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Imunidade inata ao vírus da dengue: um estudo do interferon do tipo I / Innate immunity to dengue virus: a study of the type I interferonSilva, Mayara Marques Carneiro January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A febre da dengue (FD) e a febre hemorrágica da dengue (FHD) têm emergido como as mais importantes doenças causadas por arbovírus em áreas tropicais. A forma mais grave da doença, a FHD, apresenta taxa de mortalidade geralmente entre 1 por cento e 10 por cento e requer hospitalização e um cuidadoso controle hemodinâmico dos pacientes. O interferon do tipo I (IFN-I), IFN-alfa/beta, juntamente com o IFN tipo do II (IFN-II), IFN-gama, são fundamentais na mediação da resposta antiviral, através da modulação da resposta imune para inibir a propagação viral. No presente trabalho, propomos o estudo da resposta imune inata ao vírus da dengue (DENV), com ênfase no IFN-I. Para isso, investigamos os níveis de expressão dos genes que codificam os IFN-I e IFN-II, utilizando cDNA, obtido de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes infectados com o DENV, através do sistema de PCR em tempo real (qPCR), e analisamos os níveis de IFN-I no soro dos mesmos pacientes pelo ELISA. Avaliamos, também, a via de sinalização do IFN-I em células infectadas por diferentes cepas do DENV, utilizando a linhagem celular BHK21pISRELucHygro, que possui em seu genoma um plasmídeo que contém como promotor o ISRE (região responsiva ao IFN-I) fusionado ao gene repórter luciferase. A quantificação do IFN-I das PBMCs, por qPCR, mostrou que os pacientes acometidos com a FHD, com até 5 dias de febre, expressaram níveis mais elevados do IFN-I quando comparados aos pacientes acometidos pela FD. Enquanto, os níveis séricos de IFN-alfa dos pacientes FD e FHD, quantificados através do ELISA, mostraram níveis similares, representando um padrão diferente do observado nos transcritos de IFN-I em PBMCs. No entanto, os níveis séricos de IFN-gama foram significativamente maiores em pacientes FHD, confirmando o padrão observado na quantificação por qPCR / Por fim, na análise da via de sinalização do IFN-I via expressão da luciferase em células BHK21pISRELucHygro após infecção por diferentes cepas do DENV foi observado que esses isolados clínicos possuíram a capacidade de inibir a via em diferentes proporções
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Anticorpos antidengue sorotipo específico em um estudo de base polulacional realizado em Recife, Pernambuco / Serotype specific antibodies antidengue in a baseline study polulacional held in Recife, PernambucoCastanha, Priscila Mayrelle da Silva January 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Dengue é considerada a mais importante arbovirose, constituindo um grave problema de saúde pública no mundo. A doença é causada por um Flavivirus com quatro sorotipos (DENV-1, 2, 3 e 4) antigenicamente similares, mas imunologicamente distintos. A circulação simultânea desses sorotipos é apontada como um importante fator de risco para determinação dos casos graves da doença, pois aumenta a probabilidade de ocorrência de infecções secundárias e o surgimento de genótipos mais virulentos. Inquérito sorológico de base populacional conduzido na cidade do Recife, Pernambuco, entre 2005-2006, em 2.833 indivíduos com idades entre 05 e 64 anos, residentes em três áreas com condições sócio-econômicas distintas encontrou prevalência global superior a 80 por cento, indicando elevada transmissão da infecção no município. Esse estudo investigou a imunidade antidengue sorotipo específica em uma amostra aleatória de 324 participantes com sorologia positiva (IgG) de uma das áreas investigadas. Além disso, estimou-se a proporção de susceptíveis aos diferentes sorotipos na população, com base na extrapolação dos resultados da amostra. O teste de neutralização por redução do número de placas (PRNT) foi utilizado na sorotipagem. A freqüência de infecções monotípicas e multitípicas foram analisadas de acordo com grupo etário, sexo, dengue auto-referida e busca por atendimento. Observou-se elevada proporção de indivíduos imunes ao DENV-3 (35,6 por cento; IC: 86,7-96,6) e de infecções multitípicas (61,6 por cento), não tendo sido observado diferenças entre os grupos etários (p=0,395). Houve maior proporção de susceptíveis aos sorotipos DENV-1 (15 anos
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Desenho e produção de proteínas quiméricas potencialmente aplicáveis no desenvolvimento de testes diagnóstico e/ou vacinas para a febre DengueBatista, Izabella Cristina Andrade January 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:24:52Z (GMT). No. of bitstreams: 3
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Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A dengue é uma doença viral transmitida de mosquitos para humanos sendo a arbovirose mais prevalente em países tropicais e subtropicais, atingindo milhões de pessoas em diferentes regiões do mundo. A dengue é
causada pelo Dengue vírus (DENV), membro da família Flaviviridae, que possuem 4 sorotipos geneticamente distintos conhecidos como DENV 1-4.
Uma vacina eficiente necessita de gerar resposta imune tetravalente balanceada. Para alcançarmos essa imunidade tetravalente balanceada,trabalhamos com a hipótese de que proteínas quimérica s expressando
epítopos imunogênicos dos quatro sorotipos do DENV possam ser utilizadas no desenvolvimento de uma vacina segura e/ou um sistema de diagnóstico eficiente. Para este estudo onze proteínas quiméricas foram desenhadas
contendo regiões de proteínas com potencial imunogênico derivado do envelope, capsídeo, membrana e/ou da proteína não estrutural NS1, dos quatro sorotipos do DENV. Tais regiões foram selecionadas in silico utilizando-
se o algoritmo BepiPred. Regiões com alta homologia entre os quatro sorotipos do DENV foram preferencialmente incluídas, mas regiões antigênicas de um ou mais sorotipos do DENV também foram utilizados. As proteínas quiméricas foram construídas pela adição de resíduos de aminoácidos entre as sequências selecionadas, chamados de espaçadores, para que a estrutura dos epítopos expressos fosse mantida. A sequência final de aminoácidos foi traduzida e a sequência de nucleotídeos foi otimizada utilizando o algoritmo LETO 1.0
(Entelechon). Todas as onze proteínas quiméricas foram produzidas utilizando os vetores de expressão pET 28 TEV, pQE-9 ou pET-21ª, transformados em E. coli BL21 ou M15 e foram purificadas por cromatografia de
afinidade utilizando resina de níquel para realização de ensaios de Western blot e ELISA para testar a reatividade das proteínas com soros de indivíduos já infectados pelo DENV e indivíduos nunca infectados e testes de imunogenicidade através da imunização de camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6.
Nossos resultados mostraram um reconhecimento específico de cinco proteínas quiméricas com soros de pacientes sabidamente infectados pelo DENV-1, DENV-2 ou DENV-3. Além disso, a imunização de camundongos com a proteína quimérica EnvEpII, mostrou que esta proteína foi capaz de estimular uma produção robusta de anticorpos IgG1, IgG2a e IgG2c nas duas linhagens de camundongos testadas e de anticorpos neutralizantes
em C57BL/6. Além disso, foi observada a ativação de células T CD4+ e CD8+ em BALB/c e o aumento dos níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-17 e IFNγ, quando camundongos foram imunizados com a proteína EnvEpII.
Nossos resultados demonstram que desenhar, sintetizar, expressar e purificar proteínas quiméricas em sistemas bacterianos é viável e, dessa forma, proteínas artificiais podem ser estudadas como candidatas para o desenvolvimento de vacinas e/ou sistemas de diagnóstico contra doenças infecciosas / Dengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and the most prevalent arbovirus in tropical and subtropical countries, infecting thousands individuals annually in different regions of the world. Dengue is caused by Dengue virus (DENV), members of the Flaviviridae familyand is composed by 4 genetically distinct serotypes referred to as DENV 1–4. A safe vaccine demands a balanced tetravalent immune response. To address the balanced immune response, we hypothesized that chimeric proteins with potential immunogenic epitopes from the four DENV serotypes can be used to develop a safe dengue vaccine and/or an efficient diagnostic system. We designed eleven chimeras, for this the most potentially immunogenic regions of proteins derived from envelope, capsid, membrane and/or non-structural protein 1, NS1, from all DENV serotypes were in silico selected using the BepiPred algorithm. High homology regions among the four DENV serotypes were preferentially included, but antigenic regions from single or pairs of DENV serotypes were also used. The chimeras were constructed by adding non immunogenic amino acid residues between the selected sequences, named spacers residues, thus the expressed epitopes structure was maintained. The final chimeric amino acid sequence was back translated and the nucleotide sequence was optimized using the LETO 1.0 algorithm (Entelechon). All the eleven chimeric proteins were produced using the expression vectors pET 28 TEV, pQE-9 and pET-21a, transformed in E. coli BL21 or M15, and purified by Nickel-affinity chromatography to perform the Western blot and ELISA assays to test their reactivity with sera of DENV-infected patients and DENV-negative sera and to test their immunogenicity through the immunization of mice strains BALB/c and C57BL/6. Our results showed a specific recognition of five proteins by sera DENV-1, DENV-2 or DENV-3 infected patients. Moreover, the immunization using the chimera EnvEpII, shows that this protein are able to stimulate a robust production of antibodies IgG1, IgG2a and IgG2c in both mice strains tested and neutralizing antibodies were produced in C57BL/6. We also noted the activation of T cells CD4+ and CD8 + in BALB/c and the production of IL-2, IL-4, IL-17 and IFNγ when we immunized the mice with EnvEpII. Our results indicating that design, synthesize, express and purify artificial proteins in bacterial systems is viable and, thus, these proteins can be studied as candidates for the development of vaccines and/or diagnostic systems against infectious diseases.
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Desenvolvimento e validação de insumos para diagnóstico de infecções pelo vírus da dengue / Production and validation of diagnostic inputs for dengue virus infectionsMelo, Klécia Marília Soares de January 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é uma doença causada por um flavivírus, representado por quatro sorotipos distintos (DENV1-4). Entre as proteínas virais, ENV e NS1 contribuem fortemente com o processo de resposta imune desencadeado pelo vírus. Os principais sistemas de diagnóstico utilizam a detecção de anticorpos através da técnica Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA, a qual, embora útil, apresenta inúmeras limitações (custo, tempo de processamento, entre outros). Neste trabalho, nós desenvolvemos ensaios multiplex de microarranjos líquidos para ENV e NS1. Sequências de aminoácidos codificantes das proteínas, provenientes de cepas isoladas da América Latina foram selecionadas em bancos de dados públicos, alinhadas para a geração das respectivas sequências consenso e construção dos antígenos recombinantes. As sequências obtidas foram otimizadas para expressão bacteriana, submetidas à síntese comercial e clonadas em vetores de expressão procarióticos. Os antígenos foram expressos e validados através de ensaios de microarranjos líquidos, com obtenção de promissores resultados, especialmente para as proteínas ENV (domínios I/II) sorotipo 1 e 2, com potencial aplicação comercial. Este trabalho desenvolveu ainda metodologia para renaturação de NS1 com excelente rendimento. Os resultados das proteínas produzidas neste trabalho foram de forma geral superiores aos obtidos por antígenos comercialmente disponíveis para a proteína ENV de dengue vírus, utilizando a mesma metodologia. As proteínas NS1 foram ainda utilizadas para imunização de coelhos e produção de anticorpos policlonais, que se mostraram bem sucedidos para aplicações em ensaios de imunofluorescência, western blot, citometria de fluxo e como anticorpo de detecção para ensaios quantitativos para a proteína NS1 por ELISA de captura. Os resultados obtidos neste projeto foram considerados extremamente promissores, com potencial aproveitamento no desenvolvimento de testes diagnósticos comerciais com alta precisão, rápidos e com baixo custo
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Análise da competência vetorial para o vírus dengue em populações naturais de Aedes aegypti e Aedes albopictus de Pernambuco / Analysis of vector competence for dengue viruses of Aedes aegypti and Aedes albopictus natural populations from PernambucoGuedes, Duschinka Ribeiro Duarte January 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012 / Os mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus são considerados os principais vetores da dengue, doença que afeta mais de 100 países e atinge, a cada ano, mais de 50 milhões de pessoas. Para que uma espécie seja incriminada como vetor de uma doença, ela deve ser capaz de se infectar com um determinado patógeno via oral, resistir à replicação deste no seu interior e transmiti-lo a um hospedeiro susceptível. Esta habilidade é denominada competência vetorial. Os rápidos avanços da biologia molecular têm facilitado o surgimento de novas abordagens que podem ser utilizadas para avaliar quantitativamente alguns aspectos da competência vetorial. Neste sentido, a RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) tem sido amplamente usada em estudos sobre a interação vírus-vetor. O presente estudo visou avaliar o processo de infecção do vírus Dengue (DENV) em amostras de intestinos e glândulas salivares Ae. aegypti e Ae. albopictus, através da quantificação de partículas virais de três sorotipos de DENV via PCR em tempo real. Os resultados mostraram que as três populações de Ae. aegypti (RecLab, Recife e Petrolina) analisadas no presente estudo foram suscetíveis à infecção com DENV-1, DENV-2 e DENV-3. De uma maneira geral, as populações de Ae. aegypti de campo (Recife e Petrolina) foram mais competentes para a infecção do que a colônia de laboratório (RecLab). Considerando a espécie Ae. albopictus, as duas populações (laboratório e campo) também foram suscetíveis à infecção com os três sorotipos, porém a colônia de laboratório foi mais suscetível à infecção do que a população de campo. Os dados obtidos no presente estudo indicam que diferenças na carga viral usada durante a alimentação artificial podem influenciar nas taxas de infecção do vírus no intestino, porém não influenciam a disseminação dos vírus para as glândulas salivares. Outro aspecto importante foi o curto período de incubação extrínseco (PIE) apresentado pelas duas espécies, exceto na população de Ae.aegypti de Petrolina, diferente do que é descrito na literatura. Este resultado tem uma grande importância epidemiológica, pois quanto menor o PIE, maior será o tempo que a espécie vai ser capaz de transmitir o vírus para um hospedeiro sadio, aumentando assim as chances de transmissão de dengue. Além disso, revela a necessidade da implementação de estratégias mais rápidas para bloquear a transmissão da doença. Estas informações serão necessárias para os estudos de avaliação de risco de transmissão da dengue
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Transferência placentária e cinética de anticorpos antidengue materno transferidos em uma coorte de crianças no primeiro ano de vida / Placental transfer and kineticis of maternal transferred dengue-specific antibodies in a cohort of children during the first year.Castanha, Priscila Mayrelle da Silva January 2016 (has links)
Submitted by Stephany Silva (stephany.silva@cpqam.fiocruz.br) on 2016-09-23T14:03:16Z
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Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Anticorpos antidengue materno transferidos têm sido implicados na imunopatogênese da dengue grave em lactentes. Postula-se que esses anticorpos possuam um papel distinto durante os primeiros anos de vida: ao nascimento, anticorpos antidengue materno adquiridos conferem proteção, e em seguida declinam a níveis subneutralizantes capazes de facilitar a infecção pelo vírus dengue (DENV) mediante o mecanismo de ADE (Antibody dependent enhancement), aumentando o risco de ocorrência das formas graves da dengue. Estudos prospectivos conduzidos em lactentes Asiáticos têm mostrado que o pico de anticorpos materno adquiridos com a capacidade de mediar aumento da infecção pelo DENV ocorre entre o sexto e o nono mês de vida, o que correlaciona com a epidemiologia da dengue grave em lactentes dessa região. Esta tese descreve o perfil de imunidade materna antidengue e a transferência placentária de anticorpos dengue-específicos em pares mãe-cordão recrutados em um estudo de coorte prospectivo conduzido na cidade do Recife, Nordeste do Brasil. Adicionalmente, esse trabalho analisa o papel dos níveis de IgG total maternos e da imunidade antidengue materna na transferência de anticorpos ao feto. Na coorte de lactentes, a tese avalia a cinética de declínio dos anticorpos antidengue materno-transferidos e sua capacidade de mediar ADE durante os primeiros anos de vida. Níveis de IgG DENV-especifico e de anticorpos neutralizantes sorotipo específicos (DENV1-4) foram determinados em 376 pares mãe-cordão. A cinética de anticorpos materno transferidos neutralizantes e/ou mediadores de ADE foi investigada em uma subamostra das crianças inseridas na coorte. A maior parte das gestantes apresentava imunidade ao sorotipo DENV-3 (53,7 por cento) ou a combinação DENV-3/ DENV-4 (30,6 por cento). Níveis de IgG DENV-específico e de anticorpos neutralizantes para os sorotipos DENV-3 e DENV-4 foram significativamente maiores nas amostras do cordão umbilical do que nas respectivas amostras maternas. Mães imunes a apenas um sorotipo do vírus transferiram maiores níveis de IgG DENV-especifico (p=0,02) e de anticorpos neutralizantes para o DENV-3 (p=0,04) quando comparado a mães imunes a múltiplos sorotipos do DENV. Níveis de anticorpos materno transferidos para o DENV-3 foram indetectáveis em 90 por cento das crianças aos 4 meses de idade. O pico de atividade ADE foi detectado no segundo mês de vida (p0,0001) e rapidamente declinou no quarto mês de vida (p=0,0035). Diferente do observado em lactentes asiáticas, o pico de atividade ADE mediado pelos anticorpos maternos transferidos ocorreu mais nos lactentes Brasileiros. Esses resultados possuem importantes implicações para a imunopatogênese da dengue durante a infância e para o estabelecimento de futuros esquemas vacinais antidengue nos primeiros anos de vida (AU)
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