24 months old) received vehicle or rolipram (0. 1 mg/kg ip) immediately after NOR training. Rolipram-treated rats showed normal recognition memory while the vehicle group presented recognition memory deficits. Taken together, the results show that the iron chelation therapy and the cAMP pathway stimulation were able to revert the iron- and aging-induced recognition memory deficits. / O excesso de ferro no encéfalo tem sido relacionado com a patogênese de diversas doenças neurodegenerativas, por exemplo, as doenças de Alzheimer e de Parkinson. Tem sido demonstrado que o período neonatal é crítico para o estabelecimento do conteúdo normal de ferro no cérebro adulto e também se sabe que o envelhecimento altera a distribuição cerebral deste metal. Nós descrevemos anteriormente que a administração de ferro no período neonatal prejudica severamente a memória de reconhecimento em ratos adultos e que o envelhecimento também induz prejuízos significativos na memória de reconhecimento. O objetivo deste estudo foi determinar se os déficits de memória induzidos pelo tratamento neonatal com ferro e pelo envelhecimento poderiam ser revertidos através de três diferentes estratégias farmacológicas. No Experimento I, ratos machos receberam veículo (5% de sorbitol em água destilada) ou ferro (10,0 mg/kg via oral) do 12° ao 14° dia pós-natal. Ao ati ngirem a idade adulta, os grupos foram divididos em três outros grupos experimentais que receberam 6 injeções de salina ou desferroxamina (DFO, um quelante de ferro). Os animais foram submetidos à tarefa de reconhecimento do objeto novo (RON) 24 h após a última injeção. Os resultados indicaram que o tratamento com DFO na idade adulta foi capaz de reverter o prejuízo de memória de reconhecimento induzido pelo tratamento neonatal com ferro. No Experimento II, ratos machos (23 meses de idade) receberam 6 injeções de salina ou DFO (300,0 mg/Kg ip). Os animais foram submetidos ao RON 24 h após a última injeção. Os ratos tratados com DFO apresentaram índices de reconhecimento normais, enquanto que os ratos do grupo salina apresentaram déficits de memória de reconhecimento. Também foi demonstrado que o DFO reduziu os danos oxidativos a proteínas no córtex e no hipocampo desses animais. No Experimento III, os ratos foram submetidos ao mesmo tratamento neonatal com ferro realizado no Experimento I. Ao atingirem a idade adulta, os grupos foram divididos em 3 outros grupos experimentais que receberam veículo (1% de DMSO em salina) ou SKF 38393 [um agonista de receptores dopaminérgicos do tipo D1] (5,0 mg/Kg ip) ou GBR 12935 [um inibidor da recaptação de dopamina] (5,0 ou 10,0 mg/Kg ip) imediatamente após o treino do RON. Tanto a administração de SKF 38393 quanto de GBR 12935 foi capaz de reverter o prejuízo de memória induzido pelo tratamento neonatal com ferro. No Experimento IV, os ratos foram submetidos ao tratamento neonatal com ferro como descrito nos Experimentos I e III. Ao atingirem a idade adulta, os grupos foram divididos em quatro outros grupos experimentais que receberam veículo ou rolipram [um inibidor da fosfodiesterase] (0,01; 0,03 ou 0,1 mg/kg ip) imediatamente após o treino do RON. Os ratos tratados com ferro, que receberam rolipram (0,03 e 0,1 mg/Kg), apresentaram memória de reconhecimento normal. No Experimento V, ratos machos (24 meses de idade) receberam veículo ou rolipram (0,1 mg/kg ip) imediatamente após o treino do RON. O tratamento com rolipram reverteu o prejuízo de memória de reconhecimento induzido pelo envelhecimento. Os resultados, em conjunto, mostram que a terapia com quelante de ferro e o aumento dos níveis do AMPc foram capazes de reverter os déficits de memória de reconhecimento induzidos pelo tratamento neonatal com ferro e pelo envelhecimento.

A vitamina A (retinol) exerce papéis fundamentais na regulação de processos celulares, tais como crescimento, divisão e apoptose. Os efeitos do retinol a nível celular são classicamente atribuídos à ativação de receptores nucleares da família dos receptores esteroides, RAR e RXR, ativados por diferentes isômeros do AR, considerado o produto mais biologicamente ativo da metabolização do retinol. Trabalhos recentes vêm identificando que o retinol também exerce funções biológicas por mecanismos independentes da transcrição gênica através da ativação desses receptores, em uma ação não-clássica ou não-genômica da vitamina A. Vários trabalhos propõem um papel antioxidante da vitamina A, embora alguns resultados demonstrem o papel pró-oxidante da mesma. Neste trabalho, nós avaliamos o papel da vitamina A no contexto das doenças neurodegenerativas. O mecanismo de ação do AR no processo de neurodiferenciação, a modulação da expressão de marcadores de neurodegeneração pelo retinol e o potencial papel da vitamina A na prevenção de danos associados à DP em modelo de ratos foram estudados. Observamos que o AR (10μM) induziu a neurodiferenciação de células SH-SY5Y através da produção de espécies reativas e estresse oxidativo. O retinol em concentrações maiores que a fisiológica (7, 10 e 20μM), atuou de maneira pró-oxidante, aumentando a produção de espécies reativas, a citotoxicidade e o conteúdo do receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE) de maneira redoxdependente, bem como o imunoconteúdo de marcadores de doenças neurodegenerativas como α-sinucleína, peptídeo β-amilóide e tau fosforilada indepedentemente de estresse oxidativo. No entanto, em modelo in vivo, o pré-tratamento com vitamina A (3000 IU/kg/dia) protegeu o dano neuronal induzido pela injeção do agente parkinsoniano 6-hidroxidopamina, e também reduziu o processo inflamatório. Estes resultados demonstram que as ações biológicas dos retinóides no sistema catecolaminérgico podem variar grandemente de acordo com o tipo celular, contexto fisiológico/patológico e modo de administração, demonstrando um amplo espectro de ações e mecanismos celulares. / Vitamin A (retinol) exerts fundamental role in cellular processes regulation, such as growing, cell division and apoptosis. Retinoids effects occur through binding to nuclear retinoid receptors, RAR and RXR, activated by different isomers of retinoic acid, considered the most biologically active product of retinol. Recent studies have shown receptors independent binding effects of retinoids, which was named as a non-genomic, or non-classical action mechanisms of vitamin A. In recent years, several studies have been proposing an antioxidant effect to vitamin A, however, series of pro-oxidant results have been shown a redox-state of this molecule. In this study, we evaluated the role of vitamin A in the context of neurodegenerative diseases. The mechanism of action of retinoic acid in the neurodifferentiation process, the modulation of neurodegeneration markers by retinol and the potential role of vitamin A in the prevention of damage associated to Parkinson’s disease were evaluated. We observed that retinoic acid (10μM) induced the neurodifferentiation of SH-SY5Y cells through reactive species production and oxidative stress. Retinol in concentrations above the physiological range (7, 10 and 20μM) was able to generate reactive species, induce cytotoxicity and modulate RAGE through a oxidative stress mechanism. Also, retinol was able to modulate neurodegenerative disease’s markers such as α-synuclein, β- amyloid and phosphorylation of tau. In our in vivo model, vitamin A (3000IU/kg/dia was able to protect neurons from 6-hydroxydopamine induced degenereration, and also reduced the inflammatory process. These results demonstrate that the biological actions of retinoids in the catecholaminergic system may vary according the cell target, physiopathologic context and administration mode, demonstrating a wide spectrum of actions and cellular mechanisms.