Quando confrontado com situações de medo os roedores apresentam respostas comportamentais (ex., luta, fuga, imobilidade e vocalização) e neurovegetativas (taquicardia, hipertensão e defecação) que caracterizam a reação de defesa. Em geral essas respostas são acompanhadas de antinocicepção. Estudos demonstram um papel do óxido nítrico (NO) e de receptores NMDA (N-metil-D-aspartato) na mediação de respostas nociceptivas no corno dorsal da medula espinal. Resultados do nosso laboratório demonstraram que a exposição a uma situação ameaçadora, como o labirinto em cruz elevado aberto ou sem paredes (LCEa), provoca antinocicepção de alta magnitude em ratos e camundongos. Assim, o presente estudo teve por objetivo investigar o papel do complexo receptor glutamato/NMDA e NO no corno dorsal da medula espinal na resposta antinociceptiva induzida pela exposição ao LCEa. Camundongos receberam injeção por via intratecal (i.t.) de NMDA (0; 0,4 ou 0,8 nmol/5,0 l) para avaliar seus efeitos intrínsecos sobre a nocicepção. Enquanto a dose de 0,8 nmol de NMDA provocou efeitos nociceptivos, a dose de 0,4 nmol se mostrou desprovida de efeitos. Em seguida, nosso estudo avaliou os efeitos do NMDA (0; 0,1; 0,2 ou 0,4 nmol, i.t.) na nocicepção induzida pela injeção de formalina 2,5% na pata traseira direita do camundongo. Nenhuma dose de NMDA aumentou o tempo de lambidas na pata durante os 10 minutos do teste. Assim, investigamos os efeitos da injeção i.t. de NMDA (0; 0,1; 0,2 ou 0,4 nmol) na antinocicepção induzida pela exposição ao ambiente aversivo (LCEa) ou não aversivo (LCE fechado: quatro braços com paredes; LCEf) em camundongos pré-tratados com formalina a 2,5% na pata traseira direita, durante 10 minutos. O tratamento com NMDA (0,4 nmol) reverteu parcialmente a antinocicepção induzida pela exposição ao LCEa, sem afetar a resposta dos animais expostos ao LCEf. Para avaliar se os efeitos anti-antinociceptivos do NMDA (0,4 nmol) dependem da síntese de NO, camundongos receberam injeção i.t. combinada de L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-éster), um inibidor da NOS, e NMDA. O pré-tratamento com L-NAME (40 nmoles/5,0 l i.t.) bloqueou seletivamente os efeitos anti-antinociceptivos do NMDA. Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem que a antinocicepção induzida pela exposição ao LCEa pode ser parcialmente revertida pela ativação de receptores NMDA e indicam que esse efeito depende da síntese de NO no corno dorsal da medula espinal de camundongos. / Rodents exposed to threatening situations (e.g., prey-predator interactions) usually display defensive behaviors (e.g., fight, flight, freezing, vocalization), and neurovegetative (e.g., tachycardia, hypertension, defecation) responses characterized as a fear reaction. Commonly, these responses are accompanied by antinociception. Evidence showing that the glutamate NMDA (N-methyl-d-aspartate) receptor and nitric oxide (NO) complex located within the dorsal horn of the spinal cord in the mediation of the nociceptive response have instigated researchers to investigate the role of the NMDA/NO on some types of fear-induced antinociception. This study investigated the role of the glutamate-NMDA receptor complex and NO in the dorsal horn of the spinal cord of mice in the antinociception induced by a potentially aversive situation, i.e., an exposure to an open elevated plus maze (oEPM: four open arms). Mice were intrathecally (i.t.) injected with N-methyl-D-aspartic acid (NMDA: 0, 0.4 or 0.8 nmol/5.0 l) to assess its intrinsic effects upon nociception. Results showed that NMDA at 0.8 nmol, but not at 0.4 nmol, was able to induce intrinsic nociceptive effect. When injected in animals pre-treated with formalin 2.5% into the right hind paw (nociceptive test), NMDA (0, 0.1, 0.2 or 0.4 nmol, i.t.) did not change time spent licking the formalin injected paw. Then, we investigated the effects of NMDA injection (0, 0.1, 0.2 or 0.4 nmol, i.t.) on nociceptive response induced by formalin test in mice exposed to the oEPM (aversive situation) or enclosed EPM (eEPM: four enclosed arms; control situation) for 10 minutes. NMDA treatment (0.4 nmol) partially reversed the antinociception induced by oEPM exposure without affect nociception in mice exposed to the eEPM. Finally, we investigated whether the anti-antinociceptive effect of NMDA would be dependent on NO synthesis by injecting L-NAME (N-nitro-L-arginine-methyl-ester) i.t., a inhibitor of NOS (nitric oxide synthase), 10 minutes before NMDA injection. L-NAME pretreatment (40 nmol/5.0 l; i.t.) selectivelly blocked anti-antinociceptive effect of NMDA 0.4 nmol. Taken together, our results suggest that antinociception induced by oEPM exposure (i) is, at least in part, reversed by NMDA receptors activation and (ii) this NMDA effect seems to be dependent on NO synthesis within the dorsal horn of the spinal cord in mice.

O nosso grupo tem investigado os efeitos da Clorfeniramina (CPA), antagonista H1, e da L-histidina (LH), uma droga precursora da síntese de histamina, sobre a ansiedade e a memória emocional. Diante disso, os objetivos desse estudo foram investigar os efeitos LH administrada i.p. e da CPA microinjetada no hipocampo dorsal sobre a ansiedade e a memória emocional de camundongos submetidos ao labirinto em cruz elevado (LCE). O experimento foi realizado em dois dias consecutivos. No primeiro dia (T1) 71 camundongos machos da cepa Suíço-Albino pesando 25-35g foram pré-tratados i.p. com salina (SAL) ou LH (500mg/Kg). Após duas horas, os sujeitos receberam microinjeção de SAL ou CPA (0,016nmol; 0,052nmol; 0,16nmol/0,1l) no hipocampo dorsal. Após cinco minutos, os animais foram expostos ao LCE por cinco minutos. Vinte quatro horas depois, o mesmo protocolo experimental foi adotado na reexposição (T2). Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 8 grupos de acordo com o tratamento farmacológico: SAL/SAL (n=9), SAL/CPA1 (n=9), SAL/CPA2 (n=10), SAL/CPA3 (n=8), LH/SAL (n=10), LH/CPA1 (n=8), LH/CPA2 (n=8) e LH/CPA3 (n=9). As três doses de CPA microinjetadas no hipocampo dorsal não alteraram a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos (%TBA) na exposição ao LCE: T1 SAL/CPA1 (46,13±4,45); SAL/CPA2 (47,59±4,89); SAL/CPA3 (44,30±6,65) quando comparados com o grupo controle SAL/SAL (35,84±2,77) e não alteraram o número de entradas nos braços fechados (EBF) SAL/CPA1 (8,56±1,06); SAL/CPA2 (9,70±1,10); SAL/CPA3 (9,38±1,25) - quando comparados com o grupo controle SAL/SAL (10,56±1,11). A administração i.p. de LH aumentou a %TBA em T1 para o grupo LH/SAL (59,79±4,71), quando comparado ao grupo controle SAL/SAL (35,84±2,77), mas não alterou o EBF: LH/SAL (9,20±1,78) e SAL/SAL (10,56±1,11). Os animais do grupo LH/CPA3 diminuíram %TBA (32,25±4,81) em T1 quando comparados com o grupo LH/SAL (59,79±4,71). Os animais do grupo SAL/CPA1 não apresentaram diminuição da %TBA em T2 (T1: 46,13±4,45; T2: 39,38±6,53). O mesmo foi observado para os sujeitos dos grupos LH/CPA2 (T1: 50,10±3,99; T2: 40,97±8,22) e LH/CPA3 (T1: 32,25±4,81; T2: 32,16±6,93). Nós concluímos que: a CPA microinjetada no hipocampo dorsal de camundongos não apresenta efeito sobre a ansiedade; a administração intraperitoneal de LH apresenta efeito ansiolítico em camundongos expostos ao LCE e que esse efeito é revertido pela maior dose de CPA (0,16nmol/0,1l); são necessárias maiores doses de CPA para que haja prejuízo na memória emocional de camundongos reexpostos ao LCE quando os níveis de histamina no hipocampo dorsal estão elevados. / Our group has been investigating the effects of Chlorpheniramine (CPA), a histaminergic H1 antagonist, and of L-Histidine (LH), a histamine precursor, on anxiety-related behaviors and emotional memory. Thus the aim of this study was to investigate the effects of LH i.p. injections and of dorsal intra-hippocampal microinjections of Chlorpheniramine (CPA) on anxiety-related behaviors and emotional memory in male mice using elevated plus-maze (EPM). The experiment was performed in two days. On the first day (T1) 71 male Swiss Albino mice of body weight 25- 35g were pre-treated with saline (SAL) i.p. or LH (500mg/Kg) i.p. After two hours they were treated with dorsal intra-hippocampal microinjections of SAL or CPA (0.016nmol; 0.052nmol; 0.16nmol/0,1l). Five minutes after intra-hippocampal microinjections the animals were exposed to EPM for 5 minutes. Twenty four hours later the same protocol was repeated (T2). The animals were randomly assigned to 8 groups based on drug treatment: SAL/SAL (n=9), SAL/CPA1 (n=9), SAL/CPA2 (n=10), SAL/CPA3 (n=8), LH/SAL (n=10), LH/CPA1 (n=8), LH/CPA2 (n=8) and LH/CPA3 (n=9). All three doses of intra-hippocampal microinjections of CPA did not change the percentage of time spent in the open-arms (%OAT) on T1 SAL/CPA1 (46.13±4.45); SAL/CPA2 (47.59±4.89); SAL/CPA3 (44.30±6.65) when compared to control group SAL/SAL (35.84±2.77) and did not change the enclosed arm entries (EAE) SAL/CPA1 (8.56±1.06); SAL/CPA2 (9.70±1.10); SAL/CPA3 (9.38±1.25) when compared to control group SAL/SAL (10.56±1.11). Intraperitoneal injections of LH increased %OAT on T1 on LH/SAL group (59.79±4.71), when compared to control group SAL/SAL (35.84±2.77), but not EAE LH/SAL (9.20±1.78) and SAL/SAL (10.56±1.11). Animals treated with LH and CPA3 (LH/CPA3) decreased %OAT (32.25±4.81) on T1 when compared to LH/SAL (59.79±4.71) group. SAL/CPA1 animals did not decreased %OAT on T2 (T1: 46.13±4.45; T2: 39.38±6.53). The same happened to LH/CPA2 (T1: 50.10±3.99; T2: 40.97±8.22) and LH/CPA3 (T1: 32.25±4.81; T2: 32.16±6.93) groups. Thus, we conclude that: dorsal intra-hippocampal microinjection of Chlorpheniramine has no effect on anxiety-related behaviors in male mice; intraperitoneal injection of L-Histidine has an anxiolytic-like effect in male mice exposed to elevated plus-maze, that is reversed by the higher dose of Chlorpheniramine (0.16nmol/0,1l); higher doses of CPA are necessary to impair emotional memory when the levels of hippocampal histamine are elevated.

Diversas evidências indicam que o núcleo dorsal da rafe (NDR), principal fonte de inervação serotonérgica para estruturas límbicas, é uma estrutura heterogênea composta por populações de neurônios serotonérgicos anatômica e funcionalmente distintas, as quais têm sido diferentemente implicadas na fisiopatologia dos transtornos de ansiedade, como o transtorno do pânico. Fármacos antidepressivos são a primeira escolha para o tratamento de tais transtornos e o atraso para a manifestação dos efeitos terapêuticos desses fármacos tem sido, consistentemente, associado a alterações na neurotransmissão serotonérgica. Entretanto, ainda é desconhecido se estas alterações podem ser heterogêneas entre as diferentes sub-regiões do NDR e é este o foco de investigação do presente estudo. Inicialmente, foi investigado o perfil de ativação neuronal das diferentes sub-regiões do NDR, através da avaliação da expressão de proteína Fos, em ratos submetidos à tarefa de fuga no modelo do labirinto em T elevado, após administração aguda ou crônica com a fluoxetina ou a imipramina. Nestes mesmos animais, foram também avaliado o número de células triptofano hidroxilase positivas. Para fins comparativos, o efeito do tratamento com a imipramina em animais submetidos à esquiva inibitória também foi avaliado. A análise imunoistoquímica indicou que a tarefa de fuga promoveu um aumento na expressão da proteína Fos em neurônios nãoserotonérgicos localizados na sub-região das asas laterais do NDR. Efeito este que não foi observado em animais tratados cronicamente com a fluoxetina e a imipramina. Além disso, o tratamento prolongado com a fluoxetina, mas não com a imipramina, foi capaz de aumentar a ativação de neurônios serotonérgicos nesta mesma sub-região. Diferente do que foi observado na tarefa de fuga, a tarefa de esquiva inibitória promoveu um aumento na ativação de neurônios serotonérgicos nas sub-regiões DRC, DRD e DRV. Perfil que não foi observado nos grupos aguda e cronicamente tratados com imipramina. Além disso, somente o tratamento prolongado com a imipramina promoveu uma diminuição no recrutamento de neurônios não-serotonérgicos em diversas sub-regiões do NDR. Diante do resultado imunoistoquímico observado no experimento com a fluoxetina, avaliamos a participação dos autorreceptores 5-HT1A das asas laterais no efeito observado. Através da técnica whole-cell patch clamp, em uma linhagem de camundongos transgênicos que apresenta neurônios serotonérgicos fluorescentes, foi avaliada a responsividade destes receptores após o tratamento com a fluoxetina. Os resultados indicam que os animais tratados cronicamente com fluoxetina apresentam aumento na excitabilidade basal com diminuída sensibilidade ao agonista de receptores 5-HT1A, 8-OHDPAT. Assim, é possível sugerir que o efeito antipânico da fluoxetina administrada cronicamente parece estar relacionado com uma redução na ativação de neurônios não-serotonérgicos e um aumento no recrutamento de neurônios serotonérgicos localizados nas asas laterais, sendo que esta última pode ser explicada pela dessensibilização dos autorreceptores 5-HT1A. Com relação à imipramina, é possível sugerir que o efeito panicolítico promovido pelo tratamento prolongado pode ser devido à diminuição no recrutamento de neurônios não-serotonérgicos das asas laterais. Já para o efeito ansiolítico, tanto a diminuição no recrutamento de neurônios não-serotonérgicos em diferentes sub-regiões do NDR, quanto a diminuição na ativação de neurônios serotonérgicos no DRC, DRD e DRV parecem estar envolvidas. / A wealth of evidence indicates that the dorsal raphe nucleus (DR) is a heterogeneous structure, composed of anatomically and functionally distinct populations of serotonergic neurons, which have been differently implicated in the pathophysiology of anxiety, such as panic disorder. Antidepressant drugs are the first choice in treatment of anxiety disorders, and the delay for the therapeutic effect have consistently been associated with changes in serotonergic neurotransmission within the DR. However, it is unknown whether these alterations can be heterogeneous among the different subregions of the DR, and this is the focus of investigation of the present study. First, it was investigated the profile of neuronal activation of different subregions of the DR - by using the evaluation of Fos protein expression of rats exposed to the escape task in the elevated T-maze test, after acute or chronic administration of fluoxetine or imipramine. In the same animals, it was also investigated the number of positive triptophan hidroxylasis cells. For comparative reasons, it was evaluated the behavioral and immunohistochemical effects of imipramine treatment on inhibitory avoidance acquisition in the elevated T-maze, a response associated with anxiety. The results of the immunohistochemical analysis indicated that animals exposed to escape behavior exhibited higher expression of Fos protein in non-serotonergic neurons in the DR lateral wings. This effect was not observed in fluoxetine or imipramine chronically treated animals. Moreover, chronic treatment with fluoxetine, but not imipramine, was able to increase the activation of serotonergic neurons on this subregion. On the other hand, the inhibitory avoidance task promoted an increase in the activation of serotonergic neurons in the sub-regions DRC, DRD, and DRV. This profile was not observed after acute or chronic treatment with imipramine. Additionally, only the long-term treatment with imipramine showed a decrease in the activation of non-serotonergic neurons in different subregions of the DR. Based on the results obtained with fluoxetine experiment, we evaluated the role of the 5-HT1A autoreceptors located in the lateral wings. For this, we used the whole-cell patch clamp technique in a transgenic mouse line, which exhibit fluorescence in serotonergic neurons. The results indicate that the animals treated chronically with fluoxetine presented an increase in the basal excitability, with lower responsivity to the 5-HT1A agonist - 8-OH-DPAT. Altogether, the results suggest that the anti-panic effect caused by chronic fluoxetine treatment is associated with a reduction in the activation of non-serotonergic neurons, and an increase in the recruitment of non-serotonergic neurons in lateral wings. This last observation seems to be related to a 5-HT1A autoreceptor desensitization in the lateral wings. Regarding imipramine, this panicolytic effect caused by chronic administration of this drug seems to be related to a decreased activation of the non-serotonergic neurons in the lateral wings. Finally, the anxiolytic effect, of imipramine may be associated to a decrease in the recruitment of non-serotonergic neurons in different DR subregions, allied with a decreased activation of serotonergic neurons in the DRC, DRD and DRV.

O nosso grupo tem investigado os efeitos da Clorfeniramina (CPA), antagonista H1, e da L-histidina (LH), uma droga precursora da síntese de histamina, sobre a ansiedade e a memória emocional. Diante disso, os objetivos desse estudo foram investigar os efeitos LH administrada i.p. e da CPA microinjetada no hipocampo dorsal sobre a ansiedade e a memória emocional de camundongos submetidos ao labirinto em cruz elevado (LCE). O experimento foi realizado em dois dias consecutivos. No primeiro dia (T1) 71 camundongos machos da cepa Suíço-Albino pesando 25-35g foram pré-tratados i.p. com salina (SAL) ou LH (500mg/Kg). Após duas horas, os sujeitos receberam microinjeção de SAL ou CPA (0,016nmol; 0,052nmol; 0,16nmol/0,1l) no hipocampo dorsal. Após cinco minutos, os animais foram expostos ao LCE por cinco minutos. Vinte quatro horas depois, o mesmo protocolo experimental foi adotado na reexposição (T2). Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 8 grupos de acordo com o tratamento farmacológico: SAL/SAL (n=9), SAL/CPA1 (n=9), SAL/CPA2 (n=10), SAL/CPA3 (n=8), LH/SAL (n=10), LH/CPA1 (n=8), LH/CPA2 (n=8) e LH/CPA3 (n=9). As três doses de CPA microinjetadas no hipocampo dorsal não alteraram a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos (%TBA) na exposição ao LCE: T1 SAL/CPA1 (46,13±4,45); SAL/CPA2 (47,59±4,89); SAL/CPA3 (44,30±6,65) quando comparados com o grupo controle SAL/SAL (35,84±2,77) e não alteraram o número de entradas nos braços fechados (EBF) SAL/CPA1 (8,56±1,06); SAL/CPA2 (9,70±1,10); SAL/CPA3 (9,38±1,25) - quando comparados com o grupo controle SAL/SAL (10,56±1,11). A administração i.p. de LH aumentou a %TBA em T1 para o grupo LH/SAL (59,79±4,71), quando comparado ao grupo controle SAL/SAL (35,84±2,77), mas não alterou o EBF: LH/SAL (9,20±1,78) e SAL/SAL (10,56±1,11). Os animais do grupo LH/CPA3 diminuíram %TBA (32,25±4,81) em T1 quando comparados com o grupo LH/SAL (59,79±4,71). Os animais do grupo SAL/CPA1 não apresentaram diminuição da %TBA em T2 (T1: 46,13±4,45; T2: 39,38±6,53). O mesmo foi observado para os sujeitos dos grupos LH/CPA2 (T1: 50,10±3,99; T2: 40,97±8,22) e LH/CPA3 (T1: 32,25±4,81; T2: 32,16±6,93). Nós concluímos que: a CPA microinjetada no hipocampo dorsal de camundongos não apresenta efeito sobre a ansiedade; a administração intraperitoneal de LH apresenta efeito ansiolítico em camundongos expostos ao LCE e que esse efeito é revertido pela maior dose de CPA (0,16nmol/0,1l); são necessárias maiores doses de CPA para que haja prejuízo na memória emocional de camundongos reexpostos ao LCE quando os níveis de histamina no hipocampo dorsal estão elevados. / Our group has been investigating the effects of Chlorpheniramine (CPA), a histaminergic H1 antagonist, and of L-Histidine (LH), a histamine precursor, on anxiety-related behaviors and emotional memory. Thus the aim of this study was to investigate the effects of LH i.p. injections and of dorsal intra-hippocampal microinjections of Chlorpheniramine (CPA) on anxiety-related behaviors and emotional memory in male mice using elevated plus-maze (EPM). The experiment was performed in two days. On the first day (T1) 71 male Swiss Albino mice of body weight 25- 35g were pre-treated with saline (SAL) i.p. or LH (500mg/Kg) i.p. After two hours they were treated with dorsal intra-hippocampal microinjections of SAL or CPA (0.016nmol; 0.052nmol; 0.16nmol/0,1l). Five minutes after intra-hippocampal microinjections the animals were exposed to EPM for 5 minutes. Twenty four hours later the same protocol was repeated (T2). The animals were randomly assigned to 8 groups based on drug treatment: SAL/SAL (n=9), SAL/CPA1 (n=9), SAL/CPA2 (n=10), SAL/CPA3 (n=8), LH/SAL (n=10), LH/CPA1 (n=8), LH/CPA2 (n=8) and LH/CPA3 (n=9). All three doses of intra-hippocampal microinjections of CPA did not change the percentage of time spent in the open-arms (%OAT) on T1 SAL/CPA1 (46.13±4.45); SAL/CPA2 (47.59±4.89); SAL/CPA3 (44.30±6.65) when compared to control group SAL/SAL (35.84±2.77) and did not change the enclosed arm entries (EAE) SAL/CPA1 (8.56±1.06); SAL/CPA2 (9.70±1.10); SAL/CPA3 (9.38±1.25) when compared to control group SAL/SAL (10.56±1.11). Intraperitoneal injections of LH increased %OAT on T1 on LH/SAL group (59.79±4.71), when compared to control group SAL/SAL (35.84±2.77), but not EAE LH/SAL (9.20±1.78) and SAL/SAL (10.56±1.11). Animals treated with LH and CPA3 (LH/CPA3) decreased %OAT (32.25±4.81) on T1 when compared to LH/SAL (59.79±4.71) group. SAL/CPA1 animals did not decreased %OAT on T2 (T1: 46.13±4.45; T2: 39.38±6.53). The same happened to LH/CPA2 (T1: 50.10±3.99; T2: 40.97±8.22) and LH/CPA3 (T1: 32.25±4.81; T2: 32.16±6.93) groups. Thus, we conclude that: dorsal intra-hippocampal microinjection of Chlorpheniramine has no effect on anxiety-related behaviors in male mice; intraperitoneal injection of L-Histidine has an anxiolytic-like effect in male mice exposed to elevated plus-maze, that is reversed by the higher dose of Chlorpheniramine (0.16nmol/0,1l); higher doses of CPA are necessary to impair emotional memory when the levels of hippocampal histamine are elevated.

Diversas evidências indicam que o núcleo dorsal da rafe (NDR), principal fonte de inervação serotonérgica para estruturas límbicas, é uma estrutura heterogênea composta por populações de neurônios serotonérgicos anatômica e funcionalmente distintas, as quais têm sido diferentemente implicadas na fisiopatologia dos transtornos de ansiedade, como o transtorno do pânico. Fármacos antidepressivos são a primeira escolha para o tratamento de tais transtornos e o atraso para a manifestação dos efeitos terapêuticos desses fármacos tem sido, consistentemente, associado a alterações na neurotransmissão serotonérgica. Entretanto, ainda é desconhecido se estas alterações podem ser heterogêneas entre as diferentes sub-regiões do NDR e é este o foco de investigação do presente estudo. Inicialmente, foi investigado o perfil de ativação neuronal das diferentes sub-regiões do NDR, através da avaliação da expressão de proteína Fos, em ratos submetidos à tarefa de fuga no modelo do labirinto em T elevado, após administração aguda ou crônica com a fluoxetina ou a imipramina. Nestes mesmos animais, foram também avaliado o número de células triptofano hidroxilase positivas. Para fins comparativos, o efeito do tratamento com a imipramina em animais submetidos à esquiva inibitória também foi avaliado. A análise imunoistoquímica indicou que a tarefa de fuga promoveu um aumento na expressão da proteína Fos em neurônios nãoserotonérgicos localizados na sub-região das asas laterais do NDR. Efeito este que não foi observado em animais tratados cronicamente com a fluoxetina e a imipramina. Além disso, o tratamento prolongado com a fluoxetina, mas não com a imipramina, foi capaz de aumentar a ativação de neurônios serotonérgicos nesta mesma sub-região. Diferente do que foi observado na tarefa de fuga, a tarefa de esquiva inibitória promoveu um aumento na ativação de neurônios serotonérgicos nas sub-regiões DRC, DRD e DRV. Perfil que não foi observado nos grupos aguda e cronicamente tratados com imipramina. Além disso, somente o tratamento prolongado com a imipramina promoveu uma diminuição no recrutamento de neurônios não-serotonérgicos em diversas sub-regiões do NDR. Diante do resultado imunoistoquímico observado no experimento com a fluoxetina, avaliamos a participação dos autorreceptores 5-HT1A das asas laterais no efeito observado. Através da técnica whole-cell patch clamp, em uma linhagem de camundongos transgênicos que apresenta neurônios serotonérgicos fluorescentes, foi avaliada a responsividade destes receptores após o tratamento com a fluoxetina. Os resultados indicam que os animais tratados cronicamente com fluoxetina apresentam aumento na excitabilidade basal com diminuída sensibilidade ao agonista de receptores 5-HT1A, 8-OHDPAT. Assim, é possível sugerir que o efeito antipânico da fluoxetina administrada cronicamente parece estar relacionado com uma redução na ativação de neurônios não-serotonérgicos e um aumento no recrutamento de neurônios serotonérgicos localizados nas asas laterais, sendo que esta última pode ser explicada pela dessensibilização dos autorreceptores 5-HT1A. Com relação à imipramina, é possível sugerir que o efeito panicolítico promovido pelo tratamento prolongado pode ser devido à diminuição no recrutamento de neurônios não-serotonérgicos das asas laterais. Já para o efeito ansiolítico, tanto a diminuição no recrutamento de neurônios não-serotonérgicos em diferentes sub-regiões do NDR, quanto a diminuição na ativação de neurônios serotonérgicos no DRC, DRD e DRV parecem estar envolvidas. / A wealth of evidence indicates that the dorsal raphe nucleus (DR) is a heterogeneous structure, composed of anatomically and functionally distinct populations of serotonergic neurons, which have been differently implicated in the pathophysiology of anxiety, such as panic disorder. Antidepressant drugs are the first choice in treatment of anxiety disorders, and the delay for the therapeutic effect have consistently been associated with changes in serotonergic neurotransmission within the DR. However, it is unknown whether these alterations can be heterogeneous among the different subregions of the DR, and this is the focus of investigation of the present study. First, it was investigated the profile of neuronal activation of different subregions of the DR - by using the evaluation of Fos protein expression of rats exposed to the escape task in the elevated T-maze test, after acute or chronic administration of fluoxetine or imipramine. In the same animals, it was also investigated the number of positive triptophan hidroxylasis cells. For comparative reasons, it was evaluated the behavioral and immunohistochemical effects of imipramine treatment on inhibitory avoidance acquisition in the elevated T-maze, a response associated with anxiety. The results of the immunohistochemical analysis indicated that animals exposed to escape behavior exhibited higher expression of Fos protein in non-serotonergic neurons in the DR lateral wings. This effect was not observed in fluoxetine or imipramine chronically treated animals. Moreover, chronic treatment with fluoxetine, but not imipramine, was able to increase the activation of serotonergic neurons on this subregion. On the other hand, the inhibitory avoidance task promoted an increase in the activation of serotonergic neurons in the sub-regions DRC, DRD, and DRV. This profile was not observed after acute or chronic treatment with imipramine. Additionally, only the long-term treatment with imipramine showed a decrease in the activation of non-serotonergic neurons in different subregions of the DR. Based on the results obtained with fluoxetine experiment, we evaluated the role of the 5-HT1A autoreceptors located in the lateral wings. For this, we used the whole-cell patch clamp technique in a transgenic mouse line, which exhibit fluorescence in serotonergic neurons. The results indicate that the animals treated chronically with fluoxetine presented an increase in the basal excitability, with lower responsivity to the 5-HT1A agonist - 8-OH-DPAT. Altogether, the results suggest that the anti-panic effect caused by chronic fluoxetine treatment is associated with a reduction in the activation of non-serotonergic neurons, and an increase in the recruitment of non-serotonergic neurons in lateral wings. This last observation seems to be related to a 5-HT1A autoreceptor desensitization in the lateral wings. Regarding imipramine, this panicolytic effect caused by chronic administration of this drug seems to be related to a decreased activation of the non-serotonergic neurons in the lateral wings. Finally, the anxiolytic effect, of imipramine may be associated to a decrease in the recruitment of non-serotonergic neurons in different DR subregions, allied with a decreased activation of serotonergic neurons in the DRC, DRD and DRV.

Quando confrontado com situações de medo os roedores apresentam respostas comportamentais (ex., luta, fuga, imobilidade e vocalização) e neurovegetativas (taquicardia, hipertensão e defecação) que caracterizam a reação de defesa. Em geral essas respostas são acompanhadas de antinocicepção. Estudos demonstram um papel do óxido nítrico (NO) e de receptores NMDA (N-metil-D-aspartato) na mediação de respostas nociceptivas no corno dorsal da medula espinal. Resultados do nosso laboratório demonstraram que a exposição a uma situação ameaçadora, como o labirinto em cruz elevado aberto ou sem paredes (LCEa), provoca antinocicepção de alta magnitude em ratos e camundongos. Assim, o presente estudo teve por objetivo investigar o papel do complexo receptor glutamato/NMDA e NO no corno dorsal da medula espinal na resposta antinociceptiva induzida pela exposição ao LCEa. Camundongos receberam injeção por via intratecal (i.t.) de NMDA (0; 0,4 ou 0,8 nmol/5,0 l) para avaliar seus efeitos intrínsecos sobre a nocicepção. Enquanto a dose de 0,8 nmol de NMDA provocou efeitos nociceptivos, a dose de 0,4 nmol se mostrou desprovida de efeitos. Em seguida, nosso estudo avaliou os efeitos do NMDA (0; 0,1; 0,2 ou 0,4 nmol, i.t.) na nocicepção induzida pela injeção de formalina 2,5% na pata traseira direita do camundongo. Nenhuma dose de NMDA aumentou o tempo de lambidas na pata durante os 10 minutos do teste. Assim, investigamos os efeitos da injeção i.t. de NMDA (0; 0,1; 0,2 ou 0,4 nmol) na antinocicepção induzida pela exposição ao ambiente aversivo (LCEa) ou não aversivo (LCE fechado: quatro braços com paredes; LCEf) em camundongos pré-tratados com formalina a 2,5% na pata traseira direita, durante 10 minutos. O tratamento com NMDA (0,4 nmol) reverteu parcialmente a antinocicepção induzida pela exposição ao LCEa, sem afetar a resposta dos animais expostos ao LCEf. Para avaliar se os efeitos anti-antinociceptivos do NMDA (0,4 nmol) dependem da síntese de NO, camundongos receberam injeção i.t. combinada de L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-éster), um inibidor da NOS, e NMDA. O pré-tratamento com L-NAME (40 nmoles/5,0 l i.t.) bloqueou seletivamente os efeitos anti-antinociceptivos do NMDA. Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem que a antinocicepção induzida pela exposição ao LCEa pode ser parcialmente revertida pela ativação de receptores NMDA e indicam que esse efeito depende da síntese de NO no corno dorsal da medula espinal de camundongos. / Rodents exposed to threatening situations (e.g., prey-predator interactions) usually display defensive behaviors (e.g., fight, flight, freezing, vocalization), and neurovegetative (e.g., tachycardia, hypertension, defecation) responses characterized as a fear reaction. Commonly, these responses are accompanied by antinociception. Evidence showing that the glutamate NMDA (N-methyl-d-aspartate) receptor and nitric oxide (NO) complex located within the dorsal horn of the spinal cord in the mediation of the nociceptive response have instigated researchers to investigate the role of the NMDA/NO on some types of fear-induced antinociception. This study investigated the role of the glutamate-NMDA receptor complex and NO in the dorsal horn of the spinal cord of mice in the antinociception induced by a potentially aversive situation, i.e., an exposure to an open elevated plus maze (oEPM: four open arms). Mice were intrathecally (i.t.) injected with N-methyl-D-aspartic acid (NMDA: 0, 0.4 or 0.8 nmol/5.0 l) to assess its intrinsic effects upon nociception. Results showed that NMDA at 0.8 nmol, but not at 0.4 nmol, was able to induce intrinsic nociceptive effect. When injected in animals pre-treated with formalin 2.5% into the right hind paw (nociceptive test), NMDA (0, 0.1, 0.2 or 0.4 nmol, i.t.) did not change time spent licking the formalin injected paw. Then, we investigated the effects of NMDA injection (0, 0.1, 0.2 or 0.4 nmol, i.t.) on nociceptive response induced by formalin test in mice exposed to the oEPM (aversive situation) or enclosed EPM (eEPM: four enclosed arms; control situation) for 10 minutes. NMDA treatment (0.4 nmol) partially reversed the antinociception induced by oEPM exposure without affect nociception in mice exposed to the eEPM. Finally, we investigated whether the anti-antinociceptive effect of NMDA would be dependent on NO synthesis by injecting L-NAME (N-nitro-L-arginine-methyl-ester) i.t., a inhibitor of NOS (nitric oxide synthase), 10 minutes before NMDA injection. L-NAME pretreatment (40 nmol/5.0 l; i.t.) selectivelly blocked anti-antinociceptive effect of NMDA 0.4 nmol. Taken together, our results suggest that antinociception induced by oEPM exposure (i) is, at least in part, reversed by NMDA receptors activation and (ii) this NMDA effect seems to be dependent on NO synthesis within the dorsal horn of the spinal cord in mice.

O hipocampo dorsal (HD) é uma estrutura do sistema límbico que está envolvida em processos emocionais, de memória e aprendizado. Alem disso, o HD também exerce influência sobre a atividade autonômica. Durante situações aversivas pode se observar tanto respostas autonômicas (aumento da pressão arterial, frequência cardíaca e queda da temperatura cutânea) quanto comportamentais. O HD está envolvido com diversas alterações associadas a reações defensivas e apresenta conexões com diversas estruturas que modulam essas respostas, fazendo parte de uma via responsável por modular as respostas durante situações aversivas. São observadas aumentos nas respostas autonômicas durante o estresse por restrição (ER). Durante a atividade do HD está aumentada. Além disso, é possível observar aumento dos níveis de glutamato no HD. A ativação de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA no sistema nervoso central aumenta a síntese de óxido nítrico (NO) por ativação da isoforma neuronial da óxido nítrico sintase (nNOS). Além disso, esta interação, NMDA/NO, no HD parece ser importante nas reações defensivas. Portanto, no presente estudo nós observamos que a administração de glutamato no HD promove aumentos do sistema cardiovascular, similares a aqueles observados durante situações de estresse. Estas respostas cardiovasculares são associadas com um aumento da atividade simpática. Além disso, os efeitos do glutamato foram inibidos pela administração do AP7, um antagonista NMDA, do N?-Propyl-L-Arginine, um inibidor da nNOS ou do Carboxy-PTIO(S)-3-carboxy-4- hydroxyphenylglicine, um sequestrador de NO. Finalmente, a administração destas drogas foi capaz de reduzir as respostas autonômicas causadas pelo ER. Portanto, nossos achados mostram que o sistema glutamatérgico presente no HD esta envolvido com a modulação autonômica através de receptores do tipo NMDA e a ativação de nNOS. Além disso, esta via NMDA/NO está envolvida na modulação autonômica durante situações de estresse. / The dorsal hippocampus (DH) is a structure of limbic system that is involved in emotional, leaning and memories process. Moreover, the DH also exerts influence on autonomic activity. During aversive situations it is possible observes autonomic responses (increase in blood pressure, heart rate and decrease in cutaneous temperature) associated to defensive behavioral. The DH is involved with alterations associated to defensive reactions and presents connections with several structures which modulate that responses, making part of a pathway involved with behavior and autonomic responses associated with aversive situations. Increase of autonomics responses are observed during restraint stress (RS). During RS the DH activity is increased. Moreover, it is possible observe increases in glutamate levels in DH. In central nervous system the activation of NMDA glutamatergic receptors increases the nitric oxide (NO) synthesis by activate the neuronal isoform of nitric oxide syntase (nNOS). Moreover, this interaction, NMDA/ NO, in the DH appears to important in the defensive reactions. Therefore, in the present work we observed that administration of glutamate in the DH promotes increases of cardiovascular system, similar those observed during stress situation. These cardiovascular responses were associate with an increase of sympathetic activity. Also, the glutamate effects were inhibited by administration of AP7, a NMDA antagonist, N?-Propyl-L-Arginine, a nNOS inhibitor, or Carboxy-PTIO(S)-3- carboxy-4-hydroxyphenylglicine, a NO scavenger. Finally, the administration of these drugs were able to reduces the autonomic responses evoked by RS. Therefore, our findings showed that glutamatergic system present in DH are involved with autonomic modulation through NMDA receptors and nNOS activation. Moreover, this NMDA/ NO is involved with autonomic modulation during stress situation.

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Spinal root avulsion leads to paralysis and loss of sensory function. Surgical methods can improve motor function and ameliorate pain but sensory recovery in adults is poor. Previous studies have shown that cell transplantation or treatment with trophic factors can improve functional outcome in rodents after dorsal root transection or crush. Here, a dorsal root injury model, more similar to human avulsion injuries, was used. The aims of this thesis were to investigate the behaviour of different stem cells following transplantation to avulsed dorsal roots and asses their potential to serve as possible regenerative therapy. In paper I, different murine stem cell types were transplanted to avulsed dorsal roots in rats. Murine embryonic stem cells remained outside the spinal cord and were surrounded by glutamatergic terminals. Boundary cap neural crest stem cells (bNCSC) formed elongated bands outside the spinal cord and migrated to the spinal cord as single cells. In paper II, transplanted bNCSC were further characterized. bNCSC remaining outside the spinal cord expressed glial markers and were associated with different types of sensory fibres. bNCSC that migrated into the injured spinal cord expressed different neuronal markers. In paper III, effects of bNCSC transplantation on local vasculature and glial scar formation were studied. bNCSC increase angiogenesis in a non dose response manner and participate in boundary glial scar formation. In paper IV, bNCSC spinal migration was analysed using two different injury models - dorsal root transection and dorsal root avulsion. In addition, bNCSC capacity to support sensory regeneration was assessed and the results suggest that bNCSC do not support robust regeneration of avulsed afferents. In paper V, an in vitro stem cell model system was used to assess the possibility of using artificial nanomaterials to deliver differentiation factors. Cells treated with either soluble factors or particle-delivered factors showed similar differentiation patterns. Stem cell transplantation offers several opportunities following dorsal root avulsion, including cell replacement and regenerative support. By elucidating the mechanisms by which stem cells can assist regeneration of avulsed afferents will allow for more targeted or combinatorial approaches, including growth factor treatment.

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