Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En los últimos años se han identificado y estudiado funciones del ácido fólico relacionadas con la salud cardiovascular y el desarrollo de enfermedades tumorales en los individuos. El consumo de esta vitamina produce una reducción de los niveles sanguíneos de homocisteína, amino ácido asociado como factor de riesgo de enfermedad cardiovascular. Sin embargo, las últimas investigaciones plantearon la hipótesis que la hiperhomocisteinemia es solo un marcador de deficiencia de ácido fólico y vitamina B12. En consecuencia, se ha planteado que la deficiencia de estas vitaminas podría tener un efecto causal en el desarrollo de enfermedad cardiovascular. El principal candidato podría ser el ácido fólico, debido a sus propiedades antioxidantes y por su participación directa en los procesos de metilación. El objetivo de este estudio fue demostrar en un modelo animal que la deficiencia de ácido fólico, independiente de los niveles de homocisteína, altera la reactividad vascular endotelio dependiente. Metodología: El estudio se realizó con 48 ratas Wistar macho, las cuales se dividieron en 4 grupos de acuerdo a su alimentación durante 8 semanas: A: deficiente en ácido fólico y vitamina B12, B: deficiente en ácido fólico, C: deficiente en vitamina B12 y D: grupo Control. Terminado el período de alimentación las ratas se sacrificaron por dislocación cervical para evaluar la reactividad vascular endotelio dependiente en segmentos de aorta torácica. Se tomaron muestras de sangre para determinación sérica de homocisteína, folato y vitamina B12. Los resultados se analizaron mediante estudios de comparación múltiple (Análisis de varianza y análisis de varianza para series repetidas). Resultados: Los niveles séricos de folato fueron significativamente más bajos en los grupos deficientes (grupo A y B) al compararlos con los suplementados (grupo C y D) (p<0,0001). Los niveles séricos de vitamina B12 fueron significativamente más bajos en los grupos deficientes (grupo A y C) en comparación con los grupos suplementados (grupo B y D) (p<0,0001). Los niveles de homocisteína fueron diferentes entre los grupos (p<0,0001). El estudio de reactividad vascular endotelio dependiente demostró que los anillos aórticos de los 4 grupos de ratas, se relajaban en forma similar, al igual que la respuesta endotelio independiente.

A fenilcetonúria (PKU) é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de fenilalanina (Phe) e seus metabólitos nos tecidos dos pacientes afetados. O dano neurológico é a marca da PKU e a Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. A alanina (Ala) é nutricionalmente um aminoácido não essencial. Ela é o principal aminoácido gliconeogênico porque pode originar piruvato e glicose, tendo sido, por este motivo, usada como um suplemento dietético em combinação com o hormônio de crescimento no tratamento de crianças subnutridas afetadas por algumas doenças metabólicas herdadas, para induzir o anabolismo. O principal objetivo do presente trabalho foi medir as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CCR) e succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral de ratos Wistar sujeitos à hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida e à administração crônica de Ala, desde o 6± até o 21± dia de vida pós-natal. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e Ala nas atividades da SDH e CCR em córtex cerebral de ratos de 22 dias de idade. Os resultados mostraram uma redução nas atividades da SDH e complexos I + III no córtex cerebral de ratos sujeitos à HPA e também no córtex cerebral de ratos sujeitos à administração de Ala. Também verificamos que ambos: Phe e Ala inibiram in vitro a atividade dos complexos I + III por competição com NADH. Considerando a importância da SDH e CCR para a sustentação do suprimento energético para o cérebro, nossos resultados sugerem que o déficit energético possa contribuir para a neurotoxicidade da Phe em PKU. Em relação à Ala, ficou evidenciado que mais investigações serão necessárias antes de considerar a suplementação com Ala como uma terapia adjuvante válida para crianças com estas doenças.

Esta investigación experimental tuvo como objetivo determinar los cambios histomorfológicos que ocurren en el tejido dentoalveolar de la mandíbula de una progenie de ratas albinas sometidas a dietas con diferentes concentraciones de Riboflavina (B2) e iguales concentraciones del resto de nutrientes, durante la gestación y la lactancia hasta los 28 días de edad. La literatura no reporta estudios que aborden los efectos que se dan en el tejido dentoalveolar por ausencia o deficiencia de B2 desde el punto de vista histológico, y en especial cómo influye en el número de la población celular presente en la unidad dentoalveolar. Se conformaron 4 grupos de ratas albinas (raza Holtzman) con capacidad de reproducción, según el requerimiento de Riboflavina: Grupo A, grupo control, con 100% de B2; Grupo B, con 50% de B2; Grupo C, con 25% de B2 y Grupo D, con 0% de B2. Las crías de las ratas de cada grupo fueron sacrificadas a diferentes edades: 0, 7, 14, 21 y 28 días de nacimiento, y se sometieron luego a un estudio histológico en tinción con H.E. y Masson. Los resultados obtenidos muestran que la deficiencia o la carencia total de B2 ocasiona alteraciones en el crecimiento y desarrollo de las ratas crías, manifestándose una menor talla y disminución del peso corporal. Microscópicamente revelan que la carencia total de Riboflavina (0%) en la dieta materna ocasiona en el tejido dentoalveolar de las crías una población celular menor de ameloblastos, odontoblastos, fibroblastos y cementoblastos, una cantidad muy escasa de fibras colágenas en el ligamento periodontal y un hueso alveolar muy adelgazado, siempre en relación al grupo control A (100% de B2); siendo dichos efectos más notorios a partir de los 7 días en adelante. / The aim of the present experimental study was to determine the histomorphological changes that occur in the dentoalveolar tissue of the jaw of an albino rats’ offspring which were fed with diets containing different concentrations of Riboflavin (B2) and equal concentrations of the rest of nutrients during gestation and nursing until 28 days of birth. Literature does not report studies approaching effects in the dentoalveolar tissue for absence or deficiency of Riboflavin from a histological perspective, especially how it influences on the number of cellular population in the dentoalveolar unit. Four groups of albino rats with reproduction capacity (Holtzman breed) were conformed according to requirements of Riboflavin: Group A, Control Group, with 100% of B2; Group B, with 50% of B2; Group C, with 25% of B2 and Group D, with 0% of B2. The offspring of each group were sacrificed at different ages: 0, 7, 14, 21 and 28 days of birth, and then were submitted to a histological examination applying H.E. and Masson stainings. Results obtained show that deficiency and total lack of B2 cause alterations on growth and development of the offspring, which was expressed as lesser height and decrease in corporal weight. Microscopically they reveal that total lack of Riboflavin (0%) in the mother’s diet causes a smaller population of ameloblasts, odontoblasts, fibroblasts and cementoblasts; a very scarce quantity of collagen fibers in periodontal ligament; and a very thin alveolar bone in the dentoalveolar tissue of the offspring with regard to the Control Group (100% of B2). These effects were more noticeable since 7 days of birth. / Tesis

Orientador: Luci Regina Muzzeti / Banca: Andreza Marques de Castro Leão / Banca: Renan Antonio da Silva / Banca: Darbi Masson Suficier / Banca: Rosebelly Nunes Marques / Resumo: Esta pesquisa tem como base os estudos realizados sobre uma ação de formação continuada em adaptação curricular para alunos com deficiência intelectual. A ação de formação contou com a participação de professores da rede pública do Estado de São Paulo, ensino fundamental e médio, nas diferentes áreas de conhecimento, nos horários das Aulas de Trabalho Pedagógico Coletivo - ATPCs. O estudo versou sobre temas relacionados a Educação Especial, dentre os quais, a viabilidade ou não de elaboração e aplicação de atividades adaptadas para alunos com deficiência intelectual matriculados nas salas de aulas do ensino regular. Para isso foi realizado um estudo sobre a trajetória histórica da pessoa com deficiência no mundo ocidental e no Brasil; as contribuições de Vigotski sobre a aprendizagem da pessoa com deficiência; os aspectos legais como a LDBN nº 9.394/96; os Parâmetros Curriculares Nacionais - PCN Adaptação Curricular; o Projeto Político Pedagógico - PPP e as Resoluções SE 61/2014 e SE 68/2017, emitidas pela Secretaria da Educação do Estado de São Paulo sobre a Educação Especial e as atribuições do professor especializado. Outrossim, uma análise das atividades adaptadas realizadas pelos professores na ação de formação continuada e nas salas de aulas do ensino regular. Do mesmo modo, o estudo demonstrou a viabilidade de sua criação, contudo com a participação do professor especializado no apoio pedagógico ao professor do ensino regular. Por fim, a pesquisa constatou que a Educaç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This research is based on the studies carried out on a continuing training action on curriculum adaptation for students with intellectual disabilities. The training action was attended by teachers from public schools in the State of São Paulo, elementary and high school, in the different areas of knowledge, at the times of Collective Pedagogical Work Classes - ATPCs. The study dealt with subjects related to Special Education, among which, the feasibility or not of elaboration and application of adapted activities for students with intellectual disability enrolled in the regular education classrooms. For this, a study was conducted on the historical trajectory of people with disabilities in the western world and in Brazil; Vigotski's contributions on learning for the disabled; legal aspects such as LDBN No. 9.394/96; National Curriculum Parameters - PCN Curriculum Adaptation; the Pedagogical Political Project - PPP and Resolutions SE 61/2014 and SE 68/2017, issued by the São Paulo State Department of Education on Special Education and the duties of the specialized teacher. Furthermore, an analysis of the adapted activities performed by teachers in the continuing education action and in the regular education classrooms. The study demonstrated the viability of its creation of adapted activities, however with the participation of the specialized teacher in the pedagogical support to the regular education teacher. Finally, the research found that Special Education and discussions ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

[pt] Este trabalho examina entrevistas feitas com quatro conselheiros tutelares atuantes no Estado do Rio de Janeiro, com vistas a analisar a construção de suas identidades a partir das histórias que contam. A temática central das entrevistas é a da violência contra crianças e adolescentes com deficiência; sendo assim, este trabalho também examina o modo como os conselheiros tutelares lidam com essa questão. Esta é uma pesquisa de caráter qualitativo, que estuda o discurso com base em uma perspectiva sócio-interacional da análise da narrativa. Serão focalizadas as trajetórias dos conselheiros, antes da entrada ao conselho e também após. Este estudo revela que as narrativas são importante instrumento no entendimento da construção das identidades e da prática de trabalho dos conselheiros. A partir de sua análise percebemos que os conselheiros tutelares apresentam similaridades em alguns aspectos relacionados ao engajamento social e à dificuldade em tratar com a questão da deficiência (no que diz respeito à conceituação e à prática de trabalho), e, por outro lado, apresentam também diferenças, vinculadas à religiosidade e à dificuldade de aceitação inicial do cargo de conselheiro. / [en] This research examines interviews with four public counselors in the State of Rio de Janeiro aiming to analise the construction of their identities through the histories they narrate. The central topic of the interviews is violence against disabled children and adolescents; this research also examines the way public counselors deal with this issue. This is a qualitative research that analyses discourse through a sociointeractional perspective of the narrative analyses. The focus of this work will be on the counselors’ narratives about their lives before and while working as a counselor. This study reveals that narratives are important tools to understand how identities are created and also about the counselors’ work. The narrative analysis leads me to observe that counselors present similarities in social issues and also in defining disability. On the other hand, they show differences related to religious aspects and about initial acceptation of the position at the public councils.

Esta investigación experimental tuvo como objetivo determinar los cambios histomorfológicos que ocurren en el tejido dentoalveolar de la mandíbula de una progenie de ratas albinas sometidas a dietas con diferentes concentraciones de Riboflavina (B2) e iguales concentraciones del resto de nutrientes, durante la gestación y la lactancia hasta los 28 días de edad. La literatura no reporta estudios que aborden los efectos que se dan en el tejido dentoalveolar por ausencia o deficiencia de B2 desde el punto de vista histológico, y en especial cómo influye en el número de la población celular presente en la unidad dentoalveolar. Se conformaron 4 grupos de ratas albinas (raza Holtzman) con capacidad de reproducción, según el requerimiento de Riboflavina: Grupo A, grupo control, con 100% de B2; Grupo B, con 50% de B2; Grupo C, con 25% de B2 y Grupo D, con 0% de B2. Las crías de las ratas de cada grupo fueron sacrificadas a diferentes edades: 0, 7, 14, 21 y 28 días de nacimiento, y se sometieron luego a un estudio histológico en tinción con H.E. y Masson. Los resultados obtenidos muestran que la deficiencia o la carencia total de B2 ocasiona alteraciones en el crecimiento y desarrollo de las ratas crías, manifestándose una menor talla y disminución del peso corporal. Microscópicamente revelan que la carencia total de Riboflavina (0%) en la dieta materna ocasiona en el tejido dentoalveolar de las crías una población celular menor de ameloblastos, odontoblastos, fibroblastos y cementoblastos, una cantidad muy escasa de fibras colágenas en el ligamento periodontal y un hueso alveolar muy adelgazado, siempre en relación al grupo control A (100% de B2); siendo dichos efectos más notorios a partir de los 7 días en adelante. / The aim of the present experimental study was to determine the histomorphological changes that occur in the dentoalveolar tissue of the jaw of an albino rats’ offspring which were fed with diets containing different concentrations of Riboflavin (B2) and equal concentrations of the rest of nutrients during gestation and nursing until 28 days of birth. Literature does not report studies approaching effects in the dentoalveolar tissue for absence or deficiency of Riboflavin from a histological perspective, especially how it influences on the number of cellular population in the dentoalveolar unit. Four groups of albino rats with reproduction capacity (Holtzman breed) were conformed according to requirements of Riboflavin: Group A, Control Group, with 100% of B2; Group B, with 50% of B2; Group C, with 25% of B2 and Group D, with 0% of B2. The offspring of each group were sacrificed at different ages: 0, 7, 14, 21 and 28 days of birth, and then were submitted to a histological examination applying H.E. and Masson stainings. Results obtained show that deficiency and total lack of B2 cause alterations on growth and development of the offspring, which was expressed as lesser height and decrease in corporal weight. Microscopically they reveal that total lack of Riboflavin (0%) in the mother’s diet causes a smaller population of ameloblasts, odontoblasts, fibroblasts and cementoblasts; a very scarce quantity of collagen fibers in periodontal ligament; and a very thin alveolar bone in the dentoalveolar tissue of the offspring with regard to the Control Group (100% of B2). These effects were more noticeable since 7 days of birth.

La presente investigación se realizó con la finalidad de exponer las carencias formativas que presentan los egresados de la Carrera de Educación Mención Inglés de la Universidad de los Andes Táchira, ubicada en San Cristóbal, Estado Táchira, debido al enfoque y metodología tradicional persistente todavía en nuestro sistema educativo.La información obtenida, necesaria para realizarla se obtuvo a través de instrumentos aplicados a docentes y alumnos en la Universidad y en distintos Centros Educativos de Bachillerato de San Cristóbal, con aplicación de Escala Licker los cuales fueron validados por expertos y para su análisis se utilizó la técnica porcentual de cuadros y gráficos, los cuales evidenciaron la necesidad de elaborar la propuesta sobre un programa para la carrera de Educación Mención Inglés, donde se haga énfasis en un verdadero enfoque comunicativo empleando para ello las NN TT y sus respectivas estrategias para el uso y manejo de las mismas. Las teorías para enseñar lenguas extranjeras, las teorías del aprendizaje y los métodos para enseñar idiomas, en este caso el inglés, y la sugerencia para modificar o cambiar el currículo actual de la carrera en la Universidad de los Andes, pues ello beneficia, no sólo al mismo graduado sino que va en provecho de sus futuros alumnos y por ende de la región y el país. / The present investigation was carried out with the purpose of exposing the formative deficiencys that present the graduated of the English Career in Education Mention of University of The Andes, Táchira, located in San Cristóbal, Táchira State, due to the focus and persistent traditional methodology still in our educational system.The obtained information, necessary to carry out it was obtained through applied instruments to professors and students in the University and in different Educational Centers of High school of San Cristóbal, with application of licker Scale which were validated by experts and for their analysis it was used the percentage technique of score boards and graphics, which evidenced the necessity to elaborate the proposal on a Program for the English Career of Education Mention, where emphasis is made in a real communicative focus using for it the NN TT and its respective strategies for the use and handling of the same ones. The theories to tech foreign languages, the theories of the learning and the methods to teach languages, in this case English, and the suggestion to modify or to change the current curriculum of the career in the University motivated the execution of the present thesis. The purpose is framed inside the necessity of to improve and to optimize the quality of the graduated of the University of The Andes, because he or she benefits, not only to the same one graduated but rather he or she goes in its future students' profit and for therefore of the region and the country.

Doutor -- Escola Nacional de Saude Publica, Rio de Janeiro, 2003.

Uma cuidadosa revisão bibliográfica, seguida por uma pesquisa in silico no banco de dados de expressed sequence tags (ESTs) do projeto GENOLYPTUS – Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus, foram realizadas visando identificar classes de genes potencialmente relacionadas com a resposta vegetal à deficiência hídrica em Eucalyptus grandis. Os principais clones de cDNA selecionados potencialmente codificam proteínas relacionadas com a síntese de osmólitos como prolina, sacarose, osmotina, poliaminas, desidrinas, fatores de transcrição, e genes de uma importante cascata de sinalização vegetal à deficiência hídrica. Duas classes de seqüências foram estudadas mais detalhadamente. A Sadenosil- metionina-descarboxilase (SAMDC) é uma enzima-chave na rota de síntese das poliaminas, aminas catiônicas envolvidas em vários processos celulares, inclusive na proteção das estruturas da célula em respostas a diferentes tipos de estresses. Dois grupos de ESTs foram inicialmente identificados por homologia a seqüências conhecidas de SAMDC e duas seqüências potencialmente completas de cada grupo foram selecionadas e denominadas EgrSAMDC1 e EgrSAMDC2. As seqüências deduzidas de aminoácidos de ambos os cDNAs apresentaram os dois principais domínios da enzima e uma estrutura conservada em relação a outras SAMDCs de plantas. Além da região de leitura aberta (ORF, do inglês, open reading frame) principal, os cDNAs apresentaram duas pequenas regiões codificadoras conservadas, denominadas tiny e small upstream ORFs na longa região 5’ não traduzida, relacionadas à regulação pós-transcricional dos genes. Em análises de Southern blot, foram detectados pelo menos dois fortes sinais de hibridização para cada amostra de DNA genômico de E. grandis digerido por endonucleases distintas, sugerindo a existência de (pelo menos) duas cópias genômicas de SAMDC. Por Northern blots, a presença de mRNAs para SAMDC foi detectada em folhas e caules jovens e, em menor quantidade, em tecidos vasculares de árvores adultas. Entretanto e nitidamente, a maior expressão de SAMDC em E. grandis ocorre em flores abertas. Análises quantitativas por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da DNApolimerase (qRT-PCR) com plântulas cultivadas in vitro por 4 meses, submetidas a diferentes tratamentos como ácido abscísico (ABA), ácido naftalenoacético (ANA), quinetina (KIN), cloreto de sódio (NaCl), seca, frio, luz ultravioleta (UV), ferimentos e extrato de leveduras, 9 demonstraram maior indução da expressão de EgrSAMDC2 na presença de ABA e NaCl. Também foi observada uma drástica redução na expressão deste gene, baseado nos níveis de mRNA-molde para as RT-PCRs, quando as plântulas foram expostas a UV e seca. Estes resultados indicaram que o gene EgrSAMDC2 pode estar mais relacionado à resposta vegetal à elevada salinidade, por intermédio da sinalização por ABA, do que à resposta a outros estresses ambientais ou bióticos. A segunda classe de genes identificados e analisados junto ao GENOLYPTUS como potencialmente relacionados à deficiência hídrica potencialmente codificam proteína-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs, do inglês, mitogen-activated protein kinases). MAPKs são proteínas de uma importante cascata sinalizadora, constituída por três componentes denominados MAPKKK, MAPKK e MAPK. Elas estão envolvidas na sinalização do desenvolvimento, estímulos hormonais e de estresses bióticos e abióticos. O cDNA selecionado, de aproximadamente 5 kb, representa uma seqüência imatura de mRNA (transcrito primário), no qual estão presentes dois íntrons. Nas extremidades 5’ e 3’ dos íntrons existem sítios canônicos de processamento (splicing) que indicam que o transcrito deve ser corretamente processado em um mRNA maduro. A proteína deduzida a partir da união dos éxons indica que o cDNA isolado de E. grandis potencialmente codifica uma MAPK2, com alta homologia a outras MAPKs vegetais. Além disto, a seqüência de aminoácidos representa uma proteína completa, na qual os 11 domínios conservados em MAPKs, fundamentais para o correto funcionamento da enzima, estão presentes. Análise de Southern blot indicaram que este gene está presente em cópia única no genoma de E. grandis. Em análises da expressão por qRT-PCR em plântulas submetidas aos diferentes tratamentos descritos acima, foi observado uma significativa indução da transcrição com KIN e NaCl, e uma leve indução por ABA. O tratamento com UV provocou uma drástica redução na expressão de EgrMAPK2. Este resultado fornece indícios de que este gene possivelmente esteja em envolvido em repostas a estresses abióticos. / A careful bibliographical review, followed by an in silico screening of the expressed sequence tag (EST) databank of the GENOLYPTUS Project – The Brazilian Research Network on the Eucalyptus Genome, were conducted to identify genes potentially related to drought responses in Eucalyptus grandis. The main selected clones potentially encode proteins related to the biosynthesis of different osmolites such as proline, sucrose, osmotin and polyamines, dehydrines, transcription factors and genes from an important plant signaling cascade. Two gene classes were studied in more detail. S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) is one of the key regulatory enzymes in the biosynthesis of polyamines, cationic amines involved in various processes of the cell, including the protection of cellular structures in response to different stresses. Two clusters of ESTs were initially identified by homology to known SAMDC sequences and, from each of them, two full-length cDNAs were identified and named EgrSAMDC1 and EgrSAMDC2. The deduced amino acid sequences from both cDNAs showed the two main enzyme domains and a conserved protein structure in comparison to other plant SAMDCs. Besides the main open reading frame (ORF), two other tiny and small upstream ORFs were found in the long 5’ non-translated region of the cDNAs. These sequences are known to be associated with post-transcriptional regulation. Southern blot analysis resulted in two strong hybridization signals for each genomic DNA digested with different restriction enzymes, indicating (at least) two SAMDC genomic copies. Northern blots detected SAMDC mRNAs in young leaves and stems and a lower transcript level in vascular tissues from mature trees. Nevertheless, the highest levels of E. grandis SAMDC steady-state mRNA was clearly detected in opened flowers. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) with total RNA from 4-months old in vitro seedlings subjected to different treatments, such as abscisic acid (ABA), naphthaleneacetic acid (NAA), kinetin (KIN), sodium chloride (NaCl), drought, cold, ultraviolet light (UV), wounding and yeast extract, demonstrated higher expression induction of EgrSAMDC2 gene with ABA and NaCl. A drastic reduction in gene expression was observed after UV and drought treatments of the seedlings, based on RNA-template levels for RT-PCRs. These results suggested that 11 EgrSAMDC2 gene might be more related to plant response against high salinity, possibly via ABA signaling, than to other environmental or biotic-like stress responses. The second gene class identified and analyzed in the GENOLYPTUS, as potentially involved in drought responses, encodes a mitogen-activated protein kinase (MAPK). MAPKs proteins are part of an important signaling casacade, which consists of three components, MAPKKK, MAPKK and MAPK. They are associated to developmental signaling, hormonal and biotic and abiotic stimuli. The selected cDNA, of about 5 kb in length, represented an immature mRNA (primary transcript) with two non-spliced introns. The canonical 5’ and 3’ splicing sites suggested that the transcript might probably be correctly translated to a mature mRNA. The deduced protein from the union of all three exons indicated that the isolated E. grandis cDNA potentially encodes a MAPK2, with high homology to other plant MAPKs. Moreover, the amino acid sequence represented a complete protein, with all 11 domains conserved in MAPKs and known to be fundamental for the enzyme functionality. Southern blot analysis indicated that EgrMAPK2 is encoded by a single genomic copy in E. grandis. From qRT-PCR expression analysis, conducted with the same plant material described above, we observed a significant transcription induction with KIN and NaCl, and a weaker induction by ABA. The UV treatment resulted in a drastic reduction of EgrMAPK2 expression. This result strongly indicated that this gene is most probably involved in abiotic stress responses.

Uma cuidadosa revisão bibliográfica, seguida por uma pesquisa in silico no banco de dados de expressed sequence tags (ESTs) do projeto GENOLYPTUS – Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus, foram realizadas visando identificar classes de genes potencialmente relacionadas com a resposta vegetal à deficiência hídrica em Eucalyptus grandis. Os principais clones de cDNA selecionados potencialmente codificam proteínas relacionadas com a síntese de osmólitos como prolina, sacarose, osmotina, poliaminas, desidrinas, fatores de transcrição, e genes de uma importante cascata de sinalização vegetal à deficiência hídrica. Duas classes de seqüências foram estudadas mais detalhadamente. A Sadenosil- metionina-descarboxilase (SAMDC) é uma enzima-chave na rota de síntese das poliaminas, aminas catiônicas envolvidas em vários processos celulares, inclusive na proteção das estruturas da célula em respostas a diferentes tipos de estresses. Dois grupos de ESTs foram inicialmente identificados por homologia a seqüências conhecidas de SAMDC e duas seqüências potencialmente completas de cada grupo foram selecionadas e denominadas EgrSAMDC1 e EgrSAMDC2. As seqüências deduzidas de aminoácidos de ambos os cDNAs apresentaram os dois principais domínios da enzima e uma estrutura conservada em relação a outras SAMDCs de plantas. Além da região de leitura aberta (ORF, do inglês, open reading frame) principal, os cDNAs apresentaram duas pequenas regiões codificadoras conservadas, denominadas tiny e small upstream ORFs na longa região 5’ não traduzida, relacionadas à regulação pós-transcricional dos genes. Em análises de Southern blot, foram detectados pelo menos dois fortes sinais de hibridização para cada amostra de DNA genômico de E. grandis digerido por endonucleases distintas, sugerindo a existência de (pelo menos) duas cópias genômicas de SAMDC. Por Northern blots, a presença de mRNAs para SAMDC foi detectada em folhas e caules jovens e, em menor quantidade, em tecidos vasculares de árvores adultas. Entretanto e nitidamente, a maior expressão de SAMDC em E. grandis ocorre em flores abertas. Análises quantitativas por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da DNApolimerase (qRT-PCR) com plântulas cultivadas in vitro por 4 meses, submetidas a diferentes tratamentos como ácido abscísico (ABA), ácido naftalenoacético (ANA), quinetina (KIN), cloreto de sódio (NaCl), seca, frio, luz ultravioleta (UV), ferimentos e extrato de leveduras, 9 demonstraram maior indução da expressão de EgrSAMDC2 na presença de ABA e NaCl. Também foi observada uma drástica redução na expressão deste gene, baseado nos níveis de mRNA-molde para as RT-PCRs, quando as plântulas foram expostas a UV e seca. Estes resultados indicaram que o gene EgrSAMDC2 pode estar mais relacionado à resposta vegetal à elevada salinidade, por intermédio da sinalização por ABA, do que à resposta a outros estresses ambientais ou bióticos. A segunda classe de genes identificados e analisados junto ao GENOLYPTUS como potencialmente relacionados à deficiência hídrica potencialmente codificam proteína-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs, do inglês, mitogen-activated protein kinases). MAPKs são proteínas de uma importante cascata sinalizadora, constituída por três componentes denominados MAPKKK, MAPKK e MAPK. Elas estão envolvidas na sinalização do desenvolvimento, estímulos hormonais e de estresses bióticos e abióticos. O cDNA selecionado, de aproximadamente 5 kb, representa uma seqüência imatura de mRNA (transcrito primário), no qual estão presentes dois íntrons. Nas extremidades 5’ e 3’ dos íntrons existem sítios canônicos de processamento (splicing) que indicam que o transcrito deve ser corretamente processado em um mRNA maduro. A proteína deduzida a partir da união dos éxons indica que o cDNA isolado de E. grandis potencialmente codifica uma MAPK2, com alta homologia a outras MAPKs vegetais. Além disto, a seqüência de aminoácidos representa uma proteína completa, na qual os 11 domínios conservados em MAPKs, fundamentais para o correto funcionamento da enzima, estão presentes. Análise de Southern blot indicaram que este gene está presente em cópia única no genoma de E. grandis. Em análises da expressão por qRT-PCR em plântulas submetidas aos diferentes tratamentos descritos acima, foi observado uma significativa indução da transcrição com KIN e NaCl, e uma leve indução por ABA. O tratamento com UV provocou uma drástica redução na expressão de EgrMAPK2. Este resultado fornece indícios de que este gene possivelmente esteja em envolvido em repostas a estresses abióticos. / A careful bibliographical review, followed by an in silico screening of the expressed sequence tag (EST) databank of the GENOLYPTUS Project – The Brazilian Research Network on the Eucalyptus Genome, were conducted to identify genes potentially related to drought responses in Eucalyptus grandis. The main selected clones potentially encode proteins related to the biosynthesis of different osmolites such as proline, sucrose, osmotin and polyamines, dehydrines, transcription factors and genes from an important plant signaling cascade. Two gene classes were studied in more detail. S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) is one of the key regulatory enzymes in the biosynthesis of polyamines, cationic amines involved in various processes of the cell, including the protection of cellular structures in response to different stresses. Two clusters of ESTs were initially identified by homology to known SAMDC sequences and, from each of them, two full-length cDNAs were identified and named EgrSAMDC1 and EgrSAMDC2. The deduced amino acid sequences from both cDNAs showed the two main enzyme domains and a conserved protein structure in comparison to other plant SAMDCs. Besides the main open reading frame (ORF), two other tiny and small upstream ORFs were found in the long 5’ non-translated region of the cDNAs. These sequences are known to be associated with post-transcriptional regulation. Southern blot analysis resulted in two strong hybridization signals for each genomic DNA digested with different restriction enzymes, indicating (at least) two SAMDC genomic copies. Northern blots detected SAMDC mRNAs in young leaves and stems and a lower transcript level in vascular tissues from mature trees. Nevertheless, the highest levels of E. grandis SAMDC steady-state mRNA was clearly detected in opened flowers. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) with total RNA from 4-months old in vitro seedlings subjected to different treatments, such as abscisic acid (ABA), naphthaleneacetic acid (NAA), kinetin (KIN), sodium chloride (NaCl), drought, cold, ultraviolet light (UV), wounding and yeast extract, demonstrated higher expression induction of EgrSAMDC2 gene with ABA and NaCl. A drastic reduction in gene expression was observed after UV and drought treatments of the seedlings, based on RNA-template levels for RT-PCRs. These results suggested that 11 EgrSAMDC2 gene might be more related to plant response against high salinity, possibly via ABA signaling, than to other environmental or biotic-like stress responses. The second gene class identified and analyzed in the GENOLYPTUS, as potentially involved in drought responses, encodes a mitogen-activated protein kinase (MAPK). MAPKs proteins are part of an important signaling casacade, which consists of three components, MAPKKK, MAPKK and MAPK. They are associated to developmental signaling, hormonal and biotic and abiotic stimuli. The selected cDNA, of about 5 kb in length, represented an immature mRNA (primary transcript) with two non-spliced introns. The canonical 5’ and 3’ splicing sites suggested that the transcript might probably be correctly translated to a mature mRNA. The deduced protein from the union of all three exons indicated that the isolated E. grandis cDNA potentially encodes a MAPK2, with high homology to other plant MAPKs. Moreover, the amino acid sequence represented a complete protein, with all 11 domains conserved in MAPKs and known to be fundamental for the enzyme functionality. Southern blot analysis indicated that EgrMAPK2 is encoded by a single genomic copy in E. grandis. From qRT-PCR expression analysis, conducted with the same plant material described above, we observed a significant transcription induction with KIN and NaCl, and a weaker induction by ABA. The UV treatment resulted in a drastic reduction of EgrMAPK2 expression. This result strongly indicated that this gene is most probably involved in abiotic stress responses.