Global und insbesondere in Indien ist in den letzten Jahren eine steigende Inzidenz chronischer und therapierefraktärer Dermatomykosen beobachtet worden. Zunehmend wird dies als Epidemie und Bedrohung der öffentlichen Gesundheit wahrgenommen. In vitro-Resistenz der Erreger wird als eine mögliche Ursache diskutiert. Bisherige Studien zeigten eine Assoziation von Mutationen im Squalenepoxidase (SQLE)-Gen der Dermatophyten mit In vitro-Resistenz gegenüber Terbinafin und Therapieversagen. Die Prävalenz dieses Phänomens ist jedoch unklar. Im Rahmen einer Multicenter-Studie identifizierten wir mittels konventioneller und molekularbiologischer Methoden Hautschuppen von 402 indischen Patienten unter dem Verdacht einer Dermatomykose. Zudem führten wir Resistenztestungen und SQLE-Sequenzierungen durch. In 83% der Schuppen wiesen wir Trichophyton (T.) indotineae und in 5% T. rubrum nach. 279 Isolate wurden Resistenztestungen und Sequenzierungen des SQLE-Gens zugeführt. Hiervon zeigten sich 72% in vitro-resistent gegenüber Terbinafin. All diese wiesen charakteristische Mutationen im SQLE-Gen auf, welche wiederum in Enzymsubstitutionen wie Phe397Leu resultierten. In Terbinafin-sensiblen Isolaten wurde ausnahmslos ein SQLE-Wildtyp oder die Substitution Ala448Thr nachgewiesen. Diese Zusammenhänge könnten den Einsatz von SQLE-Genotypen als Biomarker für einen Therapieerfolg mit Terbinafin ermöglichen. Wir untersuchten zudem die Empfindlichkeit der Isolate gegenüber Itraconazol und Voriconazol. Aufgrund bisher geringer Evidenz für MHK-Grenzwerte dieser Substanzen ließ sich keine Resistenzrate ermitteln, jedoch war ein Trend zur Kreuzresistenz zwischen beiden Triazolen festzustellen. Zudem war die SQLE-Substitution Ala448Thr mit geringerer Empfindlichkeit gegenüber Itraconazol und Voriconazol assoziiert. Dieser Zusammenhang sowie der Einfluss von SLQE-Genotypen auf In vitro-Resistenz insgesamt bedarf weiterer eingehender Untersuchungen, um mögliche resistente Erreger im Rahmen chronischer Dermatophytosen früh zu erkennen.:Inhaltsverzeichnis 1 Einführung ........................................................................................................................................ 1 1.1 Bedeutung von Dermatophytosen weltweit und in Indien .......................................................... 1 1.2 Nomenklatorische Herausforderungen in der Erregerdifferenzierung ......................................... 2 1.3 Pharmakotherapie der Tinea im Wandel ...................................................................................... 4 1.4 Mögliche Gründe des Therapieversagens .................................................................................... 5 1.4.1 Rolle topischer Glukokortikoide ................................................................................................ 5 1.4.2 Entwicklungen der In-vitro-Empfindlichkeit von Dermatophyten in Indien .............................. 6 1.4.2.1 Terbinafin .................................................................................................................................. 6 1.4.2.2 Azole ......................................................................................................................................... 7 1.5 Resistenztestung von Dermatophyten ......................................................................................... 8 1.5.1 Bedeutung und Interpretation .................................................................................................. 8 1.5.2 Methoden der Resistenztestung .............................................................................................. 9 1.5.2.1 Mikrodilution ............................................................................................................................. 9 1.5.2.2 Agardilution ............................................................................................................................... 9 1.5.2.3 Molekularbiologische Verfahren ............................................................................................. 10 1.6 Wirk- und Resistenzmechanismen untersuchter Pharmaka ...................................................... 10 1.6.1 Terbinafin ................................................................................................................................ 10 1.6.2 Azole ....................................................................................................................................... 12 1.7 Zielstellungen ............................................................................................................................. 13 2 Originalarbeit .................................................................................................................................. 14 3 Zusammenfassung der Arbeit ........................................................................................................ 27 4 Literaturverzeichnis ........................................................................................................................ 31 5 Darstellung des eigenen Beitrags zur Publikation .......................................................................... 43 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ................................................................ 63 7 Lebenslauf ...................................................................................................................................... 64 8 Publikationen .................................................................................................................................. 65 9 Danksagung .................................................................................................................................... 66 / Recently, a rising incidence of chronic and difficult-to-treat dermatophytoses has been observed globally. Particularly in India, this is seen as a threat to public health. In vitro resistance of the pathogens – dermatophytes – against antifungal agents may be a possible explanation. Recent studies show an association between mutations in the squalene epoxidase gene (SQLE) of the dermatophytes and in vitro resistance to terbinafine, resulting in therapeutic failure. The prevalence of this phenomenon, however, is unknown. We performed a multicenter study with skin samples of 402 patients from India with the clinical diagnosis of dermatophytosis and identified the causing pathogens using conventional and biomolecular methods. Furthermore, we performed antifungal susceptibility testing und sequencing of the SQLE gene. In 83% of samples, Trichophyton (T.) indotineae and in 5%, T. rubrum was isolated. 279 samples were further subjected susceptibility testing and sequencing of the SQLE gene. Of these, 72% were in vitro resistant to terbinafine. All of those isolates showed mutations in the SQLE gene resulting in specific substitutions of the enzyme such as Phe397Leu. Dermatophytes which were classified as sensitive to terbinafine all incorporated a SQLE wild type or substitution Ala448Thr. These associations could justify the use of SQLE genotypes as biological markers of therapeutic resistance to terbinafine. We also performed antifungal susceptibility testing for itraconazole and voriconazole. Due to lacking evidence for MIC breakpoints for these substances, we did not deduce rates of resistance. However, we did note a tendency of cross resistance between these triazole agents. Furthermore, SQLE substitution Ala448Thr was associated with reduced susceptibility against itraconazole and voriconazole. In conclusion, these connections as well as the general impact of SQLE genotypes on antifungal susceptibility require further research in order to quickly identify resistant pathogens maintaining the ongoing epidemic of chronic dermatophytoses in India.:Inhaltsverzeichnis 1 Einführung ........................................................................................................................................ 1 1.1 Bedeutung von Dermatophytosen weltweit und in Indien .......................................................... 1 1.2 Nomenklatorische Herausforderungen in der Erregerdifferenzierung ......................................... 2 1.3 Pharmakotherapie der Tinea im Wandel ...................................................................................... 4 1.4 Mögliche Gründe des Therapieversagens .................................................................................... 5 1.4.1 Rolle topischer Glukokortikoide ................................................................................................ 5 1.4.2 Entwicklungen der In-vitro-Empfindlichkeit von Dermatophyten in Indien .............................. 6 1.4.2.1 Terbinafin .................................................................................................................................. 6 1.4.2.2 Azole ......................................................................................................................................... 7 1.5 Resistenztestung von Dermatophyten ......................................................................................... 8 1.5.1 Bedeutung und Interpretation .................................................................................................. 8 1.5.2 Methoden der Resistenztestung .............................................................................................. 9 1.5.2.1 Mikrodilution ............................................................................................................................. 9 1.5.2.2 Agardilution ............................................................................................................................... 9 1.5.2.3 Molekularbiologische Verfahren ............................................................................................. 10 1.6 Wirk- und Resistenzmechanismen untersuchter Pharmaka ...................................................... 10 1.6.1 Terbinafin ................................................................................................................................ 10 1.6.2 Azole ....................................................................................................................................... 12 1.7 Zielstellungen ............................................................................................................................. 13 2 Originalarbeit .................................................................................................................................. 14 3 Zusammenfassung der Arbeit ........................................................................................................ 27 4 Literaturverzeichnis ........................................................................................................................ 31 5 Darstellung des eigenen Beitrags zur Publikation .......................................................................... 43 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ................................................................ 63 7 Lebenslauf ...................................................................................................................................... 64 8 Publikationen .................................................................................................................................. 65 9 Danksagung .................................................................................................................................... 66

Dermatophyten sind keratinophile Pilze, d.h. sie besiedeln und infizieren die Haut und ihre Anhangsgebilde (Haare, Nägel) bei Mensch und Tier. Die derzeit häufigsten durch Dermatophyten hervorgerufenen Infektionen sind die Onychomykose, Tinea pedis, Tinea capitis und Tinea corporis. Da Antimykotika nicht bei alle Erregern von Dermatophytosen gleich wirksam sind, sollte im Vordergrund einer Behandlung zunächst die korrekte Erregerdifferenzierung stehen. Konventionell erfolgt diese Differenzierung über morphologische Merkmale wie Form und Farbe der auf dem Nährmedium gewachsenen Pilzkolonie, charakteristische mikromorphologische Elemente (Konidien) und biochemische Eigenschaften. Diese Merkmale werden jedoch oftmals nicht exprimiert. Damit ist in diesen Fällen keine Speziesdiagnose möglich. Eine zuverlässige Diagnostik sollte zudem das natürliche Klassifizierungssystem direkt reflektieren. Die Studien zur molekularen Biodiversität innerhalb der Dermatophyten sollten deshalb zur Klärung evolutionärer, taxonomischer und populationsgenetischer Zusammenhänge bei den verschiedenen Spezies der Gattungen Arthroderma, Trichophyton, Microsporum und Epidermophyten beitragen und helfen, geeignete DNA-Marker für die Anwendung in der medizinischen Diagnostik zu finden und einzusetzen. Dazu wurden verschiedene Methoden und Zielsequenzen genutzt, wie die Sequezierung der internal transcribed spacer (ITS) Region der ribosomalen DNA, das PCR-Fingerprinting, single strand conformation polymorphism (SSCP) und amplified fragment length polymorphism (AFLP)-Analyse. Es wurden weit über 200 Stämme, die bisher ca. 100 verschiedenen Taxa zuzuordnen waren, analysiert. Die molekularen Studien zeigen, dass die phylogenetisch ältesten Dermatophytenspezies geophil sind und sich die wärmeliebenden, zoophilen Arten erst später durch Koevolution mit warmblütigen Tieren entwickelt haben. Die anthropophilen scheinen dagegen erst mit Entstehung des Menschen evolviert und demzufolge am jüngsten zu sein. Damit kann man ihre geringe Biodiversität und ihr verändertes pathogenetisches Verhalten erklären. Es konnte gezeigt werden, dass die molekularen Phylogenie der Spezies besser mit ihrer Ökologie und dem Krankheitsbild als mit morphologischen Eigenschaften übereinstimmt und dass etliche Dermatophytenspezies überklassifiziert sind. Aus diesem Grunde wurde eine neue Systematik vorgeschlagen. Für den Nachweis des häufigsten Erreger, Trichophyton rubrum wurde eine Gensonde entwickelt, die in der medizinischen Diagnostik einsetzbar ist. / Dermatophytes are keratinophilic fungi which colonise and infect skin, hair and nails of man and animals. The most common infections caused by dermatophytes are onychomycosis, tinea pedis, tinea capitis and tinea corporis. Antimycotics may have different spectra of activity even in related dermatophyte species. Therefore a correct species identification is necessary before onset of antifungal therapy. Conventionally, the identification of dermatophytes is performed by the use of morphological features, such as shape and colour of the colony, micromorphological characteristics (conidia) and biochemical properties. However, these characters may not be expressed and then identification down to the species level is frequently impossible. Reliable diagnostics directly reflects the natural system. Studies of biodiversity in dermatophytes should therefore focus on elucidation of the connection of evolution, taxonomy and population genetics of the species of the genera Arthroderma, Trichophyton, Microsporum and Epidermophyten and thus contribute to development of stable DNA markers to be applied in routine diagnostics. Several methods and targets were applied such as sequencing of the internal transcribed spacer region (ITS) of the ribosomal DNA, PCR fingerprinting, single strand conformation polymor phism (SSCP) and amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis. More than 200 strains belonging to about 100 dermatophyte taxa were analysed. Phylogenetically, the molecular data show the oldest dermatophyte species to be geophilic and subsequently co-evolved as zoophilic dermatophytes with warm blooded animals. In contrast, the anthropophilic dermatophytes are much younger as they evolved in association with humans. This hypothesis is supported by their low biodiversity and changing pathogenicity. The molecular data show correspondence between phylogeny of species and their ecology and clinical picture, rather than with morphological features. Many dermatophyte species were shown to be overclassified. A new systematic system was proposed. For the identification of Trichophyton rubrum, the most common dermatophyte species, an oligonucleotide probe was developed which is applicable in medical routine diagnostics.

Die Onychomykose ist eine sehr häufige Erkrankung, deren Auftreten weltweit zunimmt und mit einer Pilzinfektion der Nägel einhergeht. Die Ineffizienz der verabreichte Antimykotika motiviert Bemühungen, nach alternativen Behandlungsmethoden zu suchen. Diese Dissertation untersucht die Auswirkungen der photodynamischen Inaktivierung (PDI) auf Dermatophyten und Schimmelpilze. Als Modellorganismen werden drei der Onychomykose auslösenden Pathogene untersucht: Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale und der Schimmelpilz Scopulariopsis brevicaulis. Um das Potenzial der PDI gegen Onychomykose verursachende Pathogene, abzuschätzen, wurden Phototoxizitätstests mit drei Photosensibilisatoren (PS) durchgeführt: 5,10,15,20-Tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl) porphyrintetra(p-toluenesulfonate) (TMPyP) und and 5,10,15-tris-(1-methylpyridinium-2-yl) corrolato-(trans-dihydroxo) phosphorus(V) (PCor+) sowie 4',5',7'-tetrabromo-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene] -1-one (Eosin G). Neben den Phototoxizitätstests wurden zeitaufgelöste Singulettsauerstoff-Lumineszenz Scans aufgenommen, die zur Verifizierung der PDI Effizienz genutzt wurden. Alle drei PS zeigen in vitro eine hohe phototoxische Wirkung. Diese konnte mit Singulettsauerstoff-Lumineszenzmessungen korreliert werden, bei denen ein hohes Singulettsauerstoff-Lumineszenzsignal erfasst wurde. An infizierten menschlichen Nägeln konnten die PS keinen phototoxischen Effekt induzieren. Singulettsauerstoff-Scans, die für einen Einblick in die zugrundeliegenden Ursachen durchgeführt wurden, zeigten fast kein Singulettsauerstoff-Lumineszenzsignal an menschlichen Nägeln. Könnten die verschiedenen bekannten Herausforderungen im Zusammenhang mit PDI an infizierten menschlichen Nägeln bewältigt werden, hätte die PDI das Potenzial, eine schnellwirkende Behandlung dieser Pilzinfektion im Zehennagel zu werden. Diese Studie zeigt erstmals den Zusammenhang zwischen der PDI-Behandlung von Onychomykose und Singulettsauerstoff. / Onychomycosis is a very common illness that befalls an increasing number of individuals worldwide and involves a fungal infection of the nails. The inefficiency of current treatments justifies the efforts to look for alternative treatment modalities. This dissertation investigates the impact of photodynamic inactivation (PDI) against dermatophytes and molds. Three of the causing pathogens of onychomycosis are under investigation: Trichophyton rubrum (T. rubrum), Trichophyton interdigitale (T. interdigitale) and the mold Scopulariopsis brevicaulis (S. brevicaulis). To assess the potential of PDI against onychomycosis causing pathogens, phototoxicity tests were performed using three photosensitizers (PSs): the cationic 5,10,15,20-Tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl) porphyrintetra(p-toluenesulfonate) (TMPyP) and 5,10,15-tris-(1-methylpyridinium-2-yl) corrolato-(trans-dihydroxo) phosphorus(V) (PCor+) as well as the anionic 4',5',7'-tetrabromo-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one (Eosin Y). Alongside the phototoxicity tests, time resolved singlet oxygen luminescence scans were conducted to serve as a control method of PDI. All three PSs proved to have a high phototoxic effect against the three fungi species in vitro. Those could be correlated with singlet oxygen measurements, where a high singlet oxygen luminescence signal was acquired. Contrary to the expectations from the in vitro experiments were the results obtained ex vivo: On infected human nails, the PSs were not able to induce a phototoxic effect. Singlet oxygen scans conducted to get insight into the reasons behind these results showed nearly no singlet oxygen luminescence signal on human nails. Addressing the various known challenges associated with PDI on infected human nails PDI would have a great impact within short time on treating the toenail fungal infection. This study, for the first time, shows the correlation between PDI treatment of onychomycosis and singlet oxygen.