En aquesta tesi s’ha estudiat l’eliminació biològica de nitrogen en aigües residuals amb alta càrrega d’amoni. Aplicant certes condicions d’operació en un sistema de llots actius es pot aconseguir la nitrificació parcial o nitritació, que és l’oxidació de l’amoni a nitrit, evitant la conseqüent oxidació d’aquest nitrit a nitrat. Aquesta reducció en el procés de nitrificació aporta un seguit d’avantatges en front de la nitrificació convencional, tals com la reducció de les necessitats d’oxigen en la nitrificació i de la matèria orgànica en la desnitrificació, l’increment de la velocitat de desnitrificació i la reducció de la producció de biomassa. Aquesta tesi s’ha presentat com a compendi de publicacions. A continuació es presenta un breu resum dels articles: En l’Article I es presenta un sistema de nitrificació parcial format per una planta pilot amb tres reactors de fangs actius en sèrie. Aquesta planta pilot es va inocular a partir de llots d’una EDAR urbana i es va operar amb un llaç de control de la càrrega de nitrogen aplicada que consisteix en la modificació del cabal d’entrada segons els valors d’OUR mesurat als reactors. Utilitzant aquest llaç de control i treballant amb un temps de residència cel·lular baix es va aconseguir rentar els bacteris nitrit-oxidants del sistema. Simultàniament, també es va aconseguir tractar una elevada càrrega d’amoni i es va demostrar la viabilitat del procés a llarg termini tot obtenint una nitrificació parcial amb pràcticament només nitrit. Posteriorment, en l’Article II, es presenta la desnitrificació del corrent de nitrit obtingut amb el sistema desenvolupat en l’Article I. Aquesta desnitrificació es va realitzar utilitzant diferents fonts de carboni tals com etanol, glicerol, lixiviats d’abocador i finalment llots primaris i secundaris fermentats. Aquest estudi es va dur a terme en reactors discontinus seqüencials (SBR) i es van obtenir bones velocitats de desnitrificació per totes les fonts de carboni estudiades excepte pels llots secundaris fermentats. En l’Article III, es presenta l’estudi de l’efecte d’una llarga aturada del sistema de nitrificació parcial tot deixant d’alimentar durant 30 dies. Aquest estudi es va realitzar en quatre reactors discontinus que es van operar en diferents condicions d’aeració. Durant aquest període de temps es va fer un seguiment de l’activitat dels bacteris amoni-oxidants mitjançant respirometries i l’anàlisi FISH. Es va observar que és millor aturar el sistema de nitrificació parcial en condicions anòxiques i, a poder ser, no més de dues setmanes. Finalment, es va obtenir una recuperació ràpida del sistema utilitzant el llaç de control per OUR emprat en la planta pilot de l’Article I. Finalment, en l’Article IV es presenta l’estudi de l’efecte de les inhibicions per amoníac i per àcid nitrós en els bacteris amoni-oxidants, a més de l’efecte d’aquestes inhibicions en condicions de limitació per carboni inorgànic. Es va comprovar que la inhibició per amoníac es pot descriure amb precisió amb al model cinètic Haldane i la inhibició per àcid nitrós a un model d’inhibició no competitiva. Es va observar que l’efecte d’aquestes inhibicions s’incrementa en condicions de limitació per carboni inorgànic, sent molt més gran en el cas de l’àcid nitrós. / En esta tesis se estudia la eliminación biológica de nitrógeno en aguas residuales con una alta carga de amonio. Aplicando ciertas condiciones de operación en un sistema de lodos activos se puede conseguir la nitrificación parcial o nitritación, que es la oxidación del amonio a nitrito, evitando la consecuente oxidación de este nitrito a nitrato. Esta reducción en el proceso de nitrificación aporta unas ventajas frente a la nitrificación convencional, tales como la reducción de les necesidades de oxigeno en la nitrificación y de la materia orgánica en la desnitrificación, el incremento de la velocidad de desnitrificación y la reducción de la producción de biomasa. Esta tesis se presenta como compendio de publicaciones. A continuación se presenta un breve resumen de los artículos: En el Artículo I se presenta un sistema de nitrificación parcial formado por una planta piloto con tres reactores de lodos activos en serie. Esta planta piloto se inoculó a partir de lodos de una EDAR urbana y se operó con un lazo de control de la carga de nitrógeno aplicada que consiste en la modificación del caudal de entrada según los valores de OUR medidos en los reactores. Utilizando este lazo de control y trabajando con un tiempo de residencia celular bajo se consiguió lavar las bacterias nitritooxidantes del sistema. Simultáneamente, también se consiguió tratar una elevada carga de amonio y se demostró la viabilidad del proceso a largo plazo obteniendo una nitrificación parcial con prácticamente solo nitrito. Posteriormente, en el Artículo II, se presenta la desnitrificación de la corriente de nitrito obtenida con el sistema desarrollado en el Artículo I. Esta desnitrificación se realizó utilizando distintas fuentes de carbono tales como etanol, glicerol, lixiviados de vertedero y finalmente lodos primarios y secundarios fermentados. En este estudio se utilizaron reactores discontinuos secuenciales (SBR) y se obtuvieron buenas velocidades de desnitrificación para todas las fuentes de carbono estudiadas excepto para los lodos secundarios fermentados. En el Artículo III, se presenta el estudio del efecto de una larga parada del sistema de nitrificación parcial dejando de alimentar durante 30 días. Este estudio se realizó en cuatro reactores discontinuos que se operaron en distintas condiciones de aireación. Durante este período de tiempo se hizo un seguimiento de la actividad de las bacterias amonio-oxidantes utilizando técnicas respirométricas y el análisis FISH. Se observó que es mejor parar el sistema de nitrificación parcial en condiciones anóxicas y, a poder ser, no más de dos semanas. Finalmente, se consiguió una recuperación rápida del sistema utilizando el lazo de control por OUR utilizado en la planta piloto del Artículo I. Finalmente, en el Artículo IV se presenta el estudio del efecto de las inhibiciones por amoníaco y por ácido nitroso en las bacterias amonio-oxidantes, además del efecto de estas inhibiciones en condiciones de limitación por carbono inorgánico. Se comprobó que la inhibición por amoníaco se puede ajustar con precisión utilizando el modelo cinético Haldane y la inhibición por ácido nitroso utilizando el modelo de inhibición no competitiva. Se observó que el efecto de estas inhibiciones se incrementa en condiciones de limitación por carbono inorgánico, siendo mucho mayor en el caso del ácido nitroso. / Biological nitrogen removal of high-strength ammonium wastewater was studied in this thesis. Applying specific operational conditions in an activated sludge system, partial nitrification or nitritation (oxidation of ammonium to nitrite) was achieved, avoiding the consequently oxidation of this nitrite to nitrate. This reduction in the nitrification process provides some advantages in comparison to the complete nitrification process, such as the reduction of the oxygen requirements during nitrification and the organic matter during denitrification, the increasing of the denitrification rates and the reduction of the biomass production. This thesis was presented as a compendium of publications and a brief summary of the papers are presented: In Paper I, a partial nitrification system consisting of a pilot plant with three continuous stirred tank reactors in series is presented. This pilot plant was inoculated with sludge from a municipal WWTP and it was operated with a control loop of the nitrogen loading rate which was applied modifying the inflow rate depending on the OUR values measured in the reactors. With this control loop and low sludge retention time the washout of the nitrite-oxidizing bacteria was performed. Simultaneously, almost a complete partial nitrification to nitrite with a high nitrogen loading rate was achieved during a long term operation. Subsequently, in Paper II, the heterotrophic denitrification of the nitrite obtained with the pilot plant developed in Paper I was presented. Different organic carbon sources such as ethanol, glycerol, landfill leachate, fermented primary sludge centrate and fermented secondary sludge centrate were used in the heterotrophic denitrification. This study was carried out in sequential batch reactors (SBR) and a complete denitritation of a high-strength nitrite wastewater was achieved using these organic carbon sources with the exception of fermented secondary sludge centrate. In Paper III the study of the effect of a long-term starvation of a partial nitrification system during 30 days was presented. Four ammonium-starved reactors under different conditions of aeration were used. During this period the ammonia-oxidizing bacteria activity was evaluated using respirometric tests and the FISH analysis. It was observed that is better to shut-down a partial nitrification system under anoxic conditions and, if it is possible, no more than two weeks. Finally, a fast recovery of the system was achieved using the OUR control loop used in the pilot plant of Paper I. Finally, in Paper IV a study of the inhibitory effect by free ammonia and free nitrous acid on the ammonia-oxidizing bacteria under total inorganic carbon limitations and without total inorganic carbon limitations was presented. It was observed that the inhibition by free ammonia can be described accurately using the Haldane model and the inhibition by free nitrous acid using a non-competitive inhibition model. The effect of these inhibitions increased under total inorganic carbon limitation, being much higher in the case of the free nitrous acid.

In the last decades, nitrate pollution has become a major threat to groundwater quality. The consequences include health concerns and environmental impacts. Nitrate contamination is mainly derived from agricultural practices, such as the application of manure as fertilizer. The Osona area (NE Spain) is one of the areas vulnerable to nitrate pollution from agricultural sources. Nitrate is derived from intensive farming activities and the high nitrate content results in a loss of water availability for domestic uses. The most important natural nitrate attenuation process is denitrification. Denitrifying bacteria are generally heterotrophic and use carbon compounds as the electron donor. Nevertheless, a limited number of bacteria are able to carry out chemolithotrophic denitrification, and to utilize inorganic compounds. Several field studies have suggested by means of geochemical and/or isotopic data that denitrification in some aquifers is controlled by pyrite oxidation. However, the feasibility of pyrite-driven denitrification has been questioned several times in laboratory studies. This thesis is concerned with the role of pyrite in denitrification and its potential use as a bioremediation strategy. Earlier studies showed the occurrence of denitrification processes in a small area located in the northern part of the Osona region and suggested that sulfide oxidation had an important role in natural attenuation. Therefore, the first part of this thesis deals with the characterization of the denitrification processes occurring in the Osona aquifer and their spatial and temporal variations. Denitrification processes linked to pyrite oxidation were identified in some zones of the studied area by means of multi-isotopic methods integrated with classical hydrogeological methods. Nitrate removal from groundwater can be accomplished by the enhancement of in situ biological denitrification. One such bioremediation strategy is biostimulation, which involves the addition of suitable electron donors and/or energy sources to stimulate indigenous denitrifying microorganisms. The second part of this thesis is devoted to clarify the role of pyrite as electron donor for denitrification and to evaluate the feasibility of a bioremediation strategy based on pyrite addition to stimulate native denitrifying bacteria. Nitrate consumption in experiments amended with pyrite and inoculated with “Thiobacillus denitrificans” demonstrated that this bacterium is able to reduce nitrate using pyrite as the electron donor. The efficiency in nitrate removal and the nitrate reduction rate depended on the initial nitrate concentration, pH and pyrite grain size. High nitrate removal efficiency was attained in long-term flow-through experiments under laboratory conditions similar to those found in slow-moving, nitrate-contaminated groundwater. In addition, biostimulation experiments performed with sediments and groundwater from the Osona aquifer showed that the addition pyrite stimulated the activity of the indigenous microbial community and enhanced the nitrate removal. Furthermore, the long-term efficiency of the process was demonstrated. Hence, biostimulation with pyrite could be considered to remediate nitrate contamination in groundwater in future water management strategies, although further research is needed, especially at field scale. It is critical for the success of the bioremediation strategy that not only the processes but also the microbial populations and their changes induced by the bioremediation treatment be well understood. The addition of pyrite resulted in an increase in the proportion of denitrifying bacteria and both autotrophic and heterotrophic denitrifiers were stimulated. Bacterial populations closely related to the “Xanthomonadaceae” might probably be the dominant autotrophic denitrifiers that used pyrite as the electron donor in the biostimulated experiments. The N and O isotopic enrichment factors associated with the pyrite‐driven denitrification were computed and used to recalculate the extent of the natural nitrate attenuation in the Osona aquifer. This refinement becomes useful to predict the evolution of the contaminant in the aquifer, and it should be taken into account for potential implementation of induced remediation techniques. The isotopic approach was proved to be an excellent tool to identify and quantify natural denitrification processes in the field, and to monitor the efficacy of bioremediation strategies in the laboratory. In order to improve the long-term performance of potential bioremediation strategies based on pyrite-driven denitrification, it is necessary to know the contribution of attached and free-phase denitrifying bacteria to this process in aquifers. The last part of this thesis addresses the ability of “T. denitrificans” to grow and colonize pyrite surfaces. In the colonization experiments, attachment onto pyrite surface was required for at lest a small number of the cells in order to accomplish pyrite-driven denitrification. Nevertheless, both attached and planktonic cells probably contributed to the overall denitrification. However, the details of the relative roles of the two phases and the specific mechanisms remain to be addressed. / A les darreres dècades, la contaminació de nitrat de l’aigua subterrània ha esdevingut un dels principals problemes que afecten la qualitat dels recursos hídrics subterranis. La presència de nitrat a l’aigua subterrània està relacionada, principalment, amb pràctiques agrícoles, com per exemple, l’ús intensiu de purins com a fertilitzant orgànic. La comarca d’Osona (Catalunya) és una de les àrees declarades vulnerables a la contaminació per nitrat d’origen agrícola. El nitrat procedeix principalment de la intensa activitat agrícola i ramadera. El principal procés d’atenuació natural del nitrat és la desnitrificació. La majoria dels bacteris desnitrificants són heteròtrofs i usen compostos orgànics com a font d’electrons. Tanmateix, també existeixen bacteris desnitrificants autòtrofs que són capaços d’usar compostos inorgànics, com a donants d’electrons. Estudis de camp previs han demostrat a partir de dades geoquímiques i/o isotòpiques que en alguns aqüífers la desnitrificació està controlada per l’oxidació de pirita. Tot i així, hi ha estudis de laboratori que qüestionen la viabilitat de la desnitrificació lligada a l’oxidació de pirita (compost inorgànic donant d’electrons). En aquesta tesi s’estudia el paper de la pirita en la desnitrificació i la seva possible aplicació com a estratègia de bioremediació d’aigües contaminades amb nitrat. Estudis previs demostraren l’ocurrència de processos de desnitrificació a Osona, en una petita àrea situada en el sector nord de la zona d’estudi. Els resultats d’aquests estudis suggereixen que l’oxidació de sulfurs hi juga un paper molt important en l’atenuació natural. A la primera part de la tesi s’exposa la caracterització dels processos de desnitrificació que tenen lloc en l’aqüífer d’Osona, així com de les seves variacions temporals i espacials. S’han usat mètodes multi-isotòpics integrats amb mètodes hidrogeològics clàssics, que han servit per identificar l’existència de processos de desnitrificació lligats a l’oxidació de pirita en algunes zones de l’àrea d’estudi. L’eliminació del nitrat de l’aigua subterrània pot aconseguir-se mitjançant estratègies que incentiven la desnitrificació biològica in situ. Una de les estratègies de bioremediació in situ és la bioestimulació, que consisteix en afegir donants d’electrons o fonts d’energia apropiades per tal d’estimular l’activitat de bacteris desnitrificants existents en el medi. En la segona part de la tesi s’esbrina el paper de la pirita com a potencial donant d’electrons en els procés de desnitrificació i s’avalua la viabilitat d’una estratègia de bioremediació, basada en l’addició de pirita per estimular l’activitat de bacteris desnitrificants autòctons. Experiments amb pirita i inoculats amb “Thiobacillus denitrificans” han demostrat que aquest bacteri és capaç de reduir el nitrat utilitzant la pirita com a donant d’electrons. A més a més, s’ha determinat que l’eficiència i la velocitat de reducció del nitrat depèn de la seva concentració inicial, del pH i de la mida de gra de la pirita. En experiments de flux continu, de llarga durada que simulen el flux d’aigües subterrànies contaminades amb nitrat, s’han aconseguit altes eficiències en l’eliminació del nitrat. A més a més, s’han realitzat experiments de bioestimulación amb pirita usant aigua subterrània i sediments de l’aqüífer d’Osona. Aquests experiments han demostrat que afegint pirita s’aconsegueix d’estimular l’activitat dels bacteris desnitrificants autòctons i, per tant, induir i/o augmentar la desnitrificació. També, s’ha provat l’alta eficiència d’aquest procés a llarg termini. Per tant, l’ús de la pirita podria tenir-se en compte com a estratègia per a l’eliminació de nitrat en properes mesures de gestió dels recursos hídrics. Tanmateix, cal més investigació, i especialment, a escala de camp. Per aconseguir l’èxit amb la bioremediació cal conèixer amb detall els processos i les poblacions microbiològiques que intervenen en els canvis poblacionals associats al tractament de bioremediació. Els resultats dels experiments de bioestimulació han demostrat que els bacteris desnitrificants autòtrofs dominants en el sistema són probablement poblacions relacionades amb Xanthomonadaceae. L’addició de pirita puposa un increment en la proporció de bacteris desnitrificants i produeix l’estimulació tant dels desnitrificants autòtrofs com dels heteròtrofs. A més a més, s’han calculat els factors d’enriquiment isotòpic de N i O associats al procés de desnitrificació per oxidació de pirita. Aquests factors d’enriquiment s’han usat per recalcular el grau d’atenuació natural del nitrat que té lloc en l’aqüífer d’Osona. Aquest recàlcul pot ser d’utilitat a l’hora de predir l’evolució de la contaminació en l’aqüífer i cal tenir-lo en compte a l’hora d’implementar possibles tècniques de remediació induïda. Per tant, la metodologia isotòpica ha demostrat ser una eina excel∙lent per identificar i quantificar processos de desnitrificació natural i per monitoritzar l’eficàcia d’estratègies de bioremediació en el laboratori. Per millorar el rendiment i la durabilitat de potencials estratègies de bioremediació basades en la desnitrificació i oxidació de pirita és necessari conèixer la contribució relativa dels bacteris desnitrificants planctònics i dels bacteris adherits als sediments. Així, a l’última part de la tesi l’interès s’enfoca en l’avaluació de l’habilitat de “T. denitrificans” en colonitzar i créixer sobre la superfície de la pirita. Els resultats experimentals de colonització suggereixen que per aconseguir la desnitrificació amb pirita com a donant d’electrons, cal que una part dels bacteris s’adhereixi a la superfície de la pirita. No obstant, sembla que ambdós bacteris, adherits i planctònics, contribueixen al procés global. Tanmateix, queda pendent d’examinar el paper específic de cada tipus en la desnitrificació.

La contínua descàrrega de nutrients, sobretot fosfats i nitrogen, és la major causa d'eutrofització dels ecosistemes aquàtics. Els sistemes de tractament basats en aiguamolls construïts s'han emprat per reduir ells nivells de nitrogen a l'aigua com a alternativa de baix cost als mètodes de depuració convencionals. L'eliminació del nitrogen a aquests sistemes depèn en bona part de la vegetació, i l'alternança de condicions aeròbiques i anaeròbiques per promoure els processos de nitrificació i desnitrificació. En aquest treball hem volgut investigar les activitats microbianes de nitrificació i desnitrificació en relació a dues espècies de plantes macròfites en un sistema d'aiguamolls de tractament de flux superficial (FS-SAC), dissenyat per minimitzar l'impacte de l'alliberament d'aigua carregada de nutrients a la reserva natural dels Aiguamolls de l'Empordà (Girona, Espanya). / The continuous delivery of nutrients, mainly phosphate and nitrogen, is the major cause of eutrophication of aquatic environments. Treatment technologies based on constructed wetlands have been applied to reduce the levels of nitrogen as a cost-effective alternative compared to conventional treatment methods. The nitrogen removal efficiency in wetlands relies on the presence of plants and the alternation of aerobic and anaerobic conditions to promote both nitrification and denitrification. Although the role of emergent macrophytes in such systems is largely recognized, their contribution to the overall treatment process has not been quantified very frequently. We have investigated the microbial nitrification and denitrification activities in relation to two plant species in a free water surface constructed wetland (FWS-CW), designed to minimize the impact of nutrient release into the Natural Reserve of Els Aiguamolls de l'Empordà (Girona, Spain).

La major conscienciació actual dels problemes de pol·lució que acompanyen les pèrdues de N del sòl cap a l'atmosfera ha reorientat les investigacions cap a un coneixement més profund dels processos implicats en les emissions dels compostos nitrogenats que comporten un major perjudici des d'un punt de vista ecològic així com els seus principals factors reguladors. La creixent preocupació per l'increment de la concentració atmosfèrica de N2O és deguda a les seves interaccions amb la fotoquímica atmosfèrica i el balanç de radiació de la Terra ja que intervé en la destrucció de la capa estratosfèrica d'ozó, contribueix a l'efecte hivernacle i participa de la pluja àcida. Es considera que els sòls són la principal font de N2O atmosfèric. Al voltant del 90% d'aquestes emissions són d'origen biòtic; els principals processos implicats són la desnitrificació i la nitrificació. L'emissió del N2O produït a través d'aquests dos processos es caracteritza pels diferents nivells de regulació que presenta ja que depèn de la taxa dels processos, de la proporció de N canalitzada per cada procés cap a la producció de N2O i del seu consum dins el mateix sòl el qual està relacionat amb les dificultats en el transport cap a l'atmosfera. Això comporta una gran dificultat a l'hora d'aprofundir en el coneixement de les emissions de N2O del sòl cap a l'atmosfera i de la seva regulació. El desconeixement dels nivells d'emissió de N2O i de la importància de la desnitrificació així com de la seva regulació tant en sòls agrícoles com naturals de les nostres contrades és el principal punt de partida dels objectius d'aquest treball. / The current increased awareness of pollution problems that accompany the loss of soil N to the atmosphere has reoriented research towards a deeper understanding of the processes involved in emissions of nitrogen compounds that lead to greater damage from an ecological point of view as well as their regulatory factors. The growing concern over the increased atmospheric concentration of N2O is due to their interactions with atmospheric photochemistry and radiation balance of Earth as it participates in the destruction of the stratospheric ozone layer, the greenhouse effect and in acid rain. It is considered that the soils are the main source of atmospheric N2O. Around 90% of these emissions are of biotic origin, the main processes involved are nitrification and denitrification. The emissions of N2O produced via these two processes are characterized by different levels of regulation, as it depends on the rate of processes, the proportion of N channeled by each process to N2O production and consumption within the same soil which is related to difficulties in transport to the atmosphere. This entails a great difficulty to deepen the knowledge of soil N2O emissions to the atmosphere and its regulation. The ignorance of N2O emission levels and the importance of denitrification as well as their regulation in both natural and agricultural soils is the main starting point of the objectives of this work.

Biological nutrient removal has been studied and applied for decades in order to remove nitrogen and phosphorus from wastewater. However, more anthropogenic uses and the continued demand for water have forced the facilities to operate at their maximum capacity. Therefore, the goal of this thesis is to obtain more compact systems for nutrient removal from domestic wastewater. In this sense, optimization and long-term stabilization of high volume exchange ratios reactors, treating higher volumes of wastewater, have been investigated. With the same target, aerobic granular sludge was proposed as a reliable alternative to reduce space and increase loading rates in treatment plants. However, the low organic loading rate from low-strength influents (less than 1 Kg COD•m-3d-1) results in slower granular formation and a longer time to reach a steady state. Because of that, different methodologies and operational conditions were investigated in order to enhance granulation and nutrient removal from domestic wastewater. / L’estudi de l’eliminació biològica de nutrients s’ha dut a terme durant dècades. Tot i això, la influencia de l’home i l’augment de la demanda d’aigua han forçat a les instal•lacions a treballar a la seva capacitat màxima. Així, l’objectiu de la tesi és obtenir sistemes més compactes per a l’eliminació de nutrients de les aigües residuals. En aquest sentit, s’ha investigat l’optimització i estabilització de reactors amb alts volums d’intercanvi, tractant més aigua. Amb el mateix objectiu, el fang granular aeròbic va ser proposat com una alternativa fiable per tal de reduir l’espai i incrementar les càrregues de les depuradores. Tot i això, la granulació amb influents de baixa càrrega (menors a 1 Kg dQO•m-3d-1) resulta més lenta i més dificultosa alhora d’obtenir l’estat estacionari. Per aquesta raó es van investigar diferents metodologies i condicions d’operació per tal de millorar la granularció i l’eliminació de nutrients de les aigües urbanes.