Actuellement, plus de soixante-dix dystrophies musculaires différentes ont été caractérisées cliniquement. La pathogenèse des différents types de dystrophies musculaire implique de nombreuses voies biologiques et s'accompagne d'une grande variabilité de signes cliniques, mais toutes ces dystrophies ont une caractéristique commune : la perte progressive des fibres musculaires. Pour les formes plus communes de ces dystrophies musculaires, les stratégies thérapeutiques visent principalement à restaurer la fonction du gène altéré. Bien que ces stratégies soient encourageantes pour un grand nombre de patients, elles ne peuvent être retenues comme traitement universel pour l'ensemble des dystrophies musculaires. L'identification de voies biologiques et de défauts secondaires communs à des dystrophies musculaires représente un intérêt majeur pour le développement de traitements palliatifs généralistes applicables à un large éventail de dystrophies musculaires. Pendant mes travaux de doctorat, j'ai initié une étude comparative approfondie sur dix-sept mutants différents chez le nématode Caenorhabditis elegans présentant une dégénérescence musculaire progressive, dont sept sont des modèles de dystrophies musculaires chez le nématode. La recherche de voies biologiques et de défauts secondaires communs, nous a permis d'établir différentes classes de dégénérescence musculaire chez le nématode et de révéler l'existence d'au moins deux mécanismes subcellulaires différents. De plus, nos résultats démontrent que des perturbations de la voie autophagique semblent systématiquement associées à la dégénérescence musculaire. Enfin, ce travail aboutit sur l'établissement d'un modèle proposant une chronologie des évènements sub-cellulaires menant à la dégénérescence progressive dystrophine-dépendante / Currently, more than sevently different muscular dystrophies have been clinically characterized. The pathogenesis of these different types of muscular dystrophies involves numerous cellular pathways and leads to a large variability of the clinical features. However, all the muscular dystrophies share a common feature: the progressive muscle cell loss. For the most common forms of muscular dystrophies, therapeutic strategies consist in restoring the function of the affected gene. Even if these strategies are encouraging for a lot of patients, they cannot be used as a universal treatment for all the muscular dystrophies. The identification if common pathways or common secondary defects to different muscular dystrophies is of great interest for the discovery of new palliative treatment, able to decrease the pathology of a large panel of muscular dystrophies. I have initiated a comparative analysis of seventeen C. elegans mutants presenting with muscle degeneration. Seven these mutants are considered as models for muscular dystrophies. Thanks to these comparative analysis, we were able to define different classes of muscle degeneration in C. elegans and to reveal the existence of at leats two different pathways. Moreover, our results show that perturbations in the autophagic pathway are systematically associated with muscle degeneration. This study leads to the establishment of a putative chronology of events occurring before the muscle cell loss, during the dystrophin-dependent degeneration process

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie neuromusculaire la plus fréquente de l'enfant. Son évolution progressive inexorable conduit habituellement au décès dans la troisième décade. La DMD constitue cependant une affection hétérogène pour la sévérité de l'atteinte musculaire, cognitive et cardiaque, et cette hétérogénéité n'est pas totalement expliquée par la localisation des mutations dans le gène de la dystrophine. Ma thèse comporte trois volets: (1) une analyse clinique multivariée d'une cohorte de DMD suivie à long terme qui nous a permis de définir 4 phénotypes distincts de DMD; (2) une étude de corrélation clinico-pathologique qui a identifié la fibrose endomysiale précoce comme seul facteur histologique prédictif de sévérité motrice; (3) la mise au point d'un modèle murin original de myofibrose dystrophique chez la souris mdx déficiente en dystrophine. 1- Étude multiparamétrique clinique. La saisie par la même équipe des données fonctionnelles musculaires, cardiaques, respiratoires et cognitives de 75 patients atteints de DMD (tous génotypés et présentant une absence complète de dystrophine musculaire), suivis pendant &gt;10 ans, a permis d'établir un modèle multiparamétrique satisfaisant à deux dimensions principales, cognitive et motrice, et de définir 4 clusters phénotypiques : (i) DMD cognitive et motrice congénitale (20%), (ii) DMD classique (28%), (iii) DMD motrice pure modérée (22%), (iv) DMD motrice pure sévère (30%). La corrélation génotypephénotype était restreinte à la seule atteinte cognitive. Des indicateurs pronostics précoce ont été identifiés et validés sur une 2ème série de 34 patients. 2- Étude histopathologique. Les variations de sévérité de l'atteinte musculaire n'étant pas expliquées par la génétique moléculaire, nous avons cherché à corréler les paramètres moteurs et la biopsie musculaire prélevée dans le quadriceps à un stade précoce (3-7 ans) chez 25 patients (analyse stéréologique des images numérisées pour les paramètres élémentaires: nécrose/régénération, fibres hypercontractées, adipocytes, fibrose endomysiale et périmysiale). Seule la fibrose endomysiale était associée à un pronostic moteur défavorable (p&lt;0.002) attesté par l'âge de perte de marche, la force du quadriceps et le testing musculaire global à 10 ans. Cette fibrose endomysiale dissociait les capillaires des myofibres (écartement x 2.5), et s'accompagnait d'une augmentation sélective des macrophages CD206+ activés dans la voie alterne (M2) et d'une diminution relative des cellules satellites musculaires (p&lt;0.0001). Ces données suggèrent un rôle clé de la fibrose endomysiale (et des macrophages M2 profibrosant) et dans la sévérité clinique de la DMD. 3- Étude expérimentale. Ces éléments rendent nécessaire la mise au point d'un modèle expérimental de myofibrose dystrophique, la souris mdx présentant peu de fibrose et un déficit moteur modéré et tardif. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de lésion musculaire focale profibrosante du tibialis antérieur chez la souris mdx (piqûres multiples quotidiennes pendant 15 jours). Une fibrose endomysiale attestée par un fort immunomarquage du collagène I (à 8, 30, 60 et 90 jours) a été quantifiée et corrélée à la perte de la force musculaire dans la patte lésée (comparée au muscle contralatéral). Ces résultats légitiment et préparent les futures stratégies thérapeutiques "anti-fibrosantes" dans la DMD</abstract> / The clinical heterogeneity of Duchenne muscular dystrophy (DMD) may prove a major obstacle to the interpretation of therapeutic trials but has not been subjected to systematic analysis. In a first part, we present a statistical analysis on two series of steroid-free patients with complete lack of dystrophin determined by Western blot. Series 1 consisting of 75 patients longitudinally evaluated for motor, respiratory, cardiac and cognitive functions by the same team (median follow-up: 10.5yrs) was subjected to exploratory data analysis whose main conclusion were confirmed by exploration of data obtained from 34 routinely evaluated patients (series 2). Main outcome measures were age at loss of ambulation and of onset of contractures, manual muscle testing (MMT), cardiac and respiratory functional tests, general intelligence assessment (IQ), educational level. Multivariate exploratory analysis of series 1 classified 70/75 patients into 4 clusters with distinctive intellectual and motor outcomes: A (congenital DMD, 20%): markedly poor intellectual and motor outcome; B (classical DMD, 28%): intermediate intellectual and poor motor outcome; C (moderate pure motor DMD, 22%): normal intelligence and delayed motor impairment; and D (severe pure motor DMD, 30%): normal intelligence and poor motor outcome. Group A patients had the most severe respiratory and cardiac involvement. Frequency of mutations upstream to exon 30 increased from group A to D, but genotype/phenotype correlations were restricted to cognition. Diagnostic accuracy tests showed that combination of "clinical onset &lt;2yrs" with "mental retardation" reliably assigned patients to group A (sensitivity 0.93, specificity 0.98). Combination of "lower limb MMT score&gt;6 at 8yrs" with "normal or borderline mental status" reliably assigned patients to group C (sensitivity: 1, specificity: 0.94). These early criteria were also predictive of "congenital DMD" and "moderate pure motor DMD" in series 2. In a second part, we included 25 steroid-free DMD patients in a multiparametric analysis plotting initial histological alterations in quadriceps muscle with 13 relevant clinical data collected by the same team over a long-term follow-up (mean&gt;10yrs). Elementary histological parameters (fiber size, hypercontracted fibers, necrotic/basophilic fibers, edema, endomysial and perimysial fibrosis, and fatty degeneration) were assessed by morphometry. Endomysial fibrosis was the sole myopathological parameter significantly correlated with poor motor outcome, assessed by quadriceps muscle strength, manual muscle testing of upper and lower limbs at 10yrs, and age at ambulation loss (all p&lt;0.002). Motor outcome and fibrosis were not correlated with genotype. Myofibers exhibited oxidative stress-induced protein alterations and became separated from capillaries by fibrosis, which was associated with both increase of CD206+ alternatively activated macrophages and relative decrease of CD56+ satellite cells (both p&lt;0.0001). This study provides firm basis for antifibrotic therapeutic strategies in DMD, and supports the view that alternatively activated macrophages, known to inhibit myogenesis while promoting collagen-producing cell formation, play a key role in myofibrosis. In the third experimental part, experiments were conducted on mdx mice at 6-8 weeks of age. Fifteen micropunctures were made daily in the right tibialis anterior (TA) muscle with micropins used for entomology (150 µm diameter) during 2 weeks. Our data suggest that repeated microinjuries of muscle deficient in dystrophin protein triggers a endomysial fibrotic process that stabilizes with time well associated with muscle strenght decrease. Endomysial fibrosis seems to be one of the target of therapy in DMD. This satisfactory model will be usefull to study the mechanisms of fibrosis process in dystrophin deficient muscle and to evaluate antifibrotic treatment

Les mutations du gène LMNA, codant les lamines A/C, des protéines ubiquitaires de l'enveloppe nucléaire, sont responsables de formes autosomiques de dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss (EDMD), pathologie associant une atteinte des muscles squelettiques et une cardiomyopathie dilatée (DCM) avec troubles rythmiques et/ou conductifs. Lors de ma thèse j'ai analysé le phénotype musculaire et cardiaque de souris LmnaΔK32/+ (Het), mutation identifiée chez des patients présentant une EDMD sévère. Les souris Het n'ont pas d'atteinte musculaire mais développent une DCM conduisant au décès entre l'âge de 35 et 7O semaines. Le niveau de lamines A/C est diminué de 50% dans le cœur des souris Het avant et au début de la DCM mais similaire aux Wt chez les souris Het souffrant de DCM. La diminution de la quantité de lamines A/C est liée à leur dégradation par le système ubiquitine-protéasome (UPS) dont la fonction est altérée dans le cœur des souris Het, conduisant à l'augmentation de la quantité de lamines K32 avec l'âge. In vitro, l'accumulation des lamines A/C K32 conduit à leur agrégation nucléaire, suggérant un effet dominant négatif de ces protéines mutées. Pour conclure, la souris LmnaΔK32/+ est le premier modèle murin porteur d'une mutation du gène Lmna qui développe une cardiomyopathie isolée à l'état hétérozygote. L'UPS joue un rôle important dans la dégradation des lamines A/C mutées, limitant leur effet délétère. Les mécanismes physiopathologiques à l'origine de la DCM chez les souris Het sont donc doubles : à l'haploinsuffisance des lamines A/C, connue comme préjudiciable pour le cœur, s'ajoute un effet poison des lamines mutées augmentant avec la dysfonction de l'UPS

La jonction myotendineuse (JMT) est une interface spécialisée dans la transmission des forces entre le muscle et le tendon. Le collagène XXII (COLXXII) est un nouveau composant de cette jonction (Koch et al., 2004). COLXXII fait partie de la sous-famille des FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) qui se caractérisent par leur capacité à s'associer aux collagènes fibrillaires pour former des réseaux protéiques. La fonction de ce nouveau composant de la JMT n'est pas connue. C'est pourquoi nous avons décidé de réaliser une perte de fonction chez le poisson zèbre en utilisant la stratégie anti-sens morpholinos et d'en étudier le phénotype par différentes techniques. Chez l'embryon, le COLXXII est exprimé aux extrémités des fibres musculaires au niveau de leur ancrage sur le myosepte (structure équivalente au tendon des mammifères) pour être déposé à la JMT. Son expression est régulée par des membres de la famille des FGF, probablement FGF8. L'absence de COLXXII conduit à une perte des capacités contractiles du muscle et au détachement et à la rétractation progressive des fibres musculaires, causés par une rupture de la JMT qui s'opère entre la lame basale des fibres musculaires et la matrice tendineuse. Le morphotype induit par l'injection de morpholino COLXXII phénocopie les mutants sapje (mutant dystrophine) et candyfloss (mutation de la chaîne α2 des laminines) indiquant que COLXXII permet un lien structural entre le muscle et le tendon. Nos résultats montrent que COLXXII joue un rôle crucial dans le développement et la fonction de la JMT et représente un nouveau gène candidat pour les dystrophies musculaires.

Les patients atteints de dystrophies musculaires présentent de plus en plus fréquemment des complications cardiaques, qui sont majoritairement des cardiomyopathies dilatées (CMD), et qui déterminent leur pronostic vital. Dans ce contexte, les traitements de l'atteinte cardiaque sont ceux de l'insuffisance cardiaque, qui agissent sur l'environnement fonctionnel du cœur, mais pas directement sur l'atteinte myocardique.<br /> L'objectif de cette thèse a été d'évaluer les effets d'un traitement novateur de la CMD dans les dystrophies musculaires, en utilisant le hamster de la lignée CHF147. La démarche proposée est d'induire un phénomène compensateur de la dilatation cardiaque et ainsi d'améliorer le pronostic vital, en utilisant les propriétés de l'Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1).<br /> Des hamsters CHF147 jeunes ont été traités pendant un temps court, de façon systémique avec la protéine recombinante IGF-1 (rhIGF-1) à faible dose. Les effets macroscopiques, histologiques et fonctionnels du traitement ont été évalués 35 jours après le début de celui-ci et les voies de signalisation impliquées dans l'induction des effets observés ont été étudiées. Une étude de survie a été réalisée afin de mesurer les effets du traitement à long terme. L'évaluation des effets à court terme de l'administration de rhIGF-1 sur la CMD du hamster CHF147 indique un ralentissement de la dilatation des cavités cardiaques ainsi que de l'extension de la fibrose myocardique, et une préservation de multiples paramètres fonctionnels, tels que le débit cardiaque, le volume d'éjection, la pression de fin de diastole et, en particulier, la contractilité myocardique. Les effets observés sont dus en partie à des modifications au niveau des protéines impliquées dans le cycle du calcium. A long terme, la survie des hamsters CHF147 traités augmente significativement d'environ 20% et est associée à une préservation partielle de la fonction cardiaque.<br />Toutefois, une augmentation du niveau sérique d'IGF-1 pourrait augmenter le risque d'effets secondaires délétères. Afin de limiter les effets systémiques d'IGF-1 et de cibler son administration au cœur, nous avons injecté localement le plasmide pCMV-IGF1 codant pour l'IGF-1 dans le myocarde des hamsters CHF147. Les effets du traitement ont été évalués après 35 jours et montrent des résultats comparables à ceux obtenus avec la protéine rhIGF-1.<br />En conclusion, ce travail de thèse a montré qu'un traitement basé sur IGF-1 permet de ralentir l'évolution de la CMD des hamsters CHF147, en préservant la structure et la fonction cardiaques, et d'améliorer significativement leur survie. IGF-1 semble donc être un candidat prometteur pour la mise au point d'une approche par thérapie génique dans l'insuffisance cardiaque, due à une CMD, dans le contexte des dystrophies musculaires.

Les dystrophies musculaires des ceintures (ou limb-girdle muscular dystrophy, LGMD) sont un groupe hétérogène de dystrophies musculaires chez l’adulte et sont définies par une atrophie et une faiblesse progressive qui surviennent dans les muscles proximaux. Chez une cohorte canadienne-française, nous avons précédemment décrit une nouvelle forme récessive, désignée LGMD2L et marquée par une atrophie asymétrique du quadriceps, que nous avions cartographiée au chromosome 11p12-p13 grâce à des analyses de liaison. L’objectif de ce projet de thèse était de raffiner l’intervalle candidat, puis d’identifier et de caractériser le gène muté responsable de la LGMD2L. Grâce à une cartographie par homozygotie de polymorphismes de nucléotide simple (SNPs) réalisée sur une grande famille consanguine, nous avons redéfini l’intervalle candidat à une région du chromosome 11p14.3-p15.1. Par séquençage de l’ADN génomique et complémentaire au gène Anoctamine 5 (ANO5) inclus dans cet intervalle, nous avons identifié trois mutations, chez autant de familles: une substitution créant un site d’épissage aberrant, une insertion d’un nucléotide et une mutation faux-sens. Les deux premières mutations étaient associées à une hausse de la dégradation de l’ARN messager médiée par une troncation prématurée. Nous avons également identifié des mutations ANO5 chez une seconde dystrophie musculaire de type distal cartographiant au même locus que la LGMD2L, nommée MMD3, et dont la manifestation initiale était une faiblesse des mollets, mais qui pouvait progresser vers une atrophie des quadriceps. Une réparation membranaire défective avait été observée chez les fibroblastes de deux patients MMD3, suggérant un rôle pour ANO5 dans ce mécanisme. La localisation et la fonction d’ANO5 dans le muscle sont inconnues, mais cette protéine fait partie d’une famille conservée de protéines à huit domaines transmembranaires, les Anoctamines, dont certains membres sont des transporteurs chloriques activés par le calcium. Les résultats de nos études d’immunofluorescence suggèrent qu’ANO5 se localise peu au sarcolemme, mais plutôt à une structure intracellulaire qui suit la ligne Z des myofibrilles. De façon étonnante, cette localisation était préservée chez un patient LGMD2L porteur homozygote de la mutation d’épissage, en dépit du fait que cette dernière était considérée comme une mutation nulle. Néanmoins, nous avons identifié un épissage alternatif de l’exon 15 qui se produisait sur une proportion des transcrits porteurs de la mutation d’épissage, ce qui rétablirait le cadre de lecture, soulignant la complexité de la régulation de l’épissage d’ANO5 et laissant croire que la LGMD2L pourrait être causée par une perte de fonction partielle, et non complète, d’ANO5. Des études subséquentes par des groupes européens ont montré que les anoctaminopathies 5 sont une cause fréquente de dystrophies musculaires des ceintures chez l’adulte. Notre découverte de mutations au gène Anoctamine 5 a mis en évidence une nouvelle classe de protéines importantes pour la biologie du muscle et a ouvert la voie à de nouvelles pistes pour étudier les mécanismes par lesquels un défaut de réparation membranaire progresse en une dystrophie musculaire. / Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) encompass a broad spectrum of muscular dystrophies in which the initial weakness arises in proximal muscles. We previously described in French-Canadian (FC) families a new form of LGMD characterized by asymmetrical quadriceps femoris atrophy, named LGMD2L, which we mapped to chromosome 11p12-p13 using linkage analyses. The objectives of this thesis project were to refine the candidate interval, identify and characterize the LGMD2L gene. Using single nucleotide polymorphisms (SNPs) homozygosity mapping in a large consanguineous family, we narrowed down the LGMD2L candidate interval to a region on chromosome 11p14.3-p15.1, and identified three mutations in the Anoctamin 5 (ANO5) gene located in the interval. These mutations consisted of a missense, a one-bp duplication and a splice site mutation. We demonstrated that the latter two triggered the nonsense-mediated RNA decay pathway. In addition, we identified ANO5 mutations in cases affected by a non-dysferlin Miyoshi muscular dystrophy mapped also to chromosome 11, termed MMD3. In two MMD3 families of European descent, patients presented with calf weakness as the initial symptoms, sometimes evolving to quadriceps atrophy. Fibroblasts from one MMD3 family were shown to be defective for membrane repair. ANO5 localization and function in muscle are unknown, but it is a member of the conserved Anoctamin family of proteins with eight transmembrane domains, of which some function as calcium-activated chloride channel. Our immunofluorescence studies on longitudinal muscle sections suggest that ANO5 is not importantly localized to the sarcolemma, but rather to a structure following the Z-line. To our surprise, this localization was preserved for a LGMD2L patient homozygous for the splice site mutation, previously considered as a null mutation. By studying the splicing isoforms in this patient, we observed that skipping of exon 15 occurs on a proportion of transcripts, in addition to the aberrant splicing caused by the mutation. This alternative splicing event would recover the reading frame, thus underlining the complexity of ANO5 splicing and suggesting that LGMD2L could be the consequence of a partial, rather than complete, loss-of-function. Subsequent studies by other groups have shown that anoctaminopathies 5 are a common cause of adult-onset LGMD. Our discovery of ANO5 mutations has shed light on a new class of proteins important for the muscle biology and opened new research avenues to study how defective membrane repair progresses into muscular dystrophies.

La dystrophie musculaire facioscapulohumérale (FSHD) est la troisième myopathie la plus fréquente en Europe. La maladie atteint progressivement les muscles du visage, des bras et des jambes. Les symptômes apparaissent dans la majorité des cas avant 20 ans et la maladie, souvent douloureuse, provoque fréquemment un handicap majeur qui nécessite de se déplacer en fauteuil roulant. J'ai démontré que la protéine KLF15 est surexprimée dans les tissus des patients FSHD et dans les myoblastes cultivés in vitro et prélevés sur des patients FSHD. Des résultats préliminaires indiquent que la surexpression du facteur KLF15 pourrait être expliquée par le stress oxydant induit par DUX4 et la surexpression de certains facteurs de myogenèse induits par DUX4c. J'ai démontré que KLF15 interagit directement avec les répétitions D4Z4 et contrôle leur fonction d'activation de transcription. Ainsi KLF15 sert de médiateur entre les répétitions D4Z4 et deux gènes dans la région 4q35: FRG2 et DUX4c ce que explique la surexpression de ces deux gènes dans la FSHD. La surexpression du gène DUX4c, homologue du DUX4, perturbe le programme de différentiation musculaire en activant certains facteurs de myogenèse (myomiRs ou microRNAs myogéniques). En somme, la découverte du rôle du facteur KLF15 dans la FSHD met en évidence une boucle de rétrocontrôle positif qui relie la surexpression du facteur KLF15 avec la surexpression des gènes codés dans la région 4q35. Le rôle central du facteur KLF15 dans ce nouveau modèle de la maladie permet d'envisager une nouvelle piste thérapeutique pour la dystrophie FSHD basé sur l'inhibition du facteur KLF15.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la conséquence de la perte de la dystrophine, une protéine cytosquelettique indispensable au maintien mécanique et fonctionnel du sarcolemme. Notre équipe a largement étudié les entrées cationiques dans les lignées murines et a montré : 1- une augmentation anormale des influx dépendant des stocks calciques (SOCE) dans les myotubes (MT) déficients en dystrophine (dys-), 2- que les influx SOCE sont médiés par les canaux TRPC1 et TRPC4, 3- que la dérégulation des SOCE dans les MT dys- est corrigée grâce à la surexpression de l'α1-syntrophine. Au jour d'aujourd’hui, il existe peu d'éléments dans la littérature quant à la caractérisation des entrées SOCEs dans les cellules musculaires humaines et dans la DMD. Ce travail de thèse s'articule autour de deux parties : Le modèle murin, dans lequel nous avons montré un rôle indispensable de STIM1 et Orai1 dans la mise en place des entrées SOCEs et l'implication de la voie Ca2+/PLC/PKC dans l'augmentation anormale de ces entrées dans les MT murins dys-. Le modèle humain primaire, dans lequel nous avons mis en évidence : 1- une augmentation anormale des influx SOCEs dans les MT DMD et établit le profil d'expression des différentes protéines nécessaires à la mise en place de ces entrées ; 2- l'implication de la voie Ca2+/PLC/PKC dans la dérégulation des SOCEs dans les MT humains DMD et le rôle de l'α1-syntrophine dans la régulation de ces entrées dans les MT humains ; 3- la dérégulation de l'homéostasie calcique dans la DMD qui se produit par l'intermédiaire des entrées cationiques dépendantes de TRPV2 dans les cellules musculaires dystrophiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the consequence of the loss of dystrophin, a cytoskeletal protein essential for the mechanical and functional maintenance of the sarcolemma. Our group has extensively studied store-operated cation influx (SOCE) in mouse cell lines and highlighted: 1- an abnormal increase in SOCE in dystrophin-deficient (dys-) mouse myotubes (MT), 2- That SOCE are mediated by TRPC1 and TRPC4, 3- that SOCE deregulation in dys- MT is corrected by overexpression of α1-syntrophin. As of today, there is little evidence in the literature regarding the characterization of SOCE in human muscle cells and in human DMD. This thesis work is divided in two parts : In the murine model, we demonstrated an essential role of STIM1 and Orai1 in the establishment of SOCE and highlighted the involvement of Ca2+/PLC/PKC pathway in the abnormal increase of cation entry in dystrophin-deficient mouse myotubes.In primary human model, we showed: 1- an abnormal increase of SOCE in DMD MT and established the expression profile of various proteins necessary for the implementation of this influx; 2- the involvement of Ca2+/PLC/PKC in SOCE deregulation in human DMD MT and the role of α1-syntrophin in the regulation of cation entry in human MT; 3- the deregulation of calcium homeostasis in DMD that occurs through TRPV2. This work proposes a new regulatory pathway, Ca2+/PLC/PKC, for SOCE in skeletal muscle cells and provides the first elements of the disruption of calcium homeostasis in DMD human myotubes due to the absence of SOCE's regulation by the α1-syntrophin and to the overactivation of TRPV2 channels.

La dystrophie musculaire de Duchenne de Boulogne (DMD) est une myopathie héréditaire liée au chromosome X et causée par une mutation du gène de la dystrophine. Affectant un garçon sur 5000, cette maladie entraine une dégénérescence progressive des muscles striés squelettiques et cardiaques. A ce jour, la DMD demeure une maladie invalidante, incurable et les personnes atteintes ont une espérance de vie de 30 ans. Parmi les thérapies innovantes en cours de développement, la thérapie cellulaire est une stratégie prometteuse. Cependant elle présente plusieurs limitations notamment liées à l’efficacité des types cellulaires utilisés et le devenir des cellules après injection in vivo. Le premier objectif de cette thèse est le développement d’une méthode d’imagerie pour étudier à l’échelle de l’organisme et de façon non invasive la biodistribution et la survie des cellules suite à leur injection systémique dans un modèle préclinique pertinent, le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), un modèle animal reproduisant fidèlement le phénotype DMD. Notre attention s’est portée sur l’utilisation du symporteur sodium iode (NIS) pour le suivi non invasif des cellules. Nous avons obtenu des cellules myogéniques exprimant le NIS, autorisant leur visualisation par scintigraphie grâce à la propriété d’absorption du technétium 99m conférée par ce symporteur. Nous avons montré in vitro que le NIS est fonctionnel pour la capture de radioactivité même après une différentiation avancée des cellules. En parallèle, nous nous sommes intéressés au type cellulaire. Les cellules primaires ayant une capacité de renouvellement limitée, cela restreint leur utilisation en thérapie et leur modification génomique. Afin de contourner cette limitation, plusieurs protocoles visant à obtenir des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) dérivées de cellules canines ont été utilisés. De plus, pour ne plus être dépendant de l’immunosuppression imposée par les greffes allogéniques, nous avons utilisé le système d’édition génomique CRISPR/Cas9 pour mettre au point une correction des cellules GRMD afin de permettre la réalisation de greffes autologues. Nous avons également utilisé le système CRISPR/Cas9 pour réaliser l’insertion ciblée du gène NIS dans un site précis du génome des cellules. Les résultats obtenus autorisent le développement de programmes comparant le potentiel thérapeutique de cellules dans un modèle préclinique de la DMD. / Duchenne muscular dystrophy (DMD), an X-linked recessive myopathy, is caused by mutations in the dystrophin gene. One boy out of 5000 is affected by this disease, which induces a progressive loss of skeletal striated and cardiac muscles. To date, DMD remains an invalidating disease and there is no cure for it. People suffering from DMD usually die in their 30’s. Among the innovative therapies currently under development, cell therapy is a promising strategy. However, it has some limitations related notably to a low efficiency of tested therapeutic cells and their tracking in vivo after injection. The first aim of this thesis is to develop an imaging method allowing non-invasive monitoring of biodistribution and survival of cells at the scale of a large organism, following systemic injection in the GRMD dog (Golden retriever muscular Dystrophy, a relevant animal model of DMD, as it replicates finely the DMD phenotype). We took interest in the sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter. We induced the expression of the NIS in myogenic cells to allow visualization of the cells by scintigraphy thanks to its ability to uptake technetium 99m. We showed that NIS is functional in the cells and they maintain their ability to differentiate. Primary cells have a limited self-renewal capability restraining their use in human cell therapy and gene editing. To overcome this limitation, we used several protocols to derive induced pluripotent stem cells (iPSCs) from adult canine cells. Furthermore, to avoid immune suppression protocols, we used the CRISPR/Cas9 gene editing tools to design a correction strategy of the GRMD mutation for future autologous injections. We also used CRISPR/Cas9 to perform a targeted integration of the NIS gene in a safe harbor locus. Results allow us to develop protocols to compare the therapeutic potential of candidate cells in a preclinical model of DMD.

La dystrophie musculaire facioscapulohumérale (FSHD) est une maladie autosomique dominante, caractérisée par une faiblesse et une atrophie progressive de certains muscles squelettiques. La FSHD est liée à une répression inefficace de la région des macrosatellites D4Z4 sur le chromosome 4, entraînant l'expression inappropriée dans le muscle squelettique, d’un gène à double homeobox 4 (DUX4), et la dérégulation des gènes avoisinants. La surexpression de DUX4 est responsable du phénotype atrophié des myotubes FSHD et induit la dérégulation de gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant. Malgré les avancés majeures dans la compréhension du locus morbide, les mécanismes exacts impliqués dans la FSHD ne sont pas totalement compris et aucun traitement curatif n’est disponible. Cependant, de nombreuses données montrent le rôle prépondérant du stress oxydant dans la FSHD. Récemment, nous avons caractérisé la présence d’un stress oxydant dans les biopsies musculaires et les prélèvements sanguins des patients atteints de FSHD. Nous avons démontré que ce stress est corrélé à une altération de la fonction musculaire chez ces patients et qu’une supplémentation en antioxydants adaptée améliore la fonction musculaire et réduit les dommages oxydatifs. Par ailleurs, nous avons démontré que les myoblastes dérivés des biopsies FSHD sont plus sensibles à des agents pro-oxydants et présentent des défauts de différenciation. L’objectif de nos travaux est de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la FSHD afin de faciliter la mise en place d’approches thérapeutiques. Ce projet de thèse original réunit à la fois une approche fondamentale et clinique.Grâce à la mise en place d’un nouveau modèle in vitro de culture primaire de myoblastes de patients atteints de FSHD, nous avons montré la présence d’un stress oxydant dans ces myoblastes corroborant les observations précédemment obtenues aux niveaux systémiques et musculaires chez ces patients. Par ailleurs, les traitements par des agents pro-oxydants (paraquat et peroxyde d'hydrogène) ont un effet différentiel sur l’expression des enzymes antioxydantes par rapport aux contrôles suggérant un défaut dans les mécanismes d'adaptation au stress oxydant chez les patients atteints de FSHD.D’autre part, afin d'améliorer les procédures de réadaptation pour les patients atteints de FSHD, nous avons proposé d'étudier la faisabilité, la sécurité et l'efficacité de l’entraînement de force par électrostimulation neuromusculaire (ESNM) pour contrer la faiblesse musculaire des quadriceps chez ces patients. Cette étude, en cours, semble être une stratégie de réhabilitation prometteuse pour les patients atteints de FSHD et n’a montré aucun effets indésirables jusqu’à présent. / Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is an autosomal dominant disease, characterized by progressive weakness and atrophy of specific skeletal muscles. FSHD is linked to an inefficient repeat-mediated epigenetic repression of the D4Z4 macrosatellite repeat array on chromosome 4, resulting in the unappropriated expression in skeletal muscle of the double homeobox 4 (DUX4) retrogene. DUX4 overexpression leads to atrophic myotubes phenotype and dysregulation of antioxidant genes. Despite major progress in the understanding of the genetic locus, exact mechanisms that lead to FSHD defects are not completely understood and no curative treatment is available. However, several lines of evidence have proposed oxidative stress and myogenesis defect as the major biological processes affected in FSHD. Recently, we characterized oxidative stress in skeletal muscle biopsies and blood samples from patients with FSHD. We demonstrated that oxidative stress is associated with reduced physical performance in patients with FSHD and that antioxidants adapted strategy was effective to reduce oxidative stress and maintain muscle functions. Furthermore, satellite cell-derived myoblasts from these patients were more susceptible to pro-oxidant agents than control myoblasts and showed a defect in differentiation. The originality of this project relies on creating a synergy between basic and clinical research. The major goal of this work is to identify molecular mechanisms involved in FSHD oxidative stress in order to identify therapeutic approaches.Using in vitro cell model of FSHD, recently developed and optimized in our team, we demonstrate the presence of oxidative stress in FSHD primary myoblast cultures that corroborates previous observations at systemic and muscular levels. Furthermore, treatments with different pro-oxidant agents (paraquat and hydrogen peroxide) have a differential effect on the expression of antioxidant enzymes compared to controls, suggesting a defect in the oxidative stress adaptive response in FSHD myoblasts.Furthermore, in order to improve rehabilitation procedures for patients affected with FSHD, we proposed to investigate the feasibility, safety, and effectiveness of neuromuscular electrostimulation (NMES) strength training to counteract quadriceps muscle weakness in these patients. This ongoing study appears to be a promising rehabilitation strategy and shows no adverse effect for patients with FSHD.