La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune orpheline. Elle est caractérisée par une atteinte microvasculaire et une fibrose touchant la peau et les organes internes. La ScS est une maladie sévère avec une surmortalité significative. Jusqu’à présent, aucun essai thérapeutique n’a permis de démontrer qu’un produit ait une action anti-fibrosante et améliore significativement le pronostic de cette maladie. La physiopathologie de la ScS fait intervenir une combinaison de facteurs environnementaux et de facteurs de susceptibilité génétique. Récemment TNFSF4 a été identifié comme facteur de susceptibilité génétique à la ScS. TNFSF4 code pour OX40 ligand (OX40 L). Le couple OX40-OX40L est impliqué dans la co-stimulation tardive des lymphocytes T, mais aussi dans la genèse et la réactivation de lymphocytes T mémoires et dans la prolifération et différenciation des lymphocytes B. Bloquer OX40L s’est avéré prometteur dans des modèles précliniques d’encéphalomyélite auto-immune, de polyarthrite rhumatoïde, de colite inflammatoire, de réaction du greffon contre l’hôte et d’asthme. Par ailleurs, ce blocage permettrait d’inhiber uniquement les lymphocytes T pathogènes récemment activés et d’éviter ainsi une immunosuppression globale, contrairement aux biothérapies actuellement disponibles en rhumatologie. L’observation d’une surexpression de la protéine OX40L dans le derme des patients ScS nous a incités à étudier le rôle d’OX40L dans la ScS. L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier l’efficacité d’une thérapie ciblée anti-OX40L dans la ScS, par l’utilisation de modèles murins complémentaires de la maladie. Nous avons tout d’abord cherché à optimiser le modèle de fibrose induite par la bléomycine, qui est un modèle bien validé, utilisé en général en première intention pour évaluer des anti-fibrosants potentiels, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles inflammatoires. Nous avons également étudié si l’échographie à haute fréquence pouvait apporter une aide à l’évaluation cutanée chez ces animaux, mais nos résultats n’ont pas permis de démontrer une place spécifique à cet outil dans ce contexte. Les approches anti-OX40L ont débuté par l’utilisation de souris KO qui ont montré des résultats prometteurs dans le modèle induit par la bléomycine. Ensuite, des approches pharmacologiques ont été développées en utilisant un anticorps monoclonal neutralisant anti-OX40L dans le modèle de fibrose dermique induite par la bléomycine. L’intérêt du blocage d’OX40L a été conforté par la démonstration de propriétés non seulement de prévention mais aussi curatives contre la fibrose établie. L’étude des voies modulées par OX40L a mis en avant l’infiltrat inflammatoire et le relargage de cytokines pro-fibrotiques (IL-6 et TNF-α). De plus, le blocage d’OX40L semblait prévenir la fibrose dermique en inhibant l’activation des fibroblastes dépendant de la voie de signalisation AP-1. Le rôle d’OX40L dans la phase inflammatoire du remodelage matriciel a été abordé par l’utilisation du modèle de cicatrisation cutanée. En revanche, le blocage d’OX40L n’a pas eu d’effet dans le modèle de fibrose non-inflammatoire qui caractérise les souris Tsk-1. Etant donné le rôle clé en clinique de l’atteinte d’organe, notre approche a été enrichie par l’utilisation de souris transgéniques Fra2, qui sont un nouveau modèle de ScS caractérisé par une fibrose pulmonaire inflammatoire et une HTAP. L’effet de l’anticorps anti-OX40L a été remarquable dans ce contexte avec au scanner et à l’histologie une réduction significative de la fibrose pulmonaire, du remodelage vasculaire et des signes d’HTAP. Enfin, l’étude longitudinale des sérums collectés dans notre cohorte de patients a montré que la forme soluble d’OX40L pourrait être un potentiel biomarqueur dans la ScS pour identifier les patients à risque de progression sévère. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune orphan disease which is characterized by alterations of the microvasculature and fibrosis affecting the skin and internal organs. SSc is the most severe connective tissue disease associated with a high risk of mortality. Until now, there is no effective treatment to counteract the fibrotic process and to improve the prognosis of this disease. SSc results from the combination of genetic and environmental factors. TNFSF4 was recently identified as a genetic risk factor for SSc. TNFSF4 encodes OX40L, which is involved in late T-cell co-stimulatory signals, but also in generation and reactivation of memory T cells and promotion of plasma cell phenotype. OX40L blockade was effective in reducing clinical symptoms in several animal models of autoimmune and inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis, colitis, asthma or graft-versus-host-disease. The anti-OX40L antibody presents the advantage of a targeted therapy against pathogenic recently activated T cells, which might not expose patients to increased risk of infections, unlike other conventional immunosuppressants. Following the observation of an increased expression of OX40L in fibrotic skin in SSc-patients, we aimed to investigate the contribution of OX40L in SSc and to assess the efficacy of a targeted therapy against OX40L in SSc, using complementary experimental mouse models. First, we characterized the optimum in vivo parameters required for the successful induction of dermal fibrosis in the widely used bleomycin-induced dermal fibrosis mouse model, which is usually the first step in most of pharmacological studies assessing anti-fibrotic therapies. We also aimed to determine whether ultrasonography could be used to assess skin fibrosis in this model, but our results showed that it was not efficient enough to assess dermal thickening in this model. Invalidation of OX40L prevented dermal fibrosis in the bleomycin mouse model. Then pharmacologic approaches, using a monoclonal anti-OX40L antibody, demonstrate that blockade of OX40L not only prevented dermal fibrosis, but also induced regression of established fibrosis in this model. We also showed that OX40L acts directly on both dermal fibroblasts and inflammatory cells and on cytokine release (IL-6, TNF-α), by regulating NF kappa B and AP 1 pathways. We observed that OX40L inhibition interfered with early inflammatory stages of matrix remodeling using the excisional wound healing mouse model. Conversely, blocking OX40L did not display antifibrotic properties in the non-inflammatory Tsk-1 mouse model. Given that interstitial lung involvement and pulmonary arterial hypertension (PAH) are key prognostic factors in SSc, we aimed to assess the effects of OX40L pharmacological inhibition in a new murine model: the fra-2 transgenic mice, which are characterized by both fibrosing alveolitis and PAH. In this model, using both CT-scan and histology, we demonstrated that mice treated by anti-OX40L antibody were markedly protected from fibrosing alveolitis and vessel remodeling leading to PAH. Furthermore, longitudinal analyses of our cohort of SSc-patients showed that soluble OX40L is a promising serum biomarker to predict the worsening of lung and skin fibrosis. Altogether, our results show that OX40L is as an attractive target in inflammation-driven fibrosis. This work also strengthens the relation between inflammation and fibrosis in SSc-pathogenesis. This work underlines advantages of combination of several animal models in translational approach to SSc.

Les phéochromocytomes et les paragangliomes (PCC/PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares qui se développent aux dépens de la médullosurrénale et des paraganglions sympathiques et parasympathiques. Près de 40% des patients ont une prédisposition génétique, et, à ce jour 13 gènes de prédisposition ont été identifiés. Les mutations du gène SDHB sont un facteur de risque de malignité et de mauvais pronostic qui conduisent à une perte de fonction de la succinate déshydrogénase (SDH), enzyme du complexe mitochondrial II. Il en résulte une accumulation intracellulaire de succinate responsable du phénomène dit de « pseudohypoxie » qui stimule la production de VEGF et donc l’angiogenèse, ainsi que l’expression du transporteur membranaire du glucose GLUT-1. Le surrisque de malignité liée à SDHB et l’absence de traitement curatif des formes métastatiques de PCC/PGL justifient l’élaboration d’un modèle murin permettant de mettre en place des essais précliniques. L’obtention d’un modèle murin prédisposé au PCC/PGL par mutation du gène Sdhb s’étant révélée infructueuse, notre équipe a finalement généré des cellules chromaffines Sdhb-/- immortalisées (imCC Sdhb-/-) dont l’implantation dans le coussinet adipeux sous-cutané (Fat-pad) de souris nudes NMRI a permis l’établissement du premier modèle de tumeurs porteuses d’une inactivation complète du gène Sdhb. La caractérisation phénotypique du modèle a été réalisée par imagerie multimodalité in vivo, comparativement à un groupe contrôle de souris ayant reçu des imCC non mutées (WT). L’angiogenèse tumorale évaluée par imagerie optique retrouve une expression des intégrines αvβ3 plus marquée dans le groupe Sdhb-/- avec une rétention du traceur prolongée 12 h après injection. L’IRM dynamique de contraste (IRM-DCE), montre un rehaussement tumoral global nettement plus important dans le modèle Sdhb-/-, que le post-traitement par le logiciel PhysioD3D permet d’attribuer à une augmentation du volume capillaire intratumoral. Sur le plan métabolique, la consommation globale de glucose mesurée par TEP au 18FDG est également plus marquée dans les tumeurs Sdhb-/-. Enfin, la spectroscopie par résonance magnétique (1H-MRS) a mis en évidence une accumulation de succinate dans les tumeurs Sdhb-/-, non retrouvée dans les tumeurs WT. Ce résultat a été confirmé par spectrométrie de masse et cette technique innovante de détection du succinate in vivo a été transférée avec succès en clinique pour l’exploration des patients porteurs de PCC/PGL. En conclusion, l’imagerie in vivo a permis de distinguer le phénotype des tumeurs Sdhb-/- de celui des WT, avec une néoangiogenèse, une microcirculation et un métabolisme glucidique augmentés. Ces résultats permettent de proposer des études précliniques de réponse précoce aux traitements. La détection de l’accumulation de succinate par 1H-MRS ouvre la possibilité d’un diagnostic « métabolique » préopératoire pour détecter les patients de mauvais pronostic. / Pheochromocytomas and paragangliomas (PCC/PGL) are rare neuroendocrine tumours that arise from chromaffin cells of the adrenal medulla, sympathetic and parasympathetic paraganglia respectively. Around 15% of PCC are malignant. SDHB mutations are associated with malignancy and poor prognosis. SDH deficiency leads to succinate accumulation that induces a cellular pseudohypoxic phenotype, promoting in particular VEGF and GLUT-1 expression and increasing angiogenesis and glucose metabolism. The high malignancy hazard associated with SDHB and the absence of curative treatment of metastatic forms of the disease make it essential to develop a mouse model for preclinical trials launching. The quest for a predisposed mouse model of Sdhb-deficient tumors being unsuccessful, Sdhb-/- and wild-type (WT) immortalized mouse chromaffin cells previously generated in the laboratory were propagated in the fat pad of NMRI nude mice, thereby providing the first pattern of Sdhb- deficient tumors. These mice were compared to a control group receiving non-mutated imCC (WT) and characterization was performed in vivo by multimodality imaging. Optical imaging assessing the tumor angiogenesis with Angiostamp®, an RGD fluorescent peptide, found an increased expression of integrins αvβ3 in the Sdhb-/- group 12 h after tracer injection. Dynamic contrast enhanced MRI (DCE-MRI) showed an overall tumor enhancement significantly higher in the Sdhb-/- model secondary to an increase of the tumor blood flow (F) and of the intratumoral capillary volume fraction (Vb) (compartmental analysis using PhysioD3D software). Metabolic imaging assessed by 18FDG-PET confirmed the expected high glucose consumption by Sdhb-/- tumors. Finally, magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) detected succinate accumulation in Sdhb-/- tumors and not in WT tumors. This result was confirmed by mass spectrometry and this innovative procedure for in vivo detection of succinate was translated into patients suffering from PCC/PGL. A succinate peak was specifically observed in SDHx-related PCC/PGL patients. In conclusion, these results show strong differences between Sdhb-/- and WT allografts and suggest that preclinical therapeutic studies could be implemented in this unique model of Sdhb-deficient tumour. Our noninvasive, highly sensitive and specific method allowing in vivo detection of succinate, the major biomarker of SDHx-mutated tumors was translated into clinical imaging.

L’ostéoporose est une maladie fréquente et généralisée du squelette qui se caractérise par une perte de masse osseuse et des altérations de la structure des os. Ces variations des propriétés osseuses, observées à diverses échelles et associées à une augmentation du contenu adipeux de la moelle, témoignent d’une plus grande fragilité du squelette. Ces modifications sont cependant différentes en fonction du site. Cette variation du contenu adipeux médullaire, rapportée notamment dans les os longs du squelette appendiculaire, semble jouer un rôle crucial dans la survenue de l’ostéoporose. Néanmoins, ces altérations ostéo-médullaires, aussi bien quantitatives que qualitatives, sont controversées et peu documentées au niveau des maxillaires, la mandibule en particulier. Le but de notre étude est d’évaluer, au cours du vieillissement et dans un modèle d’ostéoporose (ratte adulte ovariectomisée), les relations entre les variations du contenu adipeux médullaire et la microarchitecture osseuse en site mandibulaire en comparaison avec un site de référence, le tibia. La microarchitecture osseuse, la quantité et la répartition du contenu adipeux médullaire après marquage au tétroxyde d’osmium ont été analysées par microtomographie à rayons X dans la mandibule dentée (os alvéolaire) et non dentée (condyle). Au cours du vieillissement, aucune altération des paramètres osseux et médullaires n’a été mise en évidence. En revanche, le déficit hormonal en oestrogènes induit par ovariectomie conduit à une perte osseuse plus marquée (+35%) dans le tibia que dans la mandibule, associée à des modifications microarchitecturales et adipeuses médullaires site-spécifiques. En effet, en comparaison avec le tibia, un faible contenu adipeux (<10% de moelle) est retrouvé dans le secteur denté (alvéolaire) ainsi que non denté (condyle). A la différence du tibia, au sein duquel un effet de « clustering » des adipocytes est observé à la surface osseuse trabéculaire, le contenu adipeux mandibulaire est réparti de manière homogène dans les espaces médullaires avec très peu de contact avec la surface osseuse trabéculaire. En conclusion, nos résultats indiquent une perte osseuse modérée dans la mandibule par rapport au tibia associée à une augmentation du contenu adipeux médullaire tardive dont la répartition au sein des espaces médullaires n’est pas modifiée à la différence du tibia. Nous émettons l’hypothèse qu’une activité de remodelage et des sollicitations biomécaniques différentes puissent expliquer les spécificités physiopathologiques observées en site mandibulaire. D’autres études seront nécessaires pour préciser l’impact de telles modifications sur la qualité osseuse à l’échelle moléculaire et élémentaire, ainsi que pour préciser les mécanismes de dialogues entre les ostéoblastes et les adipocytes. / Osteoporosis is a common disease of the skeleton characterized by a loss of bone mass and changes in bone structure. These variations in bone properties, observed at various scales and associated with an increase in the bone marrow adipose tissue (BMAT) content, indicate a greater fragility of the skeleton in a site-specific manner. This variation in the BMAT content, reported in some skeletal sites, seems to play a crucial role in the occurrence of osteoporosis. Nevertheless, these bone and marrow alterations, both quantitative and qualitative, are controversial and still poorly documented in the jaw bones, the mandible in particular.The aim of our study was to investigate, during aging and in a rodent model of osteoporosis (adult ovariectomized rat), the relationships between the changes in the bone microstructure, the marrow fat content and its distribution in the mandibular site in comparison with a reference site, the tibia. The bone microstructure, the bone marrow fat content and its distribution after osmium tetroxide staining were analyzed by a specific X-ray microfocus tomography approach in the mandible in the teeth-bearing area (alveolar bone) and in the condyle. During aging, neither bone nor bone marrow alterations have been observed. In contrast, estrogen deficiency did lead to more important bone loss (+35%) in the tibia than in the mandible associated with site-specific microstructural and BMAT modifications. Indeed, in comparison with the tibia, a low BMAT content (<10% of marrow volume) was found in the alveolar bone as well as in the condyle. Compared to tibia which reveals a clustering of the marrow adipocytes at the trabecular bone surface, the mandibular BMAT content was homogeneously distributed and located further away with almost no contact with the trabecular bone surface. In conclusion, our results indicate a moderate bone loss in the mandible compared to the tibia associated with an increase in the BMAT content whose distribution within the marrow spaces is not modified in contrast to tibia. We hypothesize that a differential bone turn-over rate, biomechanical stress may explain in part the mandibular physiopathological specificities reported. Further studies will be needed to precise the impact of such alterations on bone quality at the molecular and elemental level, as well as to depict the mechanisms of dialog between osteoblasts and adipocytes.

Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquent chez l’homme et représente la troisième cause de mortalité par cancer en France. Depuis 2004, le docetaxel est le traitement de référence du cancer de la prostate métastatique résistant à la castration (mCRPC). Cependant, malgré le bénéfice de survie obtenu, près de la moitié des patients traités développent une résistance à la chimiothérapie. L’objectif de mon projet de thèse consiste à identifier un prédicteur moléculaire permettant de sélectionner les patients qui vont répondre à la chimiothérapie par docetaxel. Par l’étude du mécanisme moléculaire associé avec le développement de la résistance, mon second objectif est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de contourner cette résistance.Dans ce but, les profils d’expression de gènes et de microARNs différentiellement exprimés dans plusieurs modèles cellulaires de cancer de prostate résistants au docetaxel ont été établis. L’intégration des données issues de ces analyses haut-débit a suggéré que la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) intervenait dans le mécanisme de résistance au docetaxel. La dissection du mécanisme d’EMT observé dans les modèles cellulaires a permis d’identifier SHISA3 comme une nouvelle protéine régulatrice de ce processus. Le gène SHISA3, alors jamais décrit chez l’Homme, est fortement sous-exprimé dans les modèles résistants au docetaxel présentant un phénotype mésenchymateux, mais également dans de multiples tumeurs humaines. L’inhibition de SHISA3 dans les modèles cellulaires sensibles induit une EMT complète, caractérisée par la perte des jonctions cellulaires, l’expression des facteurs de transcription mésenchymateux et l’augmentation des capacités migratoires. L’étude du mécanisme d’action de SHISA3 nous a permis de mettre en évidence l’interaction de SHISA3 avec le TGFβRII. Nous avons montré dans les cellules résistantes au docetaxel que l’inhibition pharmacologique de la voie du TGFβ provoque une sensibilisation au docetaxel, démontrant l’importance de la régulation de cette voie dans la résistance à la chimiothérapie. En parallèle de ce travail, nous avons établi un modèle de cancer de la prostate résistant au docetaxel chez la souris. L’obtention de ce modèle est cruciale pour réaliser la validation préclinique des thérapies visant à contourner les mécanismes de résistance au docetaxel. Les tumeurs obtenues dans ce nouveau modèle sont caractérisées par une sous-expression de SHISA3 et par l’expression des marqueurs d’EMT. Ce modèle nous permettra de valider in vivo le potentiel thérapeutique de l’association d’un inhibiteur de la voie du TGFβ avec le docetaxel. De manière intéressante, nous avons observé in vivo que l’expression de SHISA3 est corrélée à la réponse au traitement par docetaxel. Ces résultats suggèrent que SHISA3 pourrait être un biomarqueur de réponse à la chimiothérapie. / Prostate cancer is the most common cancer in men and the third leading cause of cancer mortality in France. Since 2004, docetaxel is the standard treatment for metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). However, nearly half of treated patients develop resistance to chemotherapy. The aim of my thesis is to identify molecular predictors to select patients who will respond to docetaxel chemotherapy. My second goal is to identify new therapeutic targets to overcome this resistance, by studying the molecular mechanisms involved in the development of resistance.To this purpose, genes and microRNAs expression profiles were established in several cellular models of docetaxel-resistant prostate cancer. The integration of these high-throughput data suggested that the epithelial-mesenchymal transition (EMT) was involved in the mechanism of docetaxel resistance. Deciphering the EMT mechanism observed in our cellular models allowed the identification of SHISA3 as a new regulator of this process. SHISA3 is highly under-expressed in docetaxel resistant cells which present a mesenchymal phenotype. Interestingly, SHISA3 is also down-regulated in a large variety of human tumors. The inhibition of SHISA3 in sensitive cells induced a complete EMT, characterized by loss of cellular junctions, expression of mesenchymal transcription factors, and increased migratory capacity. The study of its mechanism of action allowed us to highlight the interaction of SHISA3 with TGFβRII. We showed in docetaxel-resistant cells that pharmacological inhibition of the TGFβ signalling pathway induces sensitization to docetaxel, demonstrating the importance of the regulation of this pathway in the resistance to chemotherapy.In parallel, we developed a docetaxel-resistant prostate cancer model in mice. The establishment of this model is critical for the preclinical validation of new targeted therapies. Tumors obtained from this new model are characterized by the under-expression of SHISA3 and the expression of EMT markers. This model will allow the validation of the therapeutic potential of co-treatment with docetaxel and TGFβ signalling pathway inhibitors in vivo. Interestingly, we observed that SHISA3 expression is correlated with response to docetaxel treatment in vivo. These results suggest that SHISA3 could be a biomarker of response to docetaxel chemotherapy.

La candidose oropharyngée (COP) constitue l’infection fongique opportuniste la plus fréquente chez les patients infectés au VIH-1. Malgré la profonde immunosuppression causée par le VIH-1, l’infection à Candida albicans demeure confinée au niveau de la muqueuse buccale sans dissémination aux organes profonds. La souris transgénique (Tg) CD4C/HIVMut exprimant le génome tronqué du VIH-1 présente, suite à l’inoculation orale de C. albicans, une COP chronique reproduisant fidèlement l’infection chez les patients séropositifs. Cette souris Tg a donc été utilisée afin de déterminer si les macrophages contribuent au confinement de C. albicans à la muqueuse buccale. Cette étude a permis de démontrer que i) les macrophages sont recrutés aux muqueuses buccale et gastrique en réponse au champignon malgré l’expression du transgène, ii) les macrophages de ces souris Tg présentent une polarisation vers un phénotype d’activation alternative et iii) la production de monoxyde d’azote par les macrophages des souris Tg n’est pas requise pour limiter la prolifération de Candida à la muqueuse buccale et pour restreindre sa dissémination aux organes profonds. Les macrophages ne semblent donc pas directement responsables de l’établissement de l’infection chronique à Candida chez la souris Tg CD4C/HIVMut. / Oropharyngeal candidiasis (OPC) is the most frequent opportunistic fungal infection among HIV-infected patients. Despite the profound immunosuppression caused by HIV-1, Candida albicans infection is limited to the oral epithelium and rarely disseminates to deep organs. The CD4C/HIVMut transgenic (Tg) mice, which expresses the truncated HIV-1 genome, developed a chronic OPC after oral inoculation with C. albicans that closely reproduces infection in seropositive patients. Here, we used this Tg mouse to investigate the contribution of macrophages in limiting candidiasis to the oral mucosa. This study shows that i) macrophages are recruited to the oral and gastric mucosa in response to C. albicans despite transgene expression, ii) the macrophages of this Tg mouse exhibited a polarization toward an alternatively activated phenotype and iii) nitric oxide production by these macrophages is dispensable for limiting chronic oral carriage and for preventing systemic dissemination of the fungi in these Tg mice. Overall, these result indicate that macrophage do not directly determine the susceptibility to chronic carriage of Candida in these CD4C/HIVMut Tg mice.

La trisomie 21 (T21) résulte de la présence d’une extra-copie du chromosome 21 (Chr21). Parmi les gènes candidats impliqués dans les déficits cognitifs liés à la T21, DYRK1A est un des plus pertinents. Des études ont montré une corrélation entre l’augmentation de son activité kinase avec les déficits mnésiques observés dans les modèles murins de T21. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents aux altérations cognitives causées par son surdosage, nous avons utilisé des modèles murins sur-exprimant DYRK1A seule ou en plus d’autres gènes orthologues au Chr21, ainsi que des inhibiteurs spécifiques de DYRK1A (Leucettines) synthétisés par ManRos Therapeutics. Ici sont présentées les conséquences d’un traitement chronique avec ces Leucettines sur la cognition de ces animaux. Des analyses du phosphoprotéome de ces souris traitées ou non avec une des Leucettines, la L41, a mis en lumière des cibles et mécanismes biologiques impliqués dans les perturbations mnésiques de ces animaux. Enfin, ce projet a surtout permis de mettre en évidence un nouvel inhibiteur plus sélectif pour DYRK1A comme candidat-médicament pour l’amélioration des fonctions cognitives des porteurs de la T21. / Down Syndrome (DS), is due to the presence of an extra copy of chromosome 21 (Ch21). Among the candidates implicated in DS intellectual disabilities, DYRK1A is one of the most relevant. Several studies have shown a correlation between an increase of its kinase activity and the intellectual defects observed in DS models. In order to understand the mechanisms underlying the impact of DYRK1A overdosage on cognitive alterations, we used several trisomic mouse models expressing DYRK1A alone or with additional Hsa21 orthologous genes and specific DYRK1A inhibitors (Leucettines) from ManRos Therapeutics. We will present here the consequence of the Leucettines treatment following repetitive administration to several DS mouse models on the behavior and cognition. Further analysis of the phosphoproteome of DS mouse models treated or not with one of the Leucettine, the L41, unravels a few targets and pathways which are involved in the cognitive alterations observed in these trisomic mice. These results support the potential of more selective DYRK1A inhibitor as a therapeutic approach to improve cognitive functions in DS patients.

Les variations du nombre de copies (CNVs) incluent les délétions et les duplications de régions chromosomiques d’une taille variant de 50 pb à plusieurs Mb. Depuis 2005, les études d’association pangénomiques (GWAS) ont permis d’associer certains larges CNVs à des maladies syndromiques associées à la déficience intellectuelle incluant les syndromes de DiGeorge, Williams, Angelman, etc. En fonction de la densité génique de la région d’intérêt et de la variabilité des phénotypes associés, l’étude de la physiopathologie des syndromes peut être extrêmement complexe. La modélisation murine offre de nombreux avantages pour l’identification des gènes candidats et la compréhension des mécanismes moléculaires associés à ces pathologies.Les travaux présentés dans ce manuscrit consistent en la caractérisation des modèles murins pour cinq maladies syndromiques associées aux CNVs : la monosomie 21 partielle ainsi que les réarrangements des régions 16p11.1 et 17q21.31. Les caractérisations anatomiques, métaboliques et comportementales des animaux nous ont permis d’évaluer un grand nombre de paramètres associés à la symptomatique humaine. Nous avons également réalisé des analyses électrophysiologiques et transcriptomiques en ciblant nos investigations sur l’hippocampe, structure cérébrale qui joue un rôle central dans les processus de mémoire et d’apprentissage. Ce projet de recherche s’inscrit dans une perspective plus large qui est l’identification des gènes candidats pour les phénotypes observés et le développement de premières stratégies thérapeutiques pouvant potentiellement aboutir à l’amélioration des capacités cognitives des patients. / Copy number variations (CNVs) include deletions and duplications of chromosomal regions ranging in size from 50bp to several Mb. Since 2005, genome-wide association studies (GWAS) have associated some large CNVs to syndromic diseases linked to intellectual disability including DiGeorge, Williams, Angelman syndroms, etc. Depending on the gene density of the region of interest and the variability of symptoms, the study of the pathophysiology of syndromes can be extremely complex. Mouse modeling show many advantages for the identification of candidate genes and the understanding of molecular mechanisms associated with these diseases.The work presented in this manuscript consists of the characterization of mouse models of five syndromic diseases associated with CNVs: partial monosomy 21 and rearrangements of 16p11.2 and 17q21.31 regions. Anatomical, metabolic and behavioral characterizations of animals allowed us to evaluate a broad number of parameters associated with human phenotypes. We also performed electrophysiological and transcriptomic analysis focusing our investigation on the hippocampus which has a major role in learning and memory processes. This project is part of a wider perspective which is the identification of candidate genes for the different phenotypes we observe in the mouse and the development of first treatment strategies which can potentially lead to the improvement of cognitive capacity of patients.

L’autophagie est un processus catabolique lié aux lysosomes, essentiel à la l’homéostasie cellulaire notamment dans les lymphocytes. Elle est impliquée dans la pathogenèse de nombreuses maladies et pourrais jouer un rôle dans le développement de maladies auto-immunes. Nous avons voulu étudier son rôle in vivo dans les lymphocytes B et T. Nous avons généré des souris déficientes en autophagie spécifiquement dans ces cellules et montré que l’autophagie n’est pas essentielle au développement des LB, mais que dans un contexte auto-immun la persistance de plasmocytes et la production d’autoanticorps été diminuée. Cela démontre un rôle de l’autophagie dans les réponses à long terme. Les réponses humorales à long-terme T dépendantes sont également impactées. De plus des souris transplantées avec des LT CD4+ déficients en autophagie montrent une réponse humorale mémoire diminuée. Nous nous sommes également intéressé aux voies de signalisation conduisant à l’induction de l’autophagie en réponse à une stimulation du TCR dans des LT normaux et pathologiques. Nos résultats préliminaires montrent une implication de la voie calcique. / Autophay is a catobolic lysosomal process essentail for cellular maintenance and fucntion such as lymphocyte homeosatsis. The generation of mice models with an Atg5 conditional knock-out in B and T cells respectively, have allowed us to study autophagy requirements of those immune cells in vivo. We have demonstrated that autophagy was dispensable for B cell development but that in autoimmune settings B cell autophagy was required for the maintenance of long-lived plasma cells and for the production of autoantibodies. In mice deficient for autophagy in T cells, long-term tumoral response to a T-dependent antigen is decreased. We also showed that in mice adoptively transferred with autophagy deficient CD4 T cells, the antigen specific memory humoral immune response was impaired. We also investigated the signaling pathways leading to autophagy induction upon TCR stimulation in normal and lupus T cells and showed that the calcium signaling is highly involved.

La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est une maladie clonale hétérogène caractérisée par une prolifération immature des cellules myéloïdes et une défaillance de la moelle osseuse. Malgré les avancées rapides dans le domaine de la LMA, notamment concernant de nouvelles cibles thérapeutiques et une meilleure compréhension des mécanismes biologiques, le traitement clinique de la LMA reste inchangé et dépend du caryotype des patients. Lors des trois dernières décennies, la plupart des patients ont fini par récidiver et décéder de la maladie ; il n’y a encore aucun schéma thérapeutique standard qui améliore le pronostic et le traitement de la LMA.Les imidazoquinoxalines sont des dérivés de l’imiquimod qui présentent un effet immunomodulateur indirect et une activité anti-tumorale directe contre le mélanome et le lymphome à cellules T, provoquant l’inhibition de la croissance cellulaire et l’induction de l’apoptose par la voie dépendante des caspases . Nous avons étudié les effets des dérivés de la série imidazoquinoxaline, EAPB0203 et EAPB0503, sur des lignées de cellules humaines LMA. Nous avons montré que EAPB0503 inhibe la croissance de la lignée cellulaire LMA qui présente la mutation NPM-1 de manière dose et temps dépendants. Par rapport au dérivé EAPB0203 précédemment synthétisé, EAPB0503 a une activité inhibitrice plus forte sur les cellules OCI-AML3 ainsi que sur des cellules provenant de patients LMA. Nous avons démontré que EAPB0503 induit une dégradation médiée par les protéasomes deNPM-1 muté ainsi qu’un rétablissement de la localisation nucléolaire de NPM-1 sauvage conduisant à une inhibition de la prolifération des cellules OCI-AML3.EAPB0503 induit une apoptose massive comme démontré par l’analyse du cycle cellulaire avec une accumulation de cellules traitées en phase preG0. L’apoptose a été confirmée par la réponse positive au test de l’annexine V, le clivage de PARP et la dissipation du potentiel membranaire mitochondrial dans les cellules OCI-AML3 traitées.En outre, EAPB0503 a augmenté les niveaux d’expression et de phosphorylation de p53.Ces résultats, concernant l’arrêt de la croissance cellulaire et l’apoptose, sélectivement dans les cellules LMA présentant la mutation NPM-1, renforcent l’idée d’un ciblage de l’oncoprotéine NPM-1 muté pour éliminer les cellules leucémiques et justifient une évaluation préclinique plus large puis une évaluation clinique pour ce candidat médicament prometteur.En conclusion, nos études mettent en évidence l'utilisation d’EAPB0503 comme un candidat médicament prometteur qui présente une activité anti-tumorale encourageante et qui devrait faire l’objet d’études précliniques dans le cadre d’une thérapie ciblée contre la LMA. / Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous clonal disorder characterized by immature myeloid cell proliferation and bone marrow failure. Although the remarkable improvements in the field and regarding new drug targets and better understanding of the biology, the clinical treatment of AML remains unchanged and depending on karyotype of patients. For the last thirty years with the majority of patients, in the end, relapsing and dying of the disease, there is no standard regimen that improves prognosis and treat AML yet.Imidazoquinoxalines are imiquimod derivatives with indirect immunomodulatory effect and direct antitumor activity on melanoma and T-cell lymphoma, attributed to growth inhibition and induction of apoptosis through caspase-dependent pathway. We examined the effects of imidazoquinoxaline derivatives, EAPB0203 and EAPB0503, on human AML cells. We found that EAPB0503 inhibit cell growth of AML cell line that harbors the NPM-1 mutation in a time- and dose-dependent way. Compared to the previously synthesized EAPB0203, EAPB0503 has a more pronounced inhibitory activity on OCI-AML3 cells and cells derived from AML patients as well. We demonstrated that the EAPB0503 induces proteasome-mediated degradation of mutant NPM-1, and restoration of the nucleolar localization of the NPM-1wt leading to an inhibition of the proliferation of OCI-AML3 cells.EAPB0503 induced massive apoptosis as demonstrated with the cell cycle analysis by the accumulation of treated cells in the preG0 region. Apoptosis has been confirmed by Annexin V positivity, PARP cleavage, and dissipation of mitochondrial membrane potential in treated OCI-AML3 cells.Furthermore, EAPB0503 increased the expression and phosphorylation levels of p53.These results in growth inhibition and apoptosis, selectively in AML cells that harbor the NPM-1 mutation reinforce the idea targeting NPM-1m oncoprotein to eradicate leukemic cells and warrant a broader preclinical then clinical evaluation of this promising drug.In conclusion, our studies highlight the use of EAPB0503 as a promising anti-tumor activity to be investigated preclinically in AML targeted therapy.

Le Syndrome d’Ehlers-Danlos vasculaire (SEDv) est une pathologie génétique rare à transmission autosomique dominante. Les patients sont prédisposés à la survenue de ruptures vasculaires, digestives et utérines induisant une létalité précoce. Cette pathologie est due à des mutations du gène COL3A1 (codant le collagène de type III), majoritairement de type faux-sens, agissant via un mécanisme dominant négatif. Plus rarement, de larges délétions ou des mutations non-sens induisent une haplo-insuffisance. In fine, les conséquences de ces mutations portent essentiellement sur la synthèse du collagène de type III, aboutissant à une fragilité artérielle importante. A ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible. L’inactivation du gène Col3a1 chez la souris entraine une mortalité in utero et néonatale quasi-systématique en cas d’homozygotie, mais les souris Col3a1+/- sont exemptes de phénotype vasculaire évident. Afin d’obtenir un modèle de dissection artérielle liée à un défaut de collagène de type III, une perfusion chronique d’Angiotensine II (Ang II) à dose pressive a été utilisée. Nos résultats montrent que l’haplo-insuffisance en collagène de type III confère une sensibilité artérielle majeure à l’Ang II. Cette fragilité est caractérisée par le développement de dissections/ruptures de l’aorte ascendante et induit des décès prématurés de ces animaux. Ce phénotype est lié non seulement à l’élévation de pression artérielle mais aussi à l’activation des voies de signalisation de l’Ang II. Enfin, nous montrons qu’un traitement associant un bêtabloquant (propranolol) et un vasodilatateur artériel (hydralazine) permet de réduire la mortalité induite par l’Ang II. Ces résultats suggèrent l’intérêt de l’ajout d’un traitement préventif par inhibiteur de l’Ang II au traitement bêtabloquant (Celiprolol) recommandé dans la pathologie humaine.Parallèlement, nous avons généré un modèle murin knock-in génétiquement plus proche des patients SEDv, par l’introduction d’une mutation ponctuelle faux-sens (Gly183Ser) observée chez un patient. L’analyse préliminaire de ce modèle montre que les souris Col3a1+/G183S décèdent spontanément, dès 4 semaines, de ruptures/dissections de l’aorte ascendante. Cependant, ces souris ne présentent de modification ni de leurs paramètres hémodynamiques, ni de leurs diamètres aortiques. En revanche, environ 20 % des souris Col3a1+/G183S présentent des plaies au niveau du dos et des pattes. Ce nouveau modèle de souris est actuellement le seul à récapituler aussi fidèlement le phénotype des patients SEDv. Il devrait donc permettre de tester différentes approches thérapeutiques. / Vascular Ehlers-Danlos (vEDS) syndrome is a rare, inherited, autosomal dominant disease that results from mutations in the COL3A1 gene, encoding type III collagen. Patients are mostly affected by missense mutations probably acting through a dominant negative mechanism. A few patients present large deletions or nonsense mutations leading to a haploinsufficient mechanism. These mutations are supposed to lead to a defect in the synthesis and secretion of collagen type III, resulting in arterial wall fragility. Consequently, vEDS is mostly characterized by ruptures/dissections in arteries at a young age, which ultimately lead to premature death. While there is currently no surgical or therapeutic treatments available, a recent study reported the beneficial effect of the beta-blocker celiprolol, which prevents vascular complications in patients.To investigate the vascular phenotype of vEDS, a mouse model of this disease has been generated by the complete and ubiquitous inactivation of the COL3A1 gene. Col3a1-/- mice exhibit severe perinatal mortality and die prematurely from spontaneous vascular rupture. However, Col3a1+/- mice are viable and exhibit no obvious vascular phenotype. To determine the susceptibility of Col3a1+/- mice to develop vascular rupture/dissection, an experimental model of aneurysm induction was used, through the chronic infusion of Angiotensin II (Ang II). Our results showed that Ang II infusion led to severe premature mortality in Col3a1+/- compared to wild type. This fragility was characterized by the development of rupture/dissection in the ascending aorta. These lesions could be caused by the elevation of blood pressure and/or the activation of Ang II signaling pathways. We showed that treatment with a beta-blocker (propranolol) and an arterial vasodilator (hydralazine) reduced the mortality induced by Ang II in Col3a1+/- mice. These results suggest the beneficial effect of adding a preventive treatment inhibitor of Ang II to the beta-blocker treatment recommended in human pathology.Meanwhile, given that a majority of human vEDS cases is caused by missense mutations in the COL3A1 gene, we established a knock-in mouse model bearing a point mutation (Gly183Ser) found in vEDS patients. The preliminary characterization of this model showed that Col3a1+/G183S mice die spontaneously as early as 4 weeks of age from a dissection or rupture of the ascending aorta. However, these mice do not showed any changes of their hemodynamic parameters or aortic diameter. Furthermore, about 20 % of mouse Col3a1+/G183S display wounds in the back and legs. This new mouse model is currently the only that mimic more closely the human disease and could therefore be used to test different therapeutic strategies.