La leucémie lymphoïde représente 30% de tous les cancers chez l’enfant. SCL (« Stem cell leukemia ») et LMO1/2 (« LIM only protein ») sont les oncogènes les plus fréquemment activés dans les leucémies aiguës des cellules T chez l'enfant (T-ALL). L’expression ectopique de ces deux oncoprotéines dans le thymus de souris transgéniques induit un blocage de la différenciation des cellules T suivie d’une leucémie agressive qui reproduit la maladie humaine. Afin de définir les voies génétiques qui collaborent avec ces oncogènes pour induire des leucémies T-ALL, nous avons utilisé plusieurs approches. Par une approche de gène candidat, nous avons premièrement identifié le pTalpha, un gène crucial pour la différenciation des cellules T, comme cible directe des hétérodimères E2AHEB dans les thymocytes immatures. De plus, nous avons montré que pendant la différenciation normale des thymocytes, SCL inhibe la fonction E2A et HEB et qu’un dosage entre les protéines E2A, HEB et SCL détermine l’expression du pTalpha. Deuxièmement, par l’utilisation d’une approche globale et fonctionnelle, nous avons identifié de nouveaux gènes cibles des facteurs de transcription E2A et HEB et montré que SCL et LMO1 affectent la différenciation thymocytaire au stade préleucémique en inhibant globalement l’activité transcriptionnelle des protéines E par un mécanisme dépendant de la liaison à l’ADN. De plus, nous avons découvert que les oncogènes SCL et LMO1 sont soit incapables d’inhiber totalement l’activité suppresseur de tumeur des protéines E ou agissent par une voie d’induction de la leucémie différente de la perte de fonction des protéines E. Troisièmement, nous avons trouvé que Notch1, un gène retrouvé activé dans la majorité des leucémies T-ALL chez l’enfant, opère dans la même voie génétique que le pré-TCR pour collaborer avec les oncogènes SCL et LMO1 lors du processus de leucémogénèse. De plus, cette collaboration entre des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation normales et importantes pour la détermination de la destinée cellulaire pourraient expliquer la transformation spécifique à un type cellulaire. Quatrièmement, nous avons trouvé que les oncogènes SCL et LMO1 sont des inducteurs de sénescence au stade préleucémique. De plus, la délétion du locus INK4A/ARF, un évènement retrouvé dans la majorité des leucémies pédiatriques T-ALL associées avec une activation de SCL, collabore aves les oncogènes SCL et LMO1 dans l’induction de la leucémie. Cette collaboration entre la perte de régulateurs de la sénescence suggère qu’un contournement de la réponse de sénescence pourrait être nécessaire à la transformation. Finalement, nous avons aussi montré que l’interaction directe entre les protéines SCL et LMO1 est critique pour l’induction de la leucémie. Ces études ont donc permis d’identifier des évènements collaborateurs, ainsi que des propriétés cellulaires affectées par les oncogènes associés avec la leucémie et de façon plus générale dans le développement du cancer. / Lymphoid leukemia represents 30% of all cancers in children. SCL (Stem cell leukemia) and LMO1/2 (LIM only protein) are the most frequently activated oncogenes in children T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Ectopic expression of the SCL and LMO1 oncogenes in the thymus of transgenic mice causes T cell differentiation arrest during the preleukemic stage followed by development of aggressive leukemia that reproduce human disease. We therefore took several approaches to decipher the genetic pathway collaborating with these oncogenes in T-ALL induction. Using a candidate approach, we first identified the pTalpha, a gene crucial for T cell differentiation, as a direct target of E2A and HEB heterodimers in immature thymocytes. Moreover, we showed that during normal thymocyte differentiation, SCL inhibits E2A and HEB function and that a dosage between E2A, HEB and SCL normally determines pTalpha gene expression. Second, using both global and functional approaches, we identified novel target genes of E2A and HEB transcription factors and showed that SCL and LMO1 impairs thymocyte differentiation at the preleukemic stage by globally inhibiting E proteins transcriptional activity through a DNA binding mechanism. Moreover, we found that SCL and LMO1 oncogenes are either not totally able to inhibit E protein tumor suppressor activity or act in a different leukemic inducing pathway than E protein loss of function. Third, we found that Notch1, a gene found activated in almost all cases of pediatric T-ALL, operate in the same genetic pathway as the pre-TCR to collaborate with the SCL and LMO1 oncogenes in leukemogenesis. Moreover, this collaboration between oncogenic transcription factors and normal signalling pathways important for cell fate determination might explain cell-type specific transformation. Fourth, we found that the SCL and LMO1 oncogenes are inducers of senescence at the preleukemic stage. Moreover, deletion of INK4A/ARF, an event found in almost all cases of SCL associated pediatric T-ALL, collaborate with SCL and LMO1 oncogenes in leukemogenesis. This collaboration with loss of senescence regulators suggests that a bypass of senescence response would be necessary for transformation. Finally, we also showed that SCL and LMO1 direct interaction is critical for leukemia induction. These studies permitted the identification of collaborating events and cellular properties affected by oncogenes associated with leukemia and more generally in cancer development.

La protéine de fusion E2A-PBX1 induit une leucémie lymphoblastique aigüe des cellules B pédiatrique chez l’humain. E2A-PBX1 possède de puissantes propriétés de trans-activation et peut se lier à l’ADN ainsi qu’aux protéines homéotiques (HOX) via des domaines conservés dans sa portion PBX1, ce qui suggère qu’une dérégulation des gènes cibles de HOX/PBX1 contribue à la leucémogénèse. Précédemment, Bijl et al. (2008) ont démontré que certains gènes Hox collaborent de manière oncogénique avec E2A-PBX1, et que ces interactions sont cellules-spécifiques et varient en fonction du gène Hox impliqué. Une mutagénèse d’insertion provirale suggère et supporte la collaboration des gènes Hoxa et E2A-PBX1 lors de la leucémogénèse des cellules B. La présence de ces interactions dans les cellules B et leur implication dans l’induction des B-ALL est pertinente pour la compréhension de la maladie humaine, et reste encore mal comprise. Notre étude démontre qu’Hoxa9 confère un avantage prolifératif aux cellules B E2A-PBX1. Des expériences de transplantation à l’aide de cellules B E2A-PBX1/Hoxa9 positives isolées de chimères de moelle osseuse démontrent qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 en contribuant à la transformation oncogénique des cellules, et qu’Hoxa9 seul n’induit aucune transformation. Une analyse par Q-RT-PCR nous a permis de démontrer une forte inhibition de gènes spécifiques aux cellules B dans les leucémies co-exprimant Hoxa9 et E2A-PBX1, en plus d’une activation de Flt3, suggérant une inhibition de la différenciation des cellules B accompagnée d’une augmentation de la prolifération. De plus, la surexpression de Hoxa9 dans des cellules leucémiques de souris transgéniques E2A-PBX1, confère aussi un avantage prolifératif aux cellules in vitro, qui semblent être influencé par une augmentation de l’expression de Flt3 et Pdgfδ. En conclusion, nous démontrons pour la première fois à l’aide d’un modèle murin qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 lors de la transformation oncogénique des cellules B et que la signalisation via Flt3 est impliquée, ce qui est potentiellement pertinent pour la maladie humaine. / The fusion protein E2A-PBX1 induces pediatric B cell leukemia in human. It has strong transactivating properties and can bind to DNA and homeobox (HOX) proteins through conserved domains in the PBX1 portion, suggesting that deregulation of HOX/PBX target genes contribute to leukemogenesis. Previously, we reported oncogenic interactions between Hox genes and E2A-PBX1, which are dependent on cell type as well as on the particular Hox member. A proviral insertional mutagenesis screen provided support for collaboration between Hoxa genes and E2A-PBX1 in B cell leukemogenesis. Whether these interactions occur in B cells and lead to B-ALL, relevant for human disease is still not clear. Here we report that Hoxa9 confers a proliferative advantage to E2A-PBX1 B cells. Transplantation experiments with E2APBX1/Hoxa9 positive B cells isolated from bone marrow (BM) chimeras showed that Hoxa9 interacts with E2A-PBX1 contributing to the oncogenic transformation of B cells, but is unable to transform B cells alone. Q-RT-PCR analysis demonstrated a strong repression of B cell specific genes in leukemias co-overexpressing Hoxa9 and E2A-PBX1 in addition to Flt3 activation, indicating inhibition of B cell differentiation in combination with enhanced proliferation. Overexpression of Hoxa9 in E2A-PBX1 mouse leukemic B cells also resulted in a growth advantage in vitro, likely mediated by the enhanced expression of Flt3 and Pdgfδ. In conclusion we show for the first time that Hoxa9 collaborates with E2A-PBX1 in the oncogenic transformation of B cells in a mouse model that involves Flt3 signaling, which is potentially relevant to human disease.

The developmental processes of lymphopoiesis generate mature B lymphocytes from hematopoietic stem cells through increasingly restricted intermediates. Networks of transcription factors regulate these cell fate choices and are composed of both ubiquitously expressed and B lineage-specific factors. E-protein transcription factors are encoded by the three genes E2A, E2-2 (SEF2-1), and HEB. The E2A gene is required for B cell development and encodes the alternatively spliced proteins E12 and E47. During B lymphocyte development, the cells have to pass several checkpoints verifying the functionality of their antigen receptors. Early in the development, the expression of a pre-B cell receptor (pre-BCR) with membrane-bound immunoglobulin (Ig) heavy chain protein associated with surrogate light chain (SLC) proteins is a critical checkpoint that monitors for functional Ig heavy chain rearrangement. Signaling from the pre-BCR induces survival and a limited clonal expansion. Here it is shown that pre-BCR signaling rapidly down-regulates the SLCs l5 and VpreB and also the co-receptor CD19. Ca2+ signaling and E2A were shown to be essential for this regulation. E2A mutated in its binding site for the Ca2+ sensor protein calmodulin (CaM), and thus with CaM-resistant DNA binding, makes l5, VpreB and CD19 expression resistant to the inhibition following pre-BCR stimulation. Thus, Ca2+ down-regulates SLC and CD19 gene expression upon pre-BCR stimulation through inhibition of E2A by Ca2+/CaM. A general negative feedback regulation of the pre-BCR proteins as well as many co-receptors and proteins in signal pathways from the receptor was also shown. After the ordered recombination of Ig heavy chain gene segments, also Ig light chain gene segments are recombined together to create antibody diversity. The recombinations are orchestrated by the recombination activating gene (RAG) enzymes, other enzymes that cleave/mutate/assemble DNA of the Ig loci, and the transcription factor Pax5. A key feature of the immune system is the concept that one lymphocyte has only one antigen specificity that can be selected for or against. This requires that only one of the alleles of genes for Ig chains is made functional. The mechanism of this allelic exclusion has however been an enigma. Here pre-BCR signaling was shown to down-regulate several components of the recombination machinery including RAG1 and RAG2 through CaM inhibition of E2A. Furthermore, E2A, Pax5 and the RAGs were shown to be in a complex bound to key sequences on the IgH gene before pre-BCR stimulation and instead bound to CaM after this stimulation. Thus, the recombination complex is directly released through CaM inhibition of E2A. Upon encountering antigens, B cells must adapt to produce a highly specific and potent antibody response. Somatic hypermutation (SH), which introduces point mutations in the variable regions of Ig genes, can increase the affinity for antigen, and antibody effector functions can be altered by class switch recombination (CSR), which changes the expressed constant region exons. Activation-induced cytidine deaminase (AID) is the mutagenic antibody diversification enzyme that is essential for both SH and CSR. The AID enzyme has to be tightly controlled as it is a powerful mutagen. BCR signaling, which signals that good antibody affinity has been reached, was shown to inhibit AID gene expression through CaM inhibition of E2A.  SH increases the antigen binding strength by many orders of magnitude. Each round of SH leads to one or a few mutations, followed by selection for increased affinity. Thus, BCR signaling has to enable selection for successive improvements in antibodies (Ab) over an extremely broad range of affinities. Here the BCR is shown to be subject to general negative feedback regulation of the receptor proteins as well as many co-receptors and proteins in signal pathways from the receptor. Thus, the BCR can down-regulate itself to enable sensitive detection of successive improvements in antigen affinity. Furthermore, the feedback inhibition of the BCR signalosome and most of its protein, and most other gene regulations by BCR stimulation, is through inhibition of E2A by Ca2+/CaM. Differentiation to Ab-secreting plasmablasts and plasma cells is antigen-driven. The interaction of antigen with the membrane-bound Ab of the BCR is critical in determining which clones enter the plasma cell response. Genome-wide analysis showed that differentiation of B cells to Ab-secreting cell is induced by BCR stimulation through very fast regulatory events, and induction of IRF-4 and down-regulation of Pax5, Bcl-6, MITF, Ets-1, Fli-1 and Spi-B gene expressions were identified as immediate early events. Ca2+ signaling through CaM inhibition of E2A was essential for these rapid down-regulations of immediate early genes after BCR stimulation in initiation of plasma cell differentiation.

Le système hématopoïétique est un tissu en constant renouvellement et les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) sont indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang. Deux fonctions définissent les CSHs; la propriété d’auto-renouvellement, soit la capacité de préserver l’identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, le potentiel de différenciation permettant de générer toutes les lignées hématopoïétiques. Chez l’adulte, la majorité des CSHs sont quiescentes et l’altération de cet état corrèle avec une diminution du potentiel de reconstitution des CSHs, suggérant que la quiescence protège les fonctions des CSHs. La quiescence est un état réversible et dynamique et les réseaux génétiques le contrôlant restent peu connus. Un nombre croissant d’évidences suggère que si à l’état d’homéostasie il y a une certaine redondance entre les gènes impliqués dans ces réseaux de contrôle, leurs rôles spécifiques sont révélés en situation de stress. La famille des bHLHs (basic helix-loop-helix) inclue différentes classes des protéines dont ceux qui sont tissu-spécifiques comme SCL, et les protéines E, comme E12/E47 et HEB. Certains bHLHs sont proposés êtres important pour la fonction des cellules souches, mais cela ne fait pas l’unanimité, car selon le contexte cellulaire, il y a redondance entre ces facteurs. La question reste donc entière, y a-t-il un rôle redondant entre les bHLHs d’une même classe pour la fonction à long-terme des CSHs? Les travaux présentés dans cette thèse visaient dans un premier temps à explorer le lien encore mal compris entre la quiescence et la fonction des CSHs en mesurant leurs facultés suite à un stress prolifératif intense et dans un deuxième temps, investiguer l’importance et la spécificité de trois gènes pour la fonction des CSHs adultes, soit Scl/Tal1, E2a/Tcf3 et Heb/Tcf12. Pour répondre à ces questions, une approche cellulaire (stress prolifératif) a été combinée avec une approche génétique (invalidation génique). Plus précisément, la résistance des CSHs au stress prolifératif a été étudiée en utilisant deux tests fonctionnels quantitatifs optimisés, soit un traitement basé sur le 5-fluorouracil, une drogue de chimiothérapie, et la transplantation sérielle en nombre limite. Dans la mesure où la fonction d’un réseau génique ne peut être révélée que par une perturbation intrinsèque, trois modèles de souris, i.e. Scl+/-, E2a+/- et Heb+/- ont été utilisés. Ceci a permis de révéler que l’adaptation des CSHs au stress prolifératif et le retour à l’équilibre est strictement contrôlé par les niveaux de Scl, lesquels règlent le métabolisme cellulaire des CSHs en maintenant l’expression de gènes ribosomaux à un niveau basal. D’autre part, bien que les composantes du réseau puissent paraître redondants à l’équilibre, mes travaux montrent qu’en situation de stress prolifératif, les niveaux de Heb restreignent la prolifération excessive des CSHs en induisant la sénescence et que cette fonction ne peut pas être compensée par E2a. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse montrent que les CSHs peuvent tolérer un stress prolifératif intense ainsi que des dommages à l’ADN non-réparés, tout en maintenant leur capacité de reconstituer l’hématopoïèse à long-terme. Cela implique cependant que leur métabolisme revienne au niveau de base, soit celui trouvé à l’état d’homéostasie. Par contre, avec l’augmentation du nombre de division cellulaire les CSHs atteignent éventuellement une limite d’expansion et entrent en sénescence. / The hematopoietic system is constantly replenished by hematopoietic stem cells (HSCs) that are essential to sustain mature blood cells production. Two key functions characterize HSCs; their capabilities to self-renew, i.e. maintenance of cellular identity following cell division, and their multipotencies, i.e. their potentials to generate all hematopoietic lineages. In adults, most HSCs are quiescent and alterations to this state correlate with decreased reconstitution potential, thus suggesting that quiescence protects HSC functions. Quiescence is a reversible and dynamic state, and genetic networks controlling these characteristics are poorly described. Recent evidence suggests that during steady-state hematopoiesis, genes controlling HSC functions are highly redundant, whereas stress conditions may reveal their specific roles. Transcription factors of the basic helix-loop-helix (bHLHs) family include tissue-specific subclasses (e.g SCL) and more ubiquitous E proteins (e.g. E12/E47 and HEB). Several bHLH members have been described as important for HSC functions, however this question is still highly debated in the field due to functional redundancies. How different bHLHs from a same subclass can uniquely affect long term HSC functions is still an open question. The work presented in this thesis aimed to address the question how three bHLH transcription factors specifically Scl/Tal1, E2a/Tcf3 and Heb/Tcf12 control HSC functions after an important proliferative stress to eventually re-establish steady state conditions typified by quiescence in adult HSCs. . To this end, we used three converging approaches, at the cellular level, by imposing a proliferative stress on HSCs, a genetic approach, by deleting genes of interest and genome-wide transcriptomics. More precisely, HSC resistance to proliferative stress has been evaluated under two extreme conditions; i.e. by consecutive treatments with the chemotherapeutic drug 5-fluorouracil (5-FU), mimicking a clinical situation in cancer chemotherapy, and by serial transplantation assays with limited cell numbers. Moreover, to test if a genetic network regulates HSCs functions, we also used three mouse models, i.e. Scl+/-, E2a+/- et Heb+/-. Using these tools, we showed that HSC adaptation to proliferative stress and return to steady state is strictly regulated by Scl expression levels that restricts ribosomal gene expression. Moreover, despite some degree of redundancy within this network, Heb expression levels restrain the excessive proliferation of HSC upon stress conditions by inducing senescence, a function that cannot be compensated for by E2a. To conclude, our results show that HSCs can tolerate both proliferative stress and unrepaired DNA damages without affecting their primary function to replenish the hematopoietic system. This is especially true if their metabolism can come back to basal levels. However, with increased numbers of cell divisions, HSC will sooner or later reach their expansion limit and enter senescence.

Durant l’hématopoïèse, les cellules souches hématopoïétiques peuvent soit s’autorenouveler soit se différencier dans les divers types de cellules matures constituant le système hématopoïétique. Un des modèles prédominants sur le développement du système hématopoïétique postule une différenciation par étape des différentes lignées le constituant. Ce modèle débute avec les cellules souches hématopoïétiques qui donnent naissance à des précurseurs multipotents qui peuvent à leur tour se différencier en précurseurs dédiées à la lignée lymphoïde ou myéloïde. Bien que la dernière décennie ait apporté de nombreuses connaissances sur les principales signalétiques transcriptionnelles impliquées dans le développement hématopoïétique, le détail des mécanismes moléculaires en jeu expliquant comment les cellules souches hématopoïétiques sont initialement amorcées puis complètement engagées vers une voie de différenciation reste toujours à élucider. Le travail de notre laboratoire indique que l’assemblage combinatoire du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF est un élément clé parmi les mécanismes épigénétiques qui gouvernent le destin cellulaire et notamment la famille de sous-unités Smarcd qui comporte 3 membre alternatifs Smarcd1/2/3. Des analyses du transcriptome par séquençage haut débit ont montré que l’expression de la sous-unité Smarcd1 du complexe est élevée dans le compartiment des cellules souches, les précurseurs multipotents et les progénitures lymphoïdes tandis que la sous-unité Smarcd2 est principalement exprimée dans les précurseurs myéloïdes. En utilisant des modèles de délétion conditionnelle dans des modèles murins, nous avons démontré que Smarcd1 et Smarcd2 jouent des rôles critiques et lignés spécifiques durant l’hématopoïèse. Dans un premier temps, nous avons pu montrer que Smarcd1 collabore avec le facteur de transcription de la famille bHLH E2A pour spécifier le destin lymphoïde des précurseurs multipotents et qu’elle est donc absolument essentielle pour la lymphopoïèse. Notre travail sur les mécanismes moléculaires en jeu a pu montrer que Smarcd1 interagit directement avec E2A et est nécessaire pour l’accessibilité de la chromatine sur un ensemble de régions enrichies avec les modifications d’histones H3K27ac/H3K3me1 qui marquent des régions activatrices (« enhancer ») impliquées dans l’activation d’une signature lymphoïde dans les précurseurs multipotents. Le blocage de l’interaction entre Smarcd1 et E2A inhibe l’amorce de cette signature lymphoïde et bloque l’émergence de précurseurs destinés à la voie lymphocytaire. Concernant la fonction de Smarcd2, nous avons pu montrer que cette sous-unité est absolument nécessaire pour la granulopoïèse. Les souris ayant subi une délétion génétique de Smarcd2 deviennent très rapidement neutropéniques. Ce phénotype découle d'un blocage au stade de différenciation myélocyte/métamyélocyte, tandis que les autres lignées hématopoïétiques restent non affectées par la délétion. Nous avons pu identifier le facteur de transcription C/ebpƐ comme un partenaire essentiel de Smarcd2 qui interagit avec le complexe SWI/SNF sur les promoteurs de gènes de granules secondaires afin d’en activer la transcription. Les analyses du transcriptome que nous avons effectué lorsque l’interaction de Smarcd2 et C/ebpƐ est interrompue dans des précurseurs de granulocytes ont montré une diminution de l’expression des gènes de granules secondaires liée à une maturation incomplète des granulocytes menant au développement d’un syndrome de myélodysplasie au court du temps. / During hematopoiesis, hematopoietic stem cells (HSCs) either selfrenew or differentiate into all mature blood cell types through successive rounds of binary cell fate decisions. The prevailing model of hematopoiesis predicts a step-by-step model of lineage differentiation in which HSCs first give rise to multipotent progenitors that subsequently differentiate into myeloid and lymphoid restricted progenitors. Although key transcriptional pathways controlling hematopoietic development are beginning to be deciphered, detailed molecular mechanisms explaining how HSCs and progenitors are initially primed and then commit to the different hematopoietic cell lineages are lacking. Work from our laboratory indicates that combinatorial assembly of the mammalian SWI/SNF (mSWI/SNF) chromatin remodeling complex is a key epigenetic mechanism that governs cell fate decisions. Transcriptomics analyses revealed that expression of the Smarcd1 subunit is enriched in hematopoietic stem/progenitors and early lymphoid cells, while Smarcd2 is mainly expressed in myeloid progenitors. Using conditional knock-out mouse models, we demonstrated that Smarcd1 and Smarcd2 subunits perform critical and lineage-specific roles during hematopoiesis. First, we found that Smarcd1 collaborates with the bHLH transcription factor E2A to specify lymphoid cell fate during hematopoiesis and, therefore, is absolutely required for lymphopoiesis. Mechanistically, we showed that Smarcd1 physically interacts with E2A and is required for chromatin accessibility of a set of H3K27ac/H3K4me1-enriched enhancers that coordinate activation of the early lymphoid signature in hematopoietic stem cells. Impairing the interaction between Smarcd1 and E2A inhibits lymphoid lineage determination and the emergence of lymphoid-primed multipotent progenitors. Conversely, we showed that Smarcd2 is absolutely required for granulopoiesis. Smarcd2-deficient mice quickly become neutropenic due to a XIII block at the myelocyte/metamyelocyte stage of granulocyte maturation while other lineages remain unaffected. We discovered that Smarcd2 interacts with the transcription factor C/ebpε to recruit the mSWI/SNF complex on the promoter of secondary granule genes, thus inducing their transcriptional activation. As shown by transcriptomic analysis, impairing this interaction results in decreased expression of secondary granule genes, improper granulopoietic maturation, and development of a myelodysplastic-like syndrome over time. Altogether, this work identifies the Smarcd1 and Smarcd2 subunits of SWI/SNF complexes as master chromatin remodelers allowing the recruitment of lineage-specific transcription factors at key regulatory loci controlling lymphoid lineage priming and granulocyte development, respectively. More globally, these studies highlight that combinatorial assembly of alternative subunits of mSWI/SNF complexes is a key epigenetic mechanism controlling cell fate decisions during hematopoiesis.