Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O retardo mental (RM) é caracterizado por um funcionamento intelectual significantemente abaixo da média (QI<70). A prevalência de RM varia entre estudos epidemiológicos, sendo estimada em 2-3% da população mundial, constituindo assim, um dos mais importantes problemas de saúde pública. Há um consenso geral de que o RM é mais comum no sexo masculino, um achado atribuído às numerosas mutações nos genes encontrados no cromossomo X, levando ao retardo mental ligado ao X (RMLX). Dentre os genes presentes no cromossomo X, o Jumonji AT-rich interactive domain IC (JARID1C) foi recentemente identificado como um potencial candidato etiológico do RM, quando mutado. O JARID1C codifica uma proteína que atua como uma desmetilase da lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Tão recente como a identificação do gene JARID1C, é a descoberta de que mudanças no número de cópias de sequências de DNA, caracterizadas por microdeleções e microduplicações, poderiam ser consideradas como razões funcionalmente importantes de RMLX. Atualmente, cerca de 5-10% dos casos de RM em homens são reconhecidos por ocorrerem devido a estas variações do número de cópias no cromossomo X. Neste estudo, investigamos mutações no gene JARID1C, através do rastreamento dos éxons 9, 11, 12, 13, 15 e 16, em 121 homens de famílias com RM provavelmente ligado ao X. Paralelamente, realizamos a análise da variação do número de cópias em 16 genes localizados no cromossomo X através da técnica de MLPA no mesmo grupo de pacientes. Esta metodologia consiste em uma amplificação múltipla que detecta variações no número de cópias de até 50 sequências diferentes de DNA genômico, sendo capaz de distinguir sequências que diferem em apenas um nucleotídeo. O DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico e as amostras foram amplificadas pela técnica de PCR, seguida da análise por sequenciamento direto. Foram identificadas três variantes na sequência do gene JARID1C entre os pacientes analisados: a variante intrônica 2243+11 G>T, que esteve presente em 67% dos pacientes, a variante silenciosa c.1794C>G e a mutação inédita nonsense c.2172C>A, ambas presentes em 0,82% dos indivíduos investigados. A análise através do MLPA revelou uma duplicação em um dos pacientes envolvendo as sondas referentes ao gene GDI1 e ao gene HUWE1. Este trabalho expande o estudo de mutações no gene JARID1C para a população brasileira ereforça a importância da triagem de mutações neste gene em homens portadores de RM familiar de origem idiopática, assim como, é primeiro relato científico relativo à investigação de variações no número de cópias de genes localizados no cromossomo X em homens brasileiros com RM, através da técnica de MLPA. / Mental retardation (MR) is defined as a disability characterized by significant below average intellectual functioning (IQ>70). The prevalence of MR varies between epidemiological studies, estimated at 2-3% of the population, thus constituting a major public health problem. There is a general consensus that MR is more common in males, a finding attributed, in part, to mutations in the genes located on the X chromosome, leading to an X-linked mental retardation (XLMR). Among all the genes present on X chromosome, Jumonji AT-rich interactive domain IC (JARID1C) was recently identified as aetiologic potential candidate of MR, when mutated. The JARID1C gene encodes a protein that acts as a histone demethylase specific for histone 3 lysine 4 (H3K4) and it is indispensable for the epigenetic regulation. As recently as the identification of the JARID1C gene, it is the discovery that changes in the number of copies of DNA sequences, characterized by microdeletions and microduplications, could be regarded as functionally important reasons to XLMR. Currently, about 5-10% of men MR cases are known to occur due to these variations in the number of copies of chromosome X. In this study we investigated mutations in the JARID1C gene by screening of exons 9, 11, 12, 13, 15 and 16 in 121 patients from families with X-linked MR. At the same time we analyzed the variation in the number of copies in 16 genes located in X chromosome through the MLPA technique. This metodology consists of a multiplex amplification that detects variations in the number of copies up to 50 different genomic DNA sequences, being able to distinguish sequences that differ by only one nucleotide. Genomic DNA was extracted from peripheral blood and the samples were amplified by PCR followed by direct sequencing analysis. We identified three sequence variants among 121 patients. The intronic variant c.2243 +11 G> T, which was present in 67% of patients analyzed, the silent variant c.1794C> G and the novel nonsense mutation c.2172C> A, which was present in 0,82% of patients analyzed. The MLPA analysis revealed that the patient 58 exhibited a duplication involving probes for the GDI1 gene and the HUWE1 gene, resulting in an increase in the number of copies of this gene. This work expands the study of mutations in the JARID1C gene for the Brazilian population and reinforces the importance of screening for mutations in this gene in men with idiopathic mental retardation, and it is the first scientific report on the investigation of variations in the number of copies in genes located on chromosome X in Brazilian men with MR using the MLPA technique.

Les phytoplasmes sont des bactéries phytopathogènes, sans paroi, qui appartenant à la classe des Mollicutes. Ils ne peuvent pas etre cultivés in vitro et sont limités à des tubes du phloème. Ils provoquent des centaines de maladies chez de nombreuses espèces végétales dans le monde entier, ce qui conduit à des pertes de récolte importantes. Les phytoplasmes sont transmis naturellement par des insectes suceurs de sève dans laquelle ils se multiplient. Ils induisent des symptômes graves, notamment le jaunissement, la croissance limitée, déclin, ainsi que des anomalies des fleurs et des fruits. L'infection par le phytoplasme du stolbur, en particulier, affect fortement la morphologie florale. Dans la tomate, deux isolats différents du phytoplasme du stolbur, nommé C et PO, induisent des symptômes différents. La tomate infectée par le phytoplasme du stolbur PO montrent des malformations florale telles que les sépales hypertrophiés, les pétales et les étamines avortées ce qui conduit à la stérilité. En revanche, la tomate infecté par le phytoplasme du stolbur C ont de petites feuilles de tomate en retrait, mais les fleurs presque normale, et produisent des fruits. Nous avons précédemment montré que SlDEF, un gène impliqué dans la formation des pétales est réprimé dans des plantes de tomate infectée par le stolbur phytoplasme PO. Toutefois, l'expression de son facteur de transcription, codée par le gène FA, est resté stable ou voir légèrement augmentée. Nous avons donc émis l'hypothèse que la répression de SlDEF pourrait être dû à une méthylation de l'ADN. Pour tester cette hypothèse, nous avons étudié l'expression des gènes de méthylases et de déméthylases. Ils étaient en général réprimés dans les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur PO, ce qui était en accord avec l'hypothèse De plus, nous avons étudié les voies de défense activée chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur. Pour se défendre, les plantes utilisées des molécules de signalisation comme l'acide salicylique (SA), l'acide jasmonique (JA) et d'éthylène (ET). Nous avons étudié l'expression de 21 gènes de défense dépendants SA / JA / ET, des gènes de biosynthèse et les facteurs de transcription chez les tomates infectées par les phytoplasmes du stolbur C et PO. Nous avons également étudié l'effet de la pré-activation des voies de SA et JA sur la production des symptômes. Nos résultats montrent clairement que les voies de défense ont été activées différemment dans les tomates infectés par le phytoplasme du stolbur C et PO. En effet, les voies de défense dépendantes de SA, ET et JA ont été activées chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur C alors que seulement les voies dépendantes SA et ET ont été activés dans les tomates infectées par stolbur PO . En outre, la pré-activation de la voie de défense dépendante SA par l'application de BTH modifie légèrement l'évolution des symptômes de maladies causées par le phytoplasme du stolbur PO / Phytoplasma are cell wall-less, phytopathogenic bacteria belonging to the class Mollicutes. They have not been cultured in vitro and are restricted to the phloem sieve tubes. They cause hundreds of diseases in many plant species worldwide, resulting in important crop losses. Phytoplasmas are naturally transmitted by sap-sucking insects in which they multiply. They induce severe symptoms including yellowing, restricted growth, decline, as well as major flowers and fruits abnormalities.The stolbur phytoplasma infection, in particular, has been reported to strongly affect floral morphology. In tomato, two different isolates of stolbur phytoplasma, named C and PO, induce different symptoms. The stolbur PO phytoplasma-infected plants show abnormal flower development such as hypertrophied sepals, and aborted petals and stamens leading to sterility. In contrast, stolbur C phytoplasma-infected tomato have small indented leaves but nearly normal flowers, and produce fruits. We have previously shown that SlDEF, one gene involved in petal formation, was repressed in stolbur PO phytoplasma-infected tomato. However, the expression of its transcription factor, encoded by the gene FA, was unchanged or slightly up-regulated. So we hypothesized that SlDEF repression could be due to DNA methylation. To test this hypothesis, we studied the expression of DNA methylases and demethylases genes. They were in general down-regulated in stolbur PO infected tomato, which was in agreement with the hypothesis. However, the regulation of SlDEF expression could not be firmly correlated to the DNA methylation status of its promoter region. In addition, we studied the plant defense pathways activated in stolbur phytoplasma-infected tomato. To defend themselves, plants used signalling molecules like Salicylic acid (SA), Jasmonic acid (JA) and Ethylene (ET). We studied the expression of 21 SA/JA/ET regulated defense and biosynthesis genes including transcription factors in stolbur C and PO phytoplasma-infected tomato as compared to healthy ones. We also studied the effect of pre-activation of SA and JA mediated defense pathways on symptom production. Our results clearly showed that defense pathways were activated differently in stolbur C and PO phytoplasma-infected tomato. Indeed, SA ET and JA dependant pathways were activated in stolbur C-infected tomato while only SA and ET dependant pathways were activated in stolbur PO-infected plants. In addition, pre-activation of SA-dependent defense pathway by application of BTH slightly modify the evolution of disease symptoms caused by stolbur PO phytoplasma whereas no effect was observed after treatment with an analogue of JA.

Rtuť je v přírodě přirozeně se vyskytujícím toxickým prvkem, jehož globální emise jsou ovlivňovány zejména antropogenními zdroji znečištění. Obrovský globální nárůst v usazování rtuti, zejména ve vodných ekosystémech, byl zaznamenán současně s počátkem průmyslové revoluce. Sedimenty jsou posledním místem úložiště nejrůznějších komplexů rtuti. Rtuť však zde může být přeměněna na toxičtější organickou formu, methylrtuť, pomocí transformačních procesů kontrolovaných různými fyzikálními, chemickými, ale i biologickými faktory. Navíc mohou být specie rtuti remobilizovány ze sedimentů pomocí difuze a resuspenzace a tak se sedimenty mohou stát i potenciálním zdrojem rtuti. Proces bioakumulace a bioobohacování tak pokračuje v potravním řetězci, ve kterém se člověk, i další zvířata, stává konzumentem methylrtuti. Stanovení celkové koncentrace rtuti není dostačující k porozumění osudu rtuti v přírodním prostředí a tak stanovení MeHg poskytuje nezbytnou doplňující informaci. Dostatečně citlivá a přesná analytická metoda pro stanovení specií rtuti je nezbytným nástrojem environmentální chemie. Metody vhodné pro stanovení specií rtuti v sedimentech jsou popsány v části metodologie disertační práce. Metoda stanovení methylrtuti v sedimentech pomocí automatické Headspace vybavené pastí („trap“) a spojené s plynovou chromatografií a fluorescenční detekcí je zde také popsána. Zvláštní pozornost je také věnována potřebám zásad čistého vzorkování, skladování vzorků a přípravě vzorků před samotou analýzou, jakož i samostatné části věnující se terénní studii rtuti a methylrtuti v sedimentech vytipovaných lokalit. Sedimenty jižní Moravy a severní Francie jsou srovnány z hlediska znečištění rtutí. Specie rtuti a další ukazatele (Fe, Mn, S) byly analyzovány v sedimentech, pórové vodě a povrchové vodě řek Dele a Lys (Francie) a Jihlava a Morava (Česká republika). Z hlediska posouzení vodních ekosystémů a jejich znečištění rtutí, je vhodné znát koncentraci rtuti v pórové vodě a posoudit dostupnost rtuti ze sedimentů. Technika difuzního gradientu v tenkém filmu je vhodným způsobem jak stanovit koncentraci rtuti v pórové vodě sedimentů. Do roku 2005 bylo použití této techniky pro měření rtuti značně limitováno. Ale nedávný pokrok především v dostupnosti možných sorpčních gelů vhodných pro stanovení rtuti umožnilo využití této techniky i pro stanovení rtuti. Byly použity různé sorpční gely: Spheron.Thiol, Duolite GT-73 a TiO2. Řeka Dele představuje past enormního množství antropogenní rtuti pocházející z průmyslových zdrojů a je považována za potenciální významný zdroj methylrtuti pro okolní prostředí a živé organismy především. Poslední část dizertační práce se zabývá aplikací dobře zavedeného experimentu využívajícím stabilní isotopy ke studiu metylačních a demethylačních procesů v sedimentech řeky Dele. Obohacené stabilní značkovače rtuti v anorganické formě (199Hg) and methylované formě (201MeHg) byly přidány do sedimentů. Tyto označené specie rtuti tak pomohly sledovat osud specií rtuti a vypočítat rozsah jejich přeměny v průběhu experimentu.

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Die enzymatischen Transformationen mit der pilzlichen Peroxygenase aus Agrocybe aegerita haben gezeigt, dass das Enzym insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum bezüglich der Flavonoide verfügt. Die Flavonoide werden mittels AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert. Der Reaktionsmechanismus der AaeAPO bei Flavonoiden läuft über eine Epoxidstufe ab, wobei der eingefügte Sauerstoff bei Hydroxylierungen dem Wasserstoffperoxid entstammt (Hinweis auf eine echte Peroxygenase-Reaktion). Die Enzymproduktion der Agrocybe aegerita wird durch den Extraktzusatz (aus jeweils Aronia melanocarpa, Fragaria ananassa, Trifolium pratense und Bellis perennis) im Fall der Laccase stimuliert. Die AaeAPO -Aktivität wird dagegen gehemmt. Für Bjerkandera adusta kann eine moderate Stimulierung der MnP-Bildung nach der Extraktzugabe beobachtet werden. Der positive bzw. negative Einfluss auf die Enzymproduktion ist bei Agrocybe aegerita sowohl auf Flavonoide als auch auf das Lösungsmittel Ethanol zurückzuführen.

La lutte chimique est la principale méthode utilisée pour contrôler les maladies causées par les champignons phytopathogènes. Dans certains cas, desphénomènes de résistance envers les fongicides se développent au sein despopulations, altérant parfois l’efficacité des molécules. La compréhension du moded’action des fongicides et des mécanismes de résistance sous-jacents participe à élaboreret à adapter des stratégies de management anti résistance ; et ainsi permettre depérenniser la durée de vie des molécules. Le fenhexamid est un fongicide récent (BayerCropScience, 2000), avec un mode d’action unique. Il est le seul fongicide commercialisébloquant l’étape de C4-déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol. Plusieurs typesde résistance (naturelle et acquises) ont été détectées dans les vignobles européens chez lecomplexe d’espèces Botrytis spp. responsable de la pourriture grise de la vigne. Lestravaux développés durant la thèse s’inscrivent dans l’objectif de la caractérisation dumode d’action et de l’élucidation des mécanismes de résistance. Le premier axe s’estattaché à la caractérisation fonctionnelle de deux gènes impliqués dans la C-4déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol : le gène erg27 codant la 3-céto réductase,cible du fenhexamid, et le gène erg28 codant une protéine qui interagirait en partie avecla 3-céto réductase. Concernant la résistance au fenhexamid, il a été démontré que, pargénétique inverse, les mutations détectées dans le gène erg27 de différents types d'isolatsrésistants issus du vignoble (phénotypes de résistance HydR3- et HydR3+) conféraient larésistance. Par ailleurs, une analyse de fitness du phénotype le plus préoccupant(phénotype HydR3+) a été réalisée en conditions contrôlées sur des souches isogéniquesartificielles afin d’apporter une réponse sur la persistance possible de ces souches auvignoble. Une méthode fine de quantification moléculaire de ces mêmes isolats aégalement été mise au point pour faciliter le suivi de leur évolution et de la persistancedes populations naturelles à l’échelle des vignobles. Cette nouvelle méthode, nomméeASPPAA PCR, exploite le polymorphisme nucléotidique du gène erg27, à l’origine de larésistance. Enfin, la résistance naturelle au fenhexamid de l’espèce apparentée à Botrytiscinerea, appelée Botrytis pseudocinerea a été élucidée. La résistance au fongicide de cetteespèce a été expliquée par la combinaison de modifications de cible (mécanismeminoritaire) et d’une dégradation du fongicide par un cytochrome P450 nomméCyp68.4 (mécanisme majeur). Il s’agit de la première identification et caractérisationgénétique d’un mécanisme de résistance à un fongicide conférée par un processus dedétoxification chez un champignon phytopathogène. / Chemical control is the main method used to control diseases caused byphytopathogenic fungi. In some cases, the resistance phenomena towardfungicides occur within fungal populations, which might alter practicalefficiency of molecules. Understanding modes of action of fungicides andunderlying resistance mechanisms participate to the development and adaptationof management strategies against resistance, and thus help to sustain the life ofmolecules. Fenhexamid is a recent fungicide (Bayer CropScience, 2000), with aparticular mode of action. It is the only fungicide marketed blocking the C4-demethylation step of ergosterol biosynthesis. Several types of resistance (naturaland acquired) were detected in European vineyards in the Botrytis spp speciescomplex, causing grey mold disease. This work focused on the characterization ofthe mode of action and the elucidation of resistance mechanisms. The first aspectinvestigated the functional characterization of two genes involved in the C4-demethylation of ergosterol biosynthesis. The erg27 gene potentially encoding the3-keto reductase which is the fenhexamid target and the erg28 gene encoding aprotein that interact in part with the 3-ketoreductase. Concerning fenhexamidresistance, we shown by reverse genetics that mutations detected in the erg27 genefrom different resistant isolates from the vineyards (phenotypes HydR3- andHydR3+) confer resistance. Furthermore, a fitness analysis under controlledconditions on the most worrying resistant phenotype (HydR3+) was performed onisogenic artificial strains in order to predict the possible persistence of these strainsin vineyards. A fine molecular method to quantify these isolates was developed tofacilitate the follow-up of evolution and persistence of resistant populations in thevineyard. This new method, named ASPPAA PCR is based on the nucleotidepolymorphism of the erg27 gene, responsible for fenhexamid resistance. Finally,the natural resistance to fenhexamid of the related species to Botrytis cinerea, B.pseudocinerea, was elucidated. Fungicide resistance of this species is explained bythe combination of target site modifications (minor mechanism) and fungicidedegradation mediated by a cytochrome P450 named Cyp68.4 (major mechanism).This is the first characterization of a genetic resistance mechanism to a fungicideconferred by detoxification in a phytopathogenic fungus.