La surexpression des pompes d’efflux (PE) appartenant à la famille Resistance-Nodulation-Division (RND) est l’un des contributeurs majeurs de la multirésistance (MDR) et la pathogénicité des bactéries Gram-négatives. Ces transporteurs sont capables d'expulser à l’extérieur de la cellule bactérienne différentes classes d'antibiotiques, ce qui contribue de manière significative à l'échec thérapeutique du traitement des maladies infectieuses. Dans ce contexte, les PEs sont des cibles intéressantes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens. Afin de combattre ce mécanisme de résistance, des inhibiteurs des pompes d’efflux (EPIs) sont développés comme adjuvants d'antibiotiques dans le but de restaurer ou d'améliorer leur activité. L'archétype AcrAB-TolC est particulièrement répandu chez les espèces d’Enterobacter pertinentes en clinique (pathogènes « ESKAPE »). Cette étude décrit une stratégie basée sur des analogues des fluoroquinolones pour le drug design des EPIs, contre la pompe AcrB chez E. aerogenes. Ainsi, la synthèse et l'évaluation microbiologique des dérivés de quinazoline-4(3H)-one ont été effectuées. Les propriétés structurales et moléculaires des composés testés (i.e. rigidité et flexibilité) ont également été étudiées. Pour cela, de nouveaux scaffolds ont été évaluées. Plusieurs molécules ont montré une augmentation de la sensibilité des bactéries à la norfloxacine et au chloramphénicol. Les résultats obtenus, appuyés par la modélisation moléculaire, suggèrent que la flexibilité moléculaire et la nature des fonctions chimiques des EPIs jouent un rôle essentiel dans l'amélioration de l'activité et la sélectivité vis-à-vis des fluoroquinolones. / Overexpression of Resistance-Nodulation-Division (RND) efflux pumps (EP) is a major contributor in multidrug resistance (MDR) and pathogenicity in Gram-negative bacteria. These transporters are able to expel out of the bacterial cell clinically important antibiotic classes, contributing in a significant manner to the treatment failure of infectious diseases. With the worrying levels of bacterial resistance reported worldwide and the continuous spreading of MDR pathogens, EPs are interesting targets for the discovery of new antimicrobial drugs. Therefore, to overcome this mechanism, efflux pump inhibitors (EPIs) are being developed as adjuvants in order to restore or improve the activity of usual antibiotics. The AcrAB-TolC archetype is particularly widespread in Enterobacter spp. presenting clinical relevance (ESKAPE pathogens). In this study, we described the drug design strategy based on fluoroquinolone antibiotic analogs, against the AcrB pump of E. aerogenes. Thus, synthesis and microbiological evaluation of quinazolin-4(3H)-one derivatives were performed. The structural and molecular properties of the tested compounds (i. e. rigidity and flexibility) were also investigated. In this purpose, a scaffold hopping of the quinazolinone core to homologous benzoquinazolinones and precursors benzamides were carried out. Several molecules increased the bacterial susceptibility towards norfloxacin and chloramphenicol. The obtained results, supported by molecular modeling, suggest that molecular flexibility and the nature of chemical functions play a critical role to improve activity and selectivity on fluoroquinolone potentiation targeting AcrB efflux pump.

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Les espèces bactériennes opportunistes responsables d'infections nosocomiales chez l'Homme se rencontrent dans les environnements terrestres et aquatiques. Elles sont très souvent caractérisées par une résistance naturelle aux antibiotiques leur conférant un phénotype appelé Multi-Drug Resistant (MDR). L'efflux d'antibiotiques via des pompes, est un des mécanismes à l'origine de cette multi-résistance. Alors que le rôle de ces pompes chez des bactéries isolées en milieu clinique est connu, aucune donnée n'est disponible concernant leur rôle chez les bactéries associées avec d'autres organismes eucaryotes du sol tels que les amibes. Pourtant des données de la littérature indiquent que les amibes, jusqu'alors principalement connues pour leur rôle prédateur de bactéries sont susceptibles d'héberger des bactéries " résistantes " aux amibes (ARB). Parmi ces ARB, des pathogènes opportunistes ont été identifiés dont certains sont connus pour être porteurs de pompes à efflux. Les pompes à efflux de ces bactéries pourraient donc intervenir dans l'adaptation aux amibes du sol. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons, dans un premier temps, isolé et identifié la flore amibienne et les ARB de différents sols. Parmi les ARB identifiées, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cepacia sont caractérisées par des propriétés d'antibiorésistance contrastées et de virulence élevées. Des études d'interaction ont montré que S. maltophilia se multipliait dans des amibes axéniques et que des pompes à efflux Sme étaient surexprimées. Par ailleurs des molécules sécrétées par l'amibe stimulent la croissance bactérienne et des études préliminaires de profilage métabolique ont montré la présence de différents métabolites secondaires produits par l'amibe au cours de l'interaction avec S. maltophilia pouvant jouer un rôle dans l'expression des pompes à efflux / The opportunistic bacterial species, responsible for nosocomial infections in humans, occurs in terrestrial and aquatic environments. They are often characterized by natural resistance to antibiotics giving them a phenotype called Multi-Drug Resistant (MDR). The efflux of antibiotics via pumps, is one of the mechanisms behind this multi-resistance. While the role of these pumps in bacteria isolated from hospital is known, no data are available regarding their role in bacteria associated with other soil eukaryotic organisms such as amoebae. Nevertheless, data from the literature indicate that amoebae, mainly known to be predators of bacteria, are likely to harbour "amoeba resistant bacteria” (ARB). Among these ARB, opportunistic pathogens have been identified, some of which are known to be carriers of efflux pumps. The efflux pumps of these bacteria could thus interfere in the adaptation to soil amoebae. In order to verify this hypothesis, we first isolated and identified the amoebal population and the ARB of different soils. Among the identified ARB, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia are characterized by high contrast antibiotic resistance and high virulence. Interaction studies showed that S. maltophilia could multiplied in axenic amoebae and Sme efflux pumps were overexpressed. Furthermore, molecules secreted by the amoeba stimulate bacterial growth and preliminary studies of metabolic profile have shown that production of various secondary metabolites by the amoeba during the interaction with S. maltophilia could play a role in the efflux pumps expression

Forests play an important role in the net ecosystem exchange of CO2 in terrestrial ecosystems. Soil respiration is often the major source of CO2 in forests and is greatly influenced by climatic variability and management practices. Spatial and temporal variations of soil respiration have been examined in a chronosequence (60, 30, 15, and 1 year-old) of temperate, afforested, white pine (Pinus strobus) forest stands in Southern Ontario, Canada, in order to investigate any age related differences. Spatial and temporal variations of soil respiration in a 74 year-old boreal, mixed-wood forest in Central Ontario, was also studied and compared with results from the 60 year-old, temperate, white pine, forest stand, in order to investigate any climate related differences. Soil CO2 flux, temperature, and moisture were measured for one year (June 2003 to May 2004, inclusive, for the chronosequence study, and August 2003 to July 2004, inclusive, for the boreal-temperate study). In all stands, temporal variability of soil respiration followed the seasonal pattern of soil temperature, reaching a minimum in winter and maximum in summer. Temporal variability of soil temperature was able to explain 80 to 96% of the temporal variability in soil respiration at all stands. Spatial variability in soil respiration was also observed at all stands and the degree of this variability was seasonal, following the seasonal trend of mean daily soil respiration. Spatial variability of some soil chemical properties was highly correlated with the spatial variability of soil respiration, while litter thickness was not. The location of soil respiration measurement with respect to tree trunks may also help to explain some of the spatial variability in soil respiration. Across the chronosequence, the highest mean daily CO2 efflux was observed during the growing season for the 15 year-old-stand (5.2 ± 1.3 to 0.4 ± 0.2 μmol CO2 m^-2 s^-1), which was comparable to the 60 year-old-stand (4.9 ± 1.3 to 0.2 ±0.1 μmol CO2 m^-2 s^-1), but higher than the 30 year (3.8 ± 0.9 to 0.2 ± 0.0 μmol CO2 m^-2 s^-1) and 1 year (2.9 ± 0.9 to 0.3 ± 0.3 μmol CO2 m^-2 s^-1) old stands. From boreal-temperate comparison, it was observed that mean daily soil respiration rates for the boreal stand (6.9 ± 1.7 to 0.5 ±0.1 μmol CO2 m^-2 s^-1) were higher during the growing season compared to the 60 year-old temperate forest stand. Understanding temporal and spatial variability of soil respiration and how it is controlled is essential to improving forest ecosystem carbon budget assessments, and subsequently, the global carbon budget. This study will contribute direct observations necessary for improving and validating forest ecosystem CO2 exchange models. / Thesis / Master of Science (MSc)

Thesis (MScMedSc)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Central dogma suggests that mutations in target genes is the primary cause of resistance to first and second-line anti-TB drugs in Mycobacterium tuberculosis. However, it was previously reported that approximately 5% of Rifampicin mono-resistant clinical M. tuberculosis did not harbor mutations in the rpoB gene. The present study hypothesized that active efflux plays a contributory role in the level of intrinsic resistance to different anti-TB drugs (Isoniazid, Ethionamide, Pyrazinamide, Ethambutol, Ofloxacin, Moxifloxacin, Ciprofloxacin, Streptomycin, Amikacin and Capreomycin in RIF mono-resistant clinical M. tuberculosis isolates with a rpoB531 (Ser-Leu) mutation. This study aimed to define the role of Efflux pump inhibitors (verapamil, carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone and reserpine) in enhancing the susceptibility to different anti-TB drugs in the RIF mono-resistant clinical isolates. The isolates were characterized by determining the level of intrinsic resistance to structurally related/unrelated anti-TB drugs; determining the effect of EPIs on the level of intrinsic resistance in the isolates and comparing the synergistic properties of the combination of EPIs and anti-TB drugs. To achieve this, genetic characterization was done by PCR and DNA sequencing. Phenotyping was done by the MGIT 960 system EpiCenter software to determine the MICs of the different anti-TB drugs and the effect of verapamil and carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone on determined MICs. Due to inability to test reserpine in a MGIT, a different technique (broth microdilution) was used for the reserpine experiment. Additionally; fractional inhibitory concentrations (FIC) indices were calculated for each of these drugs. The FIC assess the anti-TB drugs/inhibitor interactions. STATISTICA Software: version 11 was used for statistical analysis. Results revealed that the RIF mono-resistant isolates were sensitive at the critical concentrations of all 10 drugs tested, with the exception of Pyrazinamide. This could be explained by the technical challenges of phenotypic Pyrazinamide testing. A significant growth inhibitory effect was observed between the combination of EPI and anti-TB drug exposure in vitro. This suggests that verapamil, carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone and reserpine play a significant role in restoring the susceptibility (decrease in intrinsic resistance level) of the RIF mono-resistant isolates to all anti-TB drugs under investigation. Additionally, a synergistic effect was observed by the combination treatment of the anti-TB drugs with the different EPIs. Based on these findings, we proposed a model suggesting that efflux pumps are activated by the presence of anti-TB drugs. The activated pumps extrude multiple or specific anti-TB drugs out of the cell, this in turn decrease the intracellular drug concentration, thereby causing resistance to various anti-TB drugs. In contrast, the addition of EPIs inhibits efflux pump activity, leading to an increase in the intracellular drug concentration and ultimate cell death. This is the first study to investigate the effect of different efflux pumps inhibitors on the level of intrinsic resistance to a broad spectrum of anti-TB drugs in drug resistant M. tuberculosis clinical isolates from different genetic backgrounds. The findings are of clinical significance as the combination of treatment with EPI and anti-TB drugs or use of EPIs as adjunctives could improve MDR-TB therapy outcome. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Sentrale dogma beweer dat mutasies in teiken gene die primêre oorsaak van die weerstandheid teen anti-TB-middels in Mycobacterium tuberculosis is. Vorige studies het getoon dat ongeveer 5% van Rifampisien enkelweerstandige kliniese M. tuberculosis isolate nie ‘n mutasie in die rpoB geen het nie. Die hipotese van die huidige studie was dat aktiewe pompe 'n bydraende rol speel in die vlak van intrinsieke weerstandheid teen 10 verskillende anti-TB-middels (Isoniasied, Ethionamied, Pyrazinamied, Ethambutol, Ofloxacin, Moxifloxacin, Siprofloksasien, Streptomisien, Amikasien and Capreomycin) in RIF enkelweerstandige kliniese M . tuberculosis isolate met 'n rpoB531 (Ser-Leu) mutasie. Die doel van hierdie studie was om die rol van uitpomp inhibeerders (verapamil, carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone en reserpien) te definieer in die verbetering van die werking vir verskillende anti-TB-middels in die RIF enkelweerstandige kliniese isolate. Die doelstellings van die studie was om die vlak van intrinsieke weerstandigheid teen struktureel verwante/onverwante anti-tuberkulose middels asook die effek van die EPIs op die vlak van intrinsieke weerstand in die isolate is bepaal. Verder is sinergistiese eienskappe van die kombinasie van EPIs en anti-TB-middels ondersoek. Hierdie doelstellings is bereik deur genetiese karakterisering deur PKR en DNS volgorde bepaling. Fenotipering is gedoen deur gebruik te maak van MGIT 960 EpiCenter sagteware om die Minimum Inhibisie Konsentrasie (MIC) van die verskillende anti-TB-middels en die effek van verapamil en carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone op die MIC te bepaal. Reserpien kan nie in die MGIT sisteem getoets word nie, and daarom is 'n ander tegniek (mikro-verdunning) is gebruik om die effek van reserpien te toets. Fraksionele inhiberende konsentrasies (FIC) is bereken vir elk van hierdie middels die anti-TB-middels / inhibeerder interaksies te bepaal. STATISTICA v11 sagteware is gebruik vir alle statistiese analises. Resultate van hierdie studie toon dat die RIF enkelweerstandige isolate sensitief is teen kritieke konsentrasies van al die middels, met die uitsondering van Pyrazinamied. Weerstandigheid van Pyrazinamied kan wees as gevolg van welbekende tegniese probleme met die standaard fenotipiese pyrazinamied toets. ‘n Beduidende groei inhiberende effek is waargeneem tussen die kombinasie van EPI en anti-TB middel blootstelling in vitro. Dit dui daarop dat verapamil, CCCP en reserpine 'n belangrike rol speel in die herstel van die sensitiwiteit (afname in intrinsieke weerstand vlak) van die RIF enkelweerstandige isolate aan alle anti-TB-middels wat ondersoek is. Daarbenewens is 'n sinergistiese effek waargeneem deur die kombinasie van die verskillende anti-TB-middels en die verskillende EPIs. Op grond van hierdie bevindinge het ons ‘n model voorgestel wat toon dat uitvloei pompe geaktiveer word deur die teenwoordigheid van anti-TB-middels en die geaktiveerde pompe dan verskeie of spesifieke anti-TB-middels uit die sel pomp. Dus verminder die intrasellulêre konsentrasie van die middel en veroorsaak daardeur weerstandigheid teen verskeie anti-TB-middels. Die byvoeging van EPIs inhibeer uitvloei pompe se werking en lei tot 'n toename in die intrasellulêre konsentrasie van die middels en uiteindelik die dood van die selle. Hierdie is die eerste studie wat die effek van verskillende uitvloei pompe inhibeerders op die vlak van intrinsieke weerstand teen 'n breë spektrum van anti-TB-middels in die middel-weerstandige kliniese isolate ondersoek. Die bevindinge kan van belangrike kliniese belang wees aangesien die kombinasie van behandeling met EPI en anti-TB-middels die uitkoms MDR-TB terapie kan verbeter.

Bacteria have evolved sophisticated cellular transport mechanisms to maintain metal homeostasis to not only utilize metals as important cofactors but also to evade the toxicity of these ions. The delicate balance is maintained by several homeostatic mechanisms that range from active cytoplasmic export, modification, sequestration, and periplasmic detoxification of toxic metals to the extracellular milieu. One mechanism involves active periplasmic extrusion of toxic substrates via a transmembrane spanning tripartite protein complex. The mechanism of substrate binding and subsequent efflux has yet to be elucidated. However, genetic, comparative genomic, biochemical, and functional analyses of the components of the heavy-metal efflux family have allowed the development of proposed models for a substrate transport pathway. The goals of this research were to identify the roles these systems play and to further characterize these systems on a molecular level to ultimately understand the mechanism of substrate transport. Elucidating a transport pathway in metal transporters allows for the development of a revised working model, which ultimately can have implications for antimicrobial drug development.

Les gliomes malins constituent les tumeurs cérébrales primaires les plus agressives et le glioblastome (GBM) est la plus fréquente et agressive d’entre elles. La survie médiane associée n’est que de 14,6 mois. Dû au caractère hautement invasif de ces tumeurs, la résection maximale de la tumeur doit impérativement être suivie de traitement de radio- et/ou chimiothérapie. Cependant, la présence de la barrière hématoencéphalique et des mécanismes de chimiorésistance, tels que les pompes à efflux, limitent l’acheminement et l’efficacité des composés aux cellules tumorales. L’ouverture osmotique de la barrière hématoencéphalique (OBHE) a été développée afin d’améliorer l’acheminement d’agents anti-néoplasiques au cerveau et à la tumeur. Bien que plusieurs études aient été effectuées afin de caractériser son processus, beaucoup d’informations restent à découvrir afin d’approfondir nos connaissances sur l’OBHE et améliorer son application en clinique. Avec l’objectif ultime de contourner ces deux obstacles, j’ai caractérisé le processus dynamique de l’OBHE pour deux molécules de tailles différentes par imagerie par résonance magnétique dynamique, ainsi que pour une molécule étant un substrat des pompes à efflux par tomographie d’émission par positron dans le modèle murin Fischer-F98. J’ai également étudié l’expression et la localisation de différentes pompes à efflux par PCR quantitative et immunohistochimie dans des spécimens de gliomes malins. Les résultats obtenus démontrent que la barrière hémato-tumorale limite l’acheminement à la tumeur de composés de différent poids moléculaire. L’acheminement au parenchyme cérébral et à la tumeur suite à une procédure d’OBHE est aussi dépendant du poids moléculaire et de la taille de la molécule à acheminer. L’OBHE à moins d’être de qualité excellente, ne semble pas suffisante pour acheminer au parenchyme cérébral des substrats des pompes à efflux. Les GBM expriment la MRP1, MRP3 et BCRP à différents niveaux. La PGP, MRP1 et BCRP sont exprimées par les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux. L’ensemble de ces résultats suggère que l’administration d’agents thérapeutiques suite à la procédure d’OBHE doit être optimisée selon l’agent administré et que l’inhibition de pompes à efflux ou une autre stratégie rendant les agents de chimiothérapie invisibles aux pompes à efflux sera bénéfique pour améliorer leur acheminement au système nerveux central et aux cellules tumorales.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.