O gene A1 da alfa amilase foi isolado de uma biblioteca genômica em lambda EMBL3, feita com DNA do díptero primitivo Anopheles merus (Díptera, Nematocera, Culicoidea). Ele foi parcialmente seqüenciado, caracterizado pelo padrão da clivagem das enzimas restritivas e clonado no plasmídeo pIBI24 por Pernasetti (1991 ). No presente trabalho relata-se sua expressão em: bactéria (Escherichia coli AD494), células de inseto ( Spodoptera frugiperda) e em levedura (Pichia pastoris), tendo-se observado que somente nas células de Spodoptera frugiperda a enzima é expressa com atividade. A expressão extracelular do gene A1 foi ensaiada em E.coli AD494 usando o vetor pRSETc. Para este fim a seqüência do gene contendo seu próprio peptídeo sinal, foi inserida em fase de leitura (\"frame\") nesse vetor. A expressão sem peptídeo sinal foi executada usando o vetor pAE2, uma construção derivada- do pRSETc. Numa outra construção, o gene A1 foi inserido em fase de leitura após a seqüência do promotor e do peptídeo sinal do gene A2 (alfa amilase de Bacillus stearothermophilus) utilizando-se o vetor pIBI24-Bst. As células de E.coli AD494 transformadas com estes construções expressaram a enzima sem atividade. A amilase A1 não foi secretada nem com seu peptídeo sinal nem com o da amilase A2. A expressão do gene A1 em levedura (Pichia pastoris) foi feita usando o vetor pPic9, que permite a expressão tanto intracelular quanto a secreção da proteína. O gene foi amplificado por PCR usando \"primers forward\" com o intuito de obter o gene com ou sem peptídeo sinal. O gene contendo o peptídeo sinal foi construído com diferentes seqüências tipo Kozak precedendo o códon ATG. Para a expressão extracelular usou-se o peptídeo sinal do fator alfa do pPic9. Os resultados mostraram que a enzima é expressa mas que permanece dentro da célula sem atividade. As mesmas construções do gene A1 feitas para Pichia foram inseridas em Baculovírus para transfectar células de Spodoptera frugiperda. Neste sistema a amilase foi expressa com atividade principalmente no sobrenadante das culturas transformadas com construções usando o gene contendo o seu próprio peptídeo sinal assim com o peptídeo sinal da amilase de Zabrotes subfasciatus. O gene da alfa amilase de Bacillus stearothermophilus foi expresso no sistema Baculovírus-Spodoptera e na levedura Pichia, usando o gene contendo o peptídeo sinal da amilase de Z. subfasciatu. A proteína foi secretada e tinha atividade em ambos os sistemas. / The alpha amylase A1 gene was isolated trom a genomic library of lambda EMBL3 made with DNA from the primitve Díptera Anopheles merus (Díptera, Nematocera, Cuclicoidea). This gene was partialy sequenced, characterized by standard restriction enzyme cleavage, and cloned into the pIBI24 plasmid by Pernasetti (1991). Here we present the expression of this gene in: bacteria (Escherichia coli AD494), insect cell (Spodoptera frugiperda) and yeast (Pichia pastoris). It was shown that only in Spodoptera frugiperda cells the protein display enzymatic activity. The presence of the A1 product in the extracelullar culture media was tested in Escherichia coli AD494 using the vector pRSETc. To this end, the gene sequence containing its own signal peptide was inserted in frame into the vector. Expression without a signal peptide was conducted using the pAE2 vector, a construct derived from pRSETc. In another construct, the A1 gene was inserted in frame after the promoter sequence and the signal peptide of the A2 gene (alpha amylase Bacillus stearothermophilus) using the pIBI24-Bst vector. Although the E.coli AD494 cells transformed with these constructs expressed the enzyme, no enzyme activity was detected. A1 was not secreted, either with its own signal peptide or with that of amylase A2. Expression of the A1 gene in yeast (Pichia pastoris) was conducted using the pPic9 vector, wich allows intracellular expression or secretion of this protein. The gene was amplified by PCR with forward primers, so as to amplyfy the gene sequence with or without the signal peptide. The gene containing the signal peptide was constructed with different Kozak sequences preceeding the ATG codon. For extracellular expression, the signal peptide of the pPic9 alpha factor was used. The results showed that the enzyme is expressed , but remained within the cell and do not display activity. The same constructs of the A1 gene made for P. pastoris were inserted in Baculovirus to infect Spodopera frugiperda cells. In this system, the amylase was successfully expressed and display enzymatic activity, mainly in the extracellular supernatant, using constructs of the gene with own signal peptide or with the signal peptide for amylase of Zabrotes subfasciatus. The gene A2 was expressed in the Baculovirus/Spodoptera system and the yeast P. pastoris using constructs containing the signal peptide of alpha amylase of Z. subfasciatus, the protein was secreted with activity.

A digestão nos insetos ocorre no intestino médio de forma compartimentada. A digestão inicial dos polímeros ocorre no interior da membrana peritrófica. Os oligômeros resultantes difundem-se para o espaço luminal exterior à membrana peritrófica onde são atacados por outras enzimas. Na digestão final os dímeros resultantes são hidrolisados por enzimas imobilizadas na superfície do epitélio do intestino médio. Após o processo de digestão final os monômeros são absorvidos pelas células do epitélio intestinal. Os Díptera ditos superiores, incluindo a mosca doméstica, apresentam peculiaridades digestivas que aparentemente resultam de adaptações para digerir uma dieta que consiste principalmente de bactérias. No ventrículo anterior ocorre uma diminuição no conteúdo de amido do bolo alimentar. Na porção seguinte, o bolo alimentar passa para o ventrículo médio onde as bactérias são mortas pela ação combinada de baixo pH, uma lisozima digestiva e uma proteinase tipo catepsina D. O material liberado das bactérias é digerido no ventrículo posterior, como ocorre no ventrículo inteiro da maioria dos insetos de outros grupos taxonômicos. Com o objetivo de compreender a peculiar digestão em Musca domestica, foram utilizadas suas larvas para identificar funcionalmente as regiões absortivas de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas na absorção de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas com tamponamento e fluxos de fluidos intestinais, sequenciar as enzimas digestivas principais e identificar os seus sítios de secreção. Experimentos fisiológicos de absorção de glicose e análises de atividade enzimática permitiram acessar de maneira direta os aspectos da digestão. Contudo, experimentos de sequenciamento de bibliotecas de cDNA, análise de sequências transcritas e verificação de expressão de genes em diferentes tecidos foram abordagens fundamentais na identificação das moléculas subjacentes aos processos fisiológicos intestinas de Musca domestica. Os indícios de que absorção de glicose no intestino de Musca domestica se dê por transportadores do tipo SGLT, com a possível participação de facilitadores do tipo GLUT, permitem estabelecer um foco para futuros estudos. A descrição de sequências relacionadas ao tamponamento intestinal permitiu ampliar a discussão sobre tal processo. Ao detalhar os sítios de expressão da subunidade a da V-ATPase, do canal de cloreto e do transportador de amônia foi possível testar o modelo de tamponamento proposto anteriormente e propor a participação de outras moléculas no processo. Sequências correspondentes as atividades de carboxipeptidase, maltase e aminopeptidase descritas na literatura foram pesquisadas, gerando sequências candidatas a codificarem as referidas enzimas. Com isso, é possível descrever a digestão de oligômeros e dímeros com base nos genes transcritos e nas sequências de aminoácidos que formam as enzimas digestivas. A descoberta da sequência que transcreve uma metaloproteinase, por sua vez, abre caminhos para a descrição e caracterização de sua atividade proteolítica nos tecidos digestivos da larva de Musca domestica. Essa análise permitiu também elucidar a localização dos sítios de expressão e, portanto, as zonas de secreção de enzimas. De maneira geral, este estudo contribuiu para a compreensão de diversos aspectos da digestão de Musca domestica, elucidando questões da particular fisiologia digestiva desse inseto. / Digestion in insects occurs in the midgut in a compartmentalized way. Initial digestion takes place inside the peritrophic membrane. The resulting oligomers diffuse into the luminal space outside the peritrophic membrane where they are hydrolyzed by other enzymes. In the final digestion, the resulting dimers are hydrolyzed by enzymes immobilized on the midgut epithelium. After the final digestion, the monomers are absorbed by intestinal epithelial cells. The so-called higher Diptera, including the house fly, have digestive peculiarities apparently resulting of adaptations to digest a diet consisting mainly of bacteria. In the anterior midgut there is a decrease in the starch content of the food bolus. The bolus now passes into the middle midgut, where bacteria are killed by the combined action of low pH, a special lysozyme and a cathepsin D-like proteinase. Finally, the material released by bacteria is digested in the posterior midgut, as is observed in the whole midgut of insects of other taxa. In order to understand the peculiar digestion in Musca domestica, the larvae were used to identify (a) the functionally the nutrient absorptive regions, (b) the molecules involved in the absorption of nutrients, (c) the molecules involved in buffering and fluid flows, (d) the cDNA sequences corresponding to intestinal digestive enzymes, (e) the main sites of secretion. Physiological experiments of glucose absorption and enzyme activity analysis allowed a direct access to aspects of digestion. Otherwise, cDNA library sequencing followed by sequence annotation and tissue-specific expression analysis were fundamental approaches in the understanding of intestinal physiology of Musca domestica. Evidence that glucose absorption in the gut of Musca domestica occurs through SGLT-like transporters, with the possible participation of facilitators GLUT-like, allowed us to establish a focus for future studies. The description of cDNA sequences corresponding to proteins putatively responsible for intestinal buffering widened the discussion of this process. The finding of the expression sites of V-ATPase subunits, chloride channel, and ammonia transporter led to revising the present buffering model and the inclusion of other molecules in the process. The cDNA sequences corresponding to the activities of carboxypeptidase, aminopeptidase and maltase described in the literature were searched for as candidate sequences to encode those enzymes. This made it possible to describe the digestion of oligomers and dimers based on transcribed genes and enzyme amino acid sequences. The discovery of the metalloproteinase transcribing sequence opened a new research line: the description and characterization of its proteolytic activity in the midgut of the Musca domestica larvae. This study also allowed elucidating the location of digestive enzyme expression sites and, therefore, the putative zones of enzyme secretion. Overall, this study contributed to understanding many aspects of digestion of Musca domestica, clarifying aspects of the peculiar digestive physiology of this insect.

Les montagnes sont des hotspots de biodiversité dont les réseaux plantes-pollinisateurs constituent un élément central, et où les conséquences du réchauffement climatique sont déjà avérées. Malgré le nombre colossal d’espèces potentiellement affectées par la destructuration du mutualisme entre les angiospermes et leurs pollinisateurs dans ces écosystèmes, les patrons spatio-temporels des communautés de pollinisateurs le long des gradients altitudinaux sont toujours méconnus. La première partie de ce travail propose une analyse des effets de l’altitude et de la phénologie sur l’abondance et la diversité des insectes anthophiles le long d’un gradient altitudinal de 1700 m. Nous montrons qu’il existe une structuration altitudinale et trophique entre les principaux ordres de pollinisateurs (hyménoptères, diptères, coléoptères), avec une nette prédominance des diptères dès 1500 m d’altitude qui s’amplifie jusqu’à la limite supérieure du gradient (2700 m). Ces diptères appartiennent principalement à trois familles (Anthomyiidae, Empididae, Muscidae) qui se structurent également le long du gradient par l’altitude, la phénologie et le choix des plantes visitées. Leur biologie, efficacité pollinisatrice comprise, est encore largement méconnue. Dans un second temps, nous étudions l’écologie de la pollinisation et les causes évolutives du succès d’un groupe central de ces communautés anthophiles, les Empidinae. Nous avons mesuré 1) leur importance relative dans un réseau plantes-visiteurs à l’étage subalpin et 2) leur efficacité pollinisatrice par rapport à celles des autres visiteurs pour une plante de ce réseau (Geranium sylvaticum L.). Nous montrons que les visites d’une grosse espèce d’Empis produisent le même nombre de graines que celles de l’abeille domestique (Apis mellifera L.), pollinisatrice réputée très efficace. Ces résultats suggèrent un rôle majeur des gros Empidinae dans la pollinisation des plantes alpines. Pour comprendre le rôle de la floricolie dans la diversification des Empidinae et l’origine de leur abondance en altitude, nous avons construit une phylogénie moléculaire mondiale sur la base de 4 marqueurs et pour plus de 210 espèces. La plupart des clades d’Empidinae contiennent des espèces qui occupent diverses altitudes, indiquant qu’il n’y a pas de conservatisme de niche impliqué dans leur distribution le long du gradient. L’association angiospermes-Empidinae remonte à la période de fin de radiation des angiospermes et semble, par l’intermédiaire de l’allongement de la trompe, avoir favorisé la radiation évolutive de certains clades en parallèle avec celles des plantes à fleurs. Leur large distribution altitudinale et leur capacité à visiter des morphotypes floraux inaccessibles à d’autres floricoles pourraient leur conférer une importante résistance aux changements globaux. / Mountains are biodiversity hotspots, where the effects of global warming have already been demonstrated in numerous studies. Plant-pollinator networks are a central element of these ecosystems, but, despite the tremendous number of species potentially affected by the disruption of this mutualism, spatial and temporal patterns of pollinator communities along altitudinal gradients are still poorly known. The first part of this work analyses the effects of elevation and phenology on the abundance and diversity of anthophilous insects along a 1700 m altitudinal gradient. I show that the main orders of pollinators (Diptera, Hymenoptera, Coleoptera) are structured by elevation and foraging preferences, with an increasing predominance of flies from 1500 m altitude up to 2700 m, the upper limit of the gradient. Most of these fly species belong to four families (Anthomyiidae, Empididae, Muscidae and Syrphidae) which also segregate along the gradient according to altitude, phenology and the choice of flowering plants they visit. The systematics and biology of these taxa, including their pollination efficiency, are still largely under-investigated. Second, I studied the pollination ecology and the evolutionary causes of the success of empidine dance flies (Empidinae), a central group in these anthophilous communities. I measured 1) their relative importance in the plant-visitor network of a subalpine meadow; and 2) the pollinating effectiveness of their visits to Geranium sylvaticum L. relative to the other visitors. Visits by large species of Empis produced the same number of seeds as those by the domestic bee (Apis mellifera L.), a highly effective pollinator. Such results suggest a major role of large empidines in the pollination of alpine plants. To understand the role of anthophily in Empidinae diversification and the origins of their abundance at altitude, I built a worldwide molecular phylogeny for the subfamily. The resulting cladogram includes 212 species for which four molecular markers were sequenced (28S D1-D2, D4-D5, 16S mtDNA, COI). Most clades of Empidinae contain species occupying various altitudes, indicating that there is no phylogenetic niche conservatism involved in their distribution along the gradient. The association between Empidinae and Angiosperms dates back to the end of the angiosperm radiation and seems, through the lengthening of the proboscis, to have favoured the evolutionary radiation of several clades in parallel with flowering plants. Their wide altitudinal distribution, combined with their ability to visit floral morphotypes inaccessible to other anthophilous insects, could confer them a strong resistance to global changes.

Um enfoque analítico, envolvendo centrifugação diferencial de homogeneizados de cecos gástricos de Rhynchosciara americana preparados em condições brandas e vigorosas, suporta a asserção de que existe uma classe principal de aril-α- e β -glicosidases, aril-α- e β-galactosidases e celobiases que é ligada à membrana plasmática, e duas classes de maltases, aminopeptidases, carboxipeptidases e dipeptidases. Maltases ocorrem na membrana plasmática e no interior de lisossomos na forma solúvel, enquanto que as peptidases (amino-carboxi- e dipeptidase) são encontradas na membrana plasmática e citossol. A ocorrência das enzimas citadas acima na membrana plasmática das células cecais, foi confirmada por resultados obtidos em preparações de microvilosidades realizadas com técnica desenvolvida para enterocito de mamíferos. O tratamento de microvilosidades com solução hiperosmótica de Tris, seguido de centrifugação em gradiente de densidade, permitiu a separação de quatro frações de membrana e de uma fração que contém microvilosidades intactas e, provavelmente, microfilamentos isolados. Eletroferogramas do material recolhido do gradiente mostrou diferenças entre as frações de membrana e sugeriu a ocorrência de actina como componente majoritário dos microfilamentos das microvilosidades. Ensaios enzimáticos nas diferentes frações do gradiente confirmaram a ocorrência de celobiase e carboxipeptidase ligadas à membrana plasmática. Os resultados de distribuição intracelular de hidrolases nos cecos de R. americana permitiram propor que a digestão terminal de proteínas ocorre na membrana plasmática e no citossol, por ação de amino-, carboxi- e dipeptidases, enquanto que a digestão de carboidratos, com exceção da trealose, ocorre somente na superfície das microvilosidades. / An analytical approach involving differencial centrifugation of Rhynchosciara Americana midgut caeca homogenates prepared in mild and in vigorous conditions support the assumption there are one main class of aryl-α- e β-glucosidases, aryl-α - e β-galactosidases and cellobiases, which are plasma membrane bound, and two classes of maltases, aminopeptidades, carboxypeptidases and dipeptidases. Maltases, occur in plasma membrane and in lysosomes (as a soluble enzyme) and the others are found in plasma membrane and cytosol. A succeful purification of caeca cells brush-borders by tecniques used for mammal enterocytes confirmed the assumptions based on differential centrifugation data. Treatment of purified microvilli with a hyperosmotic solution of Tris, followed by density gradient centrifugation, resulted in the separation of four membrane fractions and one fraction containing intact microvilli and, probably, isolated microfilaments. Electropherograms of the material recovered from the gradient showed differences among the membrane fractions, and they permitted to propose that actin is a major component of microvilli microfilaments. Enzymatic assays in the different fractions from the gradient confirmed the occurrence of cellobiase and carboxypeptidase plasma membrana bound. The results permite to propose that the majority of the terminal digestion of proteins and carbohydrates, with the exception of trehalose, occurs on the surface of the insect midgut caeca cells microvilli.

Os elementos de transposição são seqüências discretas que são capazes de mover- se de um lócus para outro, constituindo uma parte significante do genoma de eucariotos. São agrupados em duas classes principais, os elementos da Classe I, que se transpõem via um intermediário de RNA (retrotransposon), e os elementos da Classe II, que se transpõem via mecanismo de DNA do tipo corta e cola (transposon). A análise das seqüências de um banco de cDNA construído com RNA mensageiro da glândula salivar de Rhynchosciara americana mostrou a presença de representantes das duas classes de elementos. Nesse trabalho caracteriza-se quarto elementos de transposição tipo mariner, onde as seqüências consenso de nucleotídeos foram derivadas de múltiplas cópias defectivas contendo deleções, mudança no quadro de leitura e códons de terminação. Ramar1, um elemento full-length e Ramar2 um elemento defectivo que contém uma deleção na região interna da ORF da transposase, mas mantém e as extremidades intactas. Ramar3 e Ramar4 são elementos defectivos que apresentam muitas deleções no interior da ORF. As seqüências preditas das transposases demostraram que Ramar1 e Ramar2 estão filogeneticamente muito próximos dos elementos mariner da subfamília mauritiana. Enquanto, Ramar3 e Ramar4 pertencem às subfamílias mellifera e irritans, respectivamente. Hibridização in situ mostrou que Ramar1 localiza-se em muitas regiões do cromossomo, principalmente na heterocromatina pericentromérica, enquanto Ramar2 aparece em uma única banda no cromossomo A. Resultado ainda mais curioso foi a caracterização molecular de um elemento de retrotransposição, denominado RaTART, que provavelmente é o responsável pela reconstituição telomérica em R.americana, assim como os elementos TART, HeT-A e TAHRE de Drosophila. Experimentos de Southern Blots do retroelemento RaTART indicam que este está representado por seqüências repetidas no genoma de R.americana, enquanto que Northern Blots mostraram uma expressão em diferentes estágios do desenvolvimento e o transcrito de alto peso molecular detectado representa o retrotransposon non-LTR inteiro. Enquanto a localização cromossômica de RaTART por hibridização in situ mostrou uma marcação predominante nas extremidades dos cromossomos, indicando possivelmente o primeiro elemento de transposição descrito em R.americana com função definida na estrutura do cromossomo. O último retrotransposon, identificado nesse projeto, presente no genoma de R.americana, denominado R2Ra, foi isolado a partir de uma varredura em um banco genômico construído no bacteriófago lambda dash usando como sonda o recombinante pRa1.4 que contém a unidade de repetição do rDNA. A análise da seqüência mostrou a presença de regiões conservadas, como o domínio de transcriptase reversa e o motivo zinc finger na região amino-terminal. O sítio de inserção no gene 28S do rDNA é altamente conservado em R.americana e a análise filogenética mostrou que este elemento pertence ao grupo R2. A localização cromossômica confirma que o elemento móvel R2Ra se insere em um sítio específico no gene rDNA. / Transposable elements are discrete sequences that are able to move from one locus to another within the genome, constituting a significant part of eukaryotic genome. They are grouped into two main types, Class I elements transpose via an RNA intermediate (retrotransposon), and Class II elements transpose via a DNA \"cut-and-paste\" mechanism (transposons). The analysis of sequences of a cDNA bank constructed from mRNA of the salivary glands of Rhynchosciara americana showed the presence of putative types of two classes elements. In the present thesis we describe four mariner elements, where the nucleotides consensus sequences were derived from multiple defective copies containing deletions, frame shifts and stop codons. Ramar1, a full-length element and Ramar2 is a defective mariner element that contains a deletion overlapping most of the internal region of the transposase ORF and the extremities of the element maintain intact. Ramar3 e Ramar4 are defective mariner element that were impossible to predict a complete ORF. Predicted transposase sequences demonstrated that Ramar1 and Ramar2 are phylogenetically very close to mariner-like elements of mauritiana subfamily. However, Ramar3 and Ramar4 belong to mellifera and irritans subfamilies, respectively. In situ hybridisations showed Ramar1 localized in several chromosome regions, mainly in pericentromeric heterochromatin and their boundaries, while Ramar2 appeared as a single band in chromosome A. More interesting data were the molecular characterization of the non-LTR retrotransposon element, called as RaTART, that probably is the responsible by telomeric reconstruction in R.americana, as well as the telomeric retrotransposable elements TART, Het-A and TAHRE of Drosophila. Southern blot analysis indicated that this transposable element is represented by repeat sequences in the genome of R. americana, and Northern blot analysis showed a expression in different developmental stages and the transcript of high molecular mass detected represents the full-length non-LTR retrotransposon. However, the chromosomal localization of the retroelement by in situ hybridisation showed a labelling predominant on chromosome ends, indicating possibly the first transposable element described in R.americana with a defined role in chromosome structure. The last retrotransposon, identified in this project, present in the genome of Rhynchosciara americana, called R2Ra, was isolated from screening of a lambda dash genomic library using as probe the recombinant pRa1.4 of rDNA. The analysis of sequence showed the presence of conserved regions, like transcriptase reverse domain and zinc finger motif in the amino terminal region. The insertion site is high conserved in R.americana and a phylogenetic analysis showed that this element belongs to the R2 clade. The chromosomal localization confirm that the R2Ra mobile element insert into the site specific in rDNA gene.

Este trabalho teve por objetivo esclarecer a identidade de duas espécies próximas a Doryctobracon areolatus (Szépligeti) e de uma relacionada a Opius bellus Gahan, mencionada na literatura nacional como Opius sp. aff. bellus, por meio da morfometria geométrica e da análise das regiões do ITS2 do rDNA e 28S rDNA D2. As medidas das asas de D. areolatus, Doryctobracon sp. 1 e Doryctobracon sp. 2, O. bellus e Opius sp. aff. bellus, provenientes de diversas localidades brasileiras, foram estudadas por meio da morfometria geométrica. A avaliação de 20 pontos anatômicos nas asas, por meio de análise multivariada revelou a existência de variabilidade interpopulacional em 11 populações de D. areolatus, provenientes de localidades das cinco regiões brasileiras. O estudo morfométrico ainda revelou que Doryctobracon sp. 1 (estigma claro) e Doryctobracon sp. 2 (estigma escuro) diferem entre si e também de D. areolatus (Szépligeti). No entanto, entre os espécimes de O. bellus Gahan e Opius sp. aff. bellus, os resultados apontaram a coespecificidade desses indivíduos. Com base no tamanho do centróide, os resultados apontam a existência de dimorfismo sexual em relação ao tamanho das asas, ou seja, as fêmeas possuem asas relativamente maiores que as dos machos. Nas análises moleculares, os resultados indicaram a ocorrência de variabilidade intraespecífica, com relação ao tamanho do fragmento entre as populações de D. areolatus provenientes dos estados do AP, SP, GO e TO com a utilização dos dois marcadores moleculares (ITS2 e 28S rDNA D2). Porém, entre os espécimes de Doryctobracon sp. 1 (estigma claro) e de Doryctobracon sp. 2 (estigma escuro), essas regiões não variaram quanto ao tamanho, mas diferiram na composição das sequências, revelando que correspondem realmente a duas espécies. Portanto, houve congruência entre os resultados morfométricos e moleculares para essas espécies de Doryctobracon. Entre os espécimes identificados como Opius bellus e Opius sp. aff. bellus, a região do ITS2 indicou a ocorrência de variabilidade intrapopulacional, semelhante à interpopulacional, com elevada similaridade entre as morfoespécies analisadas. No entanto, a região do 28S rDNA D2 apresentou elevada similaridade entre as sequências obtidas, fortalecendo as indicações de que os espécimes considerados como O. bellus Gahan e Opius sp. aff. bellus, na realidade, pertencem à uma única espécie, conclusão também sustentada pelas análises morfométricas. / This study aimed to elucidate the identity of two-closely related species of Doryctobracon areolatus (Szépligeti) and a closely related species of Opius bellus Gahan, commonly referred to as Opius sp. aff. bellus, by using geometric morphometry and molecular analysis (ITS2 rDNA and 28S rDNA D2 regions). The analysis based on 20 landmarks through the multivariate analysis (CVA) revealed the existence of interpopulation variability in the wing morphology of 11 populations of D. areolatus, from five Brazilian regions. The morphometric study also showed that specimens of Doryctobracon sp. 1 (clear stigma) and Doryctobracon sp. 2 (dark stigma) were distinct between themselves and also from D. areolatus (Szépligeti). However, specimens of O. bellus Gahan and Opius sp. aff. bellus were found to be cospecifics. Analysis based on the centroid size indicated the existence of sexual dimorphism in relation to the size of the wings, ie, females had relatively larger wings than males. The molecular analysis indicated intraspecific variability in the size of the fragment between populations of D. areolatus from Amapá, São Paulo, Goiás and Tocantins states for both of the molecular markers used (ITS2 and 28S D2 rDNA). But these markers had similar sizes for Doryctobracon sp. 1 (stigma clearly) and Doryctobracon sp. 2 (dark stigma), with a very different base composition, indicating the existence of two distinctive species. Both molecular and morphometric analysis gave similar results. Among the specimens identified as Opius bellus and Opius sp. aff. bellus, analysis of the ITS2 region indicated the intrapopulation variability was similar to the interpopulation, with high similarity between the morphospecies analyzed. However, the region of the 28S D2 rDNA showed high similarity between the sequences obtained, reinforcing the indication that the specimens taken as O. bellus Gahan and Opius sp. aff. bellus in fact, belong to the same species, which was also supported by morphometric analysis.

Este trabalho teve por objetivo esclarecer a identidade de duas espécies próximas a Doryctobracon areolatus (Szépligeti) e de uma relacionada a Opius bellus Gahan, mencionada na literatura nacional como Opius sp. aff. bellus, por meio da morfometria geométrica e da análise das regiões do ITS2 do rDNA e 28S rDNA D2. As medidas das asas de D. areolatus, Doryctobracon sp. 1 e Doryctobracon sp. 2, O. bellus e Opius sp. aff. bellus, provenientes de diversas localidades brasileiras, foram estudadas por meio da morfometria geométrica. A avaliação de 20 pontos anatômicos nas asas, por meio de análise multivariada revelou a existência de variabilidade interpopulacional em 11 populações de D. areolatus, provenientes de localidades das cinco regiões brasileiras. O estudo morfométrico ainda revelou que Doryctobracon sp. 1 (estigma claro) e Doryctobracon sp. 2 (estigma escuro) diferem entre si e também de D. areolatus (Szépligeti). No entanto, entre os espécimes de O. bellus Gahan e Opius sp. aff. bellus, os resultados apontaram a coespecificidade desses indivíduos. Com base no tamanho do centróide, os resultados apontam a existência de dimorfismo sexual em relação ao tamanho das asas, ou seja, as fêmeas possuem asas relativamente maiores que as dos machos. Nas análises moleculares, os resultados indicaram a ocorrência de variabilidade intraespecífica, com relação ao tamanho do fragmento entre as populações de D. areolatus provenientes dos estados do AP, SP, GO e TO com a utilização dos dois marcadores moleculares (ITS2 e 28S rDNA D2). Porém, entre os espécimes de Doryctobracon sp. 1 (estigma claro) e de Doryctobracon sp. 2 (estigma escuro), essas regiões não variaram quanto ao tamanho, mas diferiram na composição das sequências, revelando que correspondem realmente a duas espécies. Portanto, houve congruência entre os resultados morfométricos e moleculares para essas espécies de Doryctobracon. Entre os espécimes identificados como Opius bellus e Opius sp. aff. bellus, a região do ITS2 indicou a ocorrência de variabilidade intrapopulacional, semelhante à interpopulacional, com elevada similaridade entre as morfoespécies analisadas. No entanto, a região do 28S rDNA D2 apresentou elevada similaridade entre as sequências obtidas, fortalecendo as indicações de que os espécimes considerados como O. bellus Gahan e Opius sp. aff. bellus, na realidade, pertencem à uma única espécie, conclusão também sustentada pelas análises morfométricas. / This study aimed to elucidate the identity of two-closely related species of Doryctobracon areolatus (Szépligeti) and a closely related species of Opius bellus Gahan, commonly referred to as Opius sp. aff. bellus, by using geometric morphometry and molecular analysis (ITS2 rDNA and 28S rDNA D2 regions). The analysis based on 20 landmarks through the multivariate analysis (CVA) revealed the existence of interpopulation variability in the wing morphology of 11 populations of D. areolatus, from five Brazilian regions. The morphometric study also showed that specimens of Doryctobracon sp. 1 (clear stigma) and Doryctobracon sp. 2 (dark stigma) were distinct between themselves and also from D. areolatus (Szépligeti). However, specimens of O. bellus Gahan and Opius sp. aff. bellus were found to be cospecifics. Analysis based on the centroid size indicated the existence of sexual dimorphism in relation to the size of the wings, ie, females had relatively larger wings than males. The molecular analysis indicated intraspecific variability in the size of the fragment between populations of D. areolatus from Amapá, São Paulo, Goiás and Tocantins states for both of the molecular markers used (ITS2 and 28S D2 rDNA). But these markers had similar sizes for Doryctobracon sp. 1 (stigma clearly) and Doryctobracon sp. 2 (dark stigma), with a very different base composition, indicating the existence of two distinctive species. Both molecular and morphometric analysis gave similar results. Among the specimens identified as Opius bellus and Opius sp. aff. bellus, analysis of the ITS2 region indicated the intrapopulation variability was similar to the interpopulation, with high similarity between the morphospecies analyzed. However, the region of the 28S D2 rDNA showed high similarity between the sequences obtained, reinforcing the indication that the specimens taken as O. bellus Gahan and Opius sp. aff. bellus in fact, belong to the same species, which was also supported by morphometric analysis.

Os elementos de transposição são seqüências discretas que são capazes de mover- se de um lócus para outro, constituindo uma parte significante do genoma de eucariotos. São agrupados em duas classes principais, os elementos da Classe I, que se transpõem via um intermediário de RNA (retrotransposon), e os elementos da Classe II, que se transpõem via mecanismo de DNA do tipo corta e cola (transposon). A análise das seqüências de um banco de cDNA construído com RNA mensageiro da glândula salivar de Rhynchosciara americana mostrou a presença de representantes das duas classes de elementos. Nesse trabalho caracteriza-se quarto elementos de transposição tipo mariner, onde as seqüências consenso de nucleotídeos foram derivadas de múltiplas cópias defectivas contendo deleções, mudança no quadro de leitura e códons de terminação. Ramar1, um elemento full-length e Ramar2 um elemento defectivo que contém uma deleção na região interna da ORF da transposase, mas mantém e as extremidades intactas. Ramar3 e Ramar4 são elementos defectivos que apresentam muitas deleções no interior da ORF. As seqüências preditas das transposases demostraram que Ramar1 e Ramar2 estão filogeneticamente muito próximos dos elementos mariner da subfamília mauritiana. Enquanto, Ramar3 e Ramar4 pertencem às subfamílias mellifera e irritans, respectivamente. Hibridização in situ mostrou que Ramar1 localiza-se em muitas regiões do cromossomo, principalmente na heterocromatina pericentromérica, enquanto Ramar2 aparece em uma única banda no cromossomo A. Resultado ainda mais curioso foi a caracterização molecular de um elemento de retrotransposição, denominado RaTART, que provavelmente é o responsável pela reconstituição telomérica em R.americana, assim como os elementos TART, HeT-A e TAHRE de Drosophila. Experimentos de Southern Blots do retroelemento RaTART indicam que este está representado por seqüências repetidas no genoma de R.americana, enquanto que Northern Blots mostraram uma expressão em diferentes estágios do desenvolvimento e o transcrito de alto peso molecular detectado representa o retrotransposon non-LTR inteiro. Enquanto a localização cromossômica de RaTART por hibridização in situ mostrou uma marcação predominante nas extremidades dos cromossomos, indicando possivelmente o primeiro elemento de transposição descrito em R.americana com função definida na estrutura do cromossomo. O último retrotransposon, identificado nesse projeto, presente no genoma de R.americana, denominado R2Ra, foi isolado a partir de uma varredura em um banco genômico construído no bacteriófago lambda dash usando como sonda o recombinante pRa1.4 que contém a unidade de repetição do rDNA. A análise da seqüência mostrou a presença de regiões conservadas, como o domínio de transcriptase reversa e o motivo zinc finger na região amino-terminal. O sítio de inserção no gene 28S do rDNA é altamente conservado em R.americana e a análise filogenética mostrou que este elemento pertence ao grupo R2. A localização cromossômica confirma que o elemento móvel R2Ra se insere em um sítio específico no gene rDNA. / Transposable elements are discrete sequences that are able to move from one locus to another within the genome, constituting a significant part of eukaryotic genome. They are grouped into two main types, Class I elements transpose via an RNA intermediate (retrotransposon), and Class II elements transpose via a DNA \"cut-and-paste\" mechanism (transposons). The analysis of sequences of a cDNA bank constructed from mRNA of the salivary glands of Rhynchosciara americana showed the presence of putative types of two classes elements. In the present thesis we describe four mariner elements, where the nucleotides consensus sequences were derived from multiple defective copies containing deletions, frame shifts and stop codons. Ramar1, a full-length element and Ramar2 is a defective mariner element that contains a deletion overlapping most of the internal region of the transposase ORF and the extremities of the element maintain intact. Ramar3 e Ramar4 are defective mariner element that were impossible to predict a complete ORF. Predicted transposase sequences demonstrated that Ramar1 and Ramar2 are phylogenetically very close to mariner-like elements of mauritiana subfamily. However, Ramar3 and Ramar4 belong to mellifera and irritans subfamilies, respectively. In situ hybridisations showed Ramar1 localized in several chromosome regions, mainly in pericentromeric heterochromatin and their boundaries, while Ramar2 appeared as a single band in chromosome A. More interesting data were the molecular characterization of the non-LTR retrotransposon element, called as RaTART, that probably is the responsible by telomeric reconstruction in R.americana, as well as the telomeric retrotransposable elements TART, Het-A and TAHRE of Drosophila. Southern blot analysis indicated that this transposable element is represented by repeat sequences in the genome of R. americana, and Northern blot analysis showed a expression in different developmental stages and the transcript of high molecular mass detected represents the full-length non-LTR retrotransposon. However, the chromosomal localization of the retroelement by in situ hybridisation showed a labelling predominant on chromosome ends, indicating possibly the first transposable element described in R.americana with a defined role in chromosome structure. The last retrotransposon, identified in this project, present in the genome of Rhynchosciara americana, called R2Ra, was isolated from screening of a lambda dash genomic library using as probe the recombinant pRa1.4 of rDNA. The analysis of sequence showed the presence of conserved regions, like transcriptase reverse domain and zinc finger motif in the amino terminal region. The insertion site is high conserved in R.americana and a phylogenetic analysis showed that this element belongs to the R2 clade. The chromosomal localization confirm that the R2Ra mobile element insert into the site specific in rDNA gene.

Um enfoque analítico, envolvendo centrifugação diferencial de homogeneizados de cecos gástricos de Rhynchosciara americana preparados em condições brandas e vigorosas, suporta a asserção de que existe uma classe principal de aril-α- e β -glicosidases, aril-α- e β-galactosidases e celobiases que é ligada à membrana plasmática, e duas classes de maltases, aminopeptidases, carboxipeptidases e dipeptidases. Maltases ocorrem na membrana plasmática e no interior de lisossomos na forma solúvel, enquanto que as peptidases (amino-carboxi- e dipeptidase) são encontradas na membrana plasmática e citossol. A ocorrência das enzimas citadas acima na membrana plasmática das células cecais, foi confirmada por resultados obtidos em preparações de microvilosidades realizadas com técnica desenvolvida para enterocito de mamíferos. O tratamento de microvilosidades com solução hiperosmótica de Tris, seguido de centrifugação em gradiente de densidade, permitiu a separação de quatro frações de membrana e de uma fração que contém microvilosidades intactas e, provavelmente, microfilamentos isolados. Eletroferogramas do material recolhido do gradiente mostrou diferenças entre as frações de membrana e sugeriu a ocorrência de actina como componente majoritário dos microfilamentos das microvilosidades. Ensaios enzimáticos nas diferentes frações do gradiente confirmaram a ocorrência de celobiase e carboxipeptidase ligadas à membrana plasmática. Os resultados de distribuição intracelular de hidrolases nos cecos de R. americana permitiram propor que a digestão terminal de proteínas ocorre na membrana plasmática e no citossol, por ação de amino-, carboxi- e dipeptidases, enquanto que a digestão de carboidratos, com exceção da trealose, ocorre somente na superfície das microvilosidades. / An analytical approach involving differencial centrifugation of Rhynchosciara Americana midgut caeca homogenates prepared in mild and in vigorous conditions support the assumption there are one main class of aryl-α- e β-glucosidases, aryl-α - e β-galactosidases and cellobiases, which are plasma membrane bound, and two classes of maltases, aminopeptidades, carboxypeptidases and dipeptidases. Maltases, occur in plasma membrane and in lysosomes (as a soluble enzyme) and the others are found in plasma membrane and cytosol. A succeful purification of caeca cells brush-borders by tecniques used for mammal enterocytes confirmed the assumptions based on differential centrifugation data. Treatment of purified microvilli with a hyperosmotic solution of Tris, followed by density gradient centrifugation, resulted in the separation of four membrane fractions and one fraction containing intact microvilli and, probably, isolated microfilaments. Electropherograms of the material recovered from the gradient showed differences among the membrane fractions, and they permitted to propose that actin is a major component of microvilli microfilaments. Enzymatic assays in the different fractions from the gradient confirmed the occurrence of cellobiase and carboxypeptidase plasma membrana bound. The results permite to propose that the majority of the terminal digestion of proteins and carbohydrates, with the exception of trehalose, occurs on the surface of the insect midgut caeca cells microvilli.

Historically, terrestrial food web research has focused on describing the structure of aboveground grazing webs, and determining how interactions among plants, herbivores and higher trophic levels influence primary productivity. Detrital food webs however, play a significant role in regulation of ecosystem dynamics through direct impacts on decomposition. Unraveling the complex nature of detrital food web structure is critical to developing a better understanding of ecosystem function. Therefore the primary objective of this research was to describe the structure of the leaf-litter food web in a temperate deciduous forest, with emphasis on interactions between a community of generalist predators, the forest-floor spiders, and arthropod prey. Elucidating occurrence of trophic interactions in the forest-floor food web was a formidable task due to the high diversity, small body sizes and cryptic habits of many litter-dwelling arthropods. Analysis of natural variation in consumer stable isotope ratios (δ13C and δ15N) formed the crux of this research because it simultaneously permitted quantification of the trophic positions of litterdwelling arthropods and identification of spider resources, including prey subsidies from the grazing web. A monoclonal antibody-based ELISA was employed to analyze the gut contents of spiders to quantify predation on a major arthropod taxon, the forest-floor flies. Surveys of spider distributions and prey availability in the litter layer also provided fundamental knowledge of community structure. Stable isotope analyses suggested that most spiders exhibited strong trophic connections to the detrital web, but weak links to herbivorous prey. Several lines of evidence supported a strong trophic link between large, litterdwelling collembolans (Tomoceridae) and cursorial spiders, including correlation between spider and tomocerid densities on the forest-floor, similarities in spider and tomocerid carbon signatures, and nitrogen enrichment of tomocerids relative to other prey types. Conversely, this research provided conflicting evidence regarding spider consumption of flies. Gut content assays indicated consistent predation on flies by cursorial spiders, while stable isotope models suggested that flies are likely of little importance in the spiders’ diets. This project yielded valuable insights into the role of spiders in the forest-floor food web and the potential importance of species-specific variation in prey consumption for detrital food web dynamics.