Resumo: Nesse trabalho, foram desenvolvidos métodos analíticos para determinação de três classes de conservantes e contaminantes em alimentos e bebidas utilizando como técnica analítica a Eletroforese Capilar. No primeiro subgrupo, foram investigados os ânions nitrito e nitrato, utilizados como conservantes em alimentos curados. A separação foi efetuada utilizando os seguintes parâmetros instrumentais: eletrólito de corrida: 60 mmol.L-1 de borato de sódio contendo 0,2 mmol.L-1 de CTAB, pH 9,30; tensão: -10 kV, temperatura: 29º C, injeção: 8 s x 30 mbar, Capilar: 48,5 cm (sendo 40,0 cm até o detector) e detecção direta em 210 nm. Os parâmetros de validação foram investigados revelando boa precisão no tempo de migração (RSD < 0,73%). A linearidade foi estudada na faixa de 50 - 250 mg.Kg-1 para nitrito e 100 - 1000 mg.Kg-1 para nitrato, com r > 0,99. Os limites de quantificação foram de 14,8 mg.Kg-1 para nitrito e 16,9 mg.kg-1 para nitrato. A recuperação foi maior que 98% para os ânions. O método foi aplicado a amostras de alimentos encontradas no comércio local e os resultados estão abaixo dos valores permitidos pela legislação para nitrito (150 mg.kg-1 ) e nitrato (300 mg.kg-1 ). O segundo subgrupo avaliado foram os ânions benzoato, sorbato, metil e propilparabeno, que são utilizados como conservantes em diversos alimentos, dentre eles em sucos, bebidas gaseificadas, condimentos e adoçantes. As condições de separação otimizadas foram: Eletrólito de corrida: 20 mmol.L-1 de borato de sódio, tensão: 20 kV; temperatura: 29ºC, injeção: 8 s x 30 mbar; Capilar: 48,5 cm (sendo 40,0 cm até o detector) e detecção direta em 220 nm. O método foi validado, com bons resultados de precisão analítica para tempo de migração (RSD < 1,89 %), a linearidade estudada foi na faixa de 75 - 500 mg.Kg-1 , com r > 0,99 para todos os ânions. Os ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work were developed analytical methods for determination of three groups of preservatives and contaminants in foods and beverages using Capillary Electrophoresis. In the first group, it was investigated the nitrite and nitrate anions, used as preservatives in cured meats. The separation was achieved according to the following instrumental parameters: Running buffer: 60 mmol.L-1 sodium tetraborate containing 0.2 mmol.L-1 CTAB; voltage: -10 kV, temperature: 29ºC; injection: 8 s x 30 mbar, Capillary lenght: 48.5 cm (40.0 cm effective length) and wavelength: 210 nm. The validation parameters were investigated, revealing a good precision on the migration time (RSD < 0,73%). The linearity was evaluated in the range of 50 - 250 mg.Kg-1 to nitrite and 100 - 1000 mg.Kg-1 to nitrate (r>0.99). Limit of quantification was 14.8 mg.Kg-1 to nitrite and 16.9 mg.Kg-1 to nitrate and the recovery rate higher than 98% to these anions. The method was applied to commercial samples of meats and the obtained results were below the acceptable levels according to the Brazilian legislation (150 mg.Kg-1 to nitrite and 300 mg.Kg-1 to nitrate). The second group evaluated was the anions benzoate, sorbate, methyl and propylparaben, used as preservatives in several foods, including juices, sauces, soda and sweeteners. The analytical parameters were: running buffer: 20 mmol.L-1 sodium borate; voltage: 20 kV; temperature: 29ºC; injection: 8 s x 30 mbar; capillary: 48.5 cm (40.0 effective length), wavelength: 220 nm. The method was validated revealing a good precision (RSD > 1.89 %) and linearity in range of 75 - 500 mg.L-1 (r>0.99). Limits of detection were 27.0; 47.5; 27.0; 40.5 mg.Kg-1 ; to methylparaben, propylparaben, benzoate and sorbate, respectively. The recovery range found was from 98.81 - 104.87%. The method was applied in different commercial sodas, sweeteners, sauces and juices ... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Arnaldo Alves Cardoso / Coorientador: Elisabete Alves Pereira / Banca: Emanuel Carrilho / Banca: Ana Valéria Colnaghi Simionato / Mestre

Este trabalho descreve o desenvolvimento de microchips para eletroforese a partir dos processos de impressão direta e fotolitográfico. A estrutura dos microcanais fabricados pelo processo de impressão direta são definidos por filmes de poliéster (base e tampa) e por uma camada de toner (paredes). A caracterização da superfície e da composição do toner foram necessárias para um melhor entendimento da composição química da estrutura dos microcanais e para este propósito foram utilizadas diferentes técnicas como análise elementar de CHN-O, AFM, EDX e MEV. Além da química do toner as dimensões limites para os canais, como largura e altura, também foram estudadas. A aplicação de um efeito de cinza nos microcanais foi avaliado de modo a desenvolver um dispositivo de pré-concentração usando as partículas de toner como obstáculos para o fluxo. Os microdispositivos fabricados em poliéster-toner foram integrados com detecção amperométrica no final do canal de separação usando eletrodos produzidos a partir da combinação das tecnologias da produção de máscaras de toner e CDs, como fonte de ouro. O desempenho destes microchips foi avaliado com detecção amperométrica da separação eletroforética de iodeto e ascorbato. Os limites de detecção obtidos foram de 500 nmol L-1 (135 amol) e 1,2 mmol L-1 (486 amol) para o iodeto e ascorbato, respectivamente. Além do processo de impressão direta, o processo fotolitográfico também foi utilizado para a mesma finalidade. Neste processo foi utilizado o fotorresiste negativo SU-8 e microdispositivos com área de 1 cm2 foram fabricados usando diferentes substratos como vidro, silício e alumina. A alumina apresentou muitas irregularidades para os microdispositivos fabricados. Problemas com a absorção e dispersão da radiação ultravioleta foram observados. No entanto, a alumina foi um excelente material para as etapas de produção de dois moldes metálicos para a rápida produção de dispositivos poliméricos. Um molde com uma geometria complexa foi obtido para estudar um novo sistema de injeção e um segundo molde foi preparado para avaliar o uso de uma borracha de silicone como material moldante. Além disso, este trabalho também apresenta o desenvolvimento de um dispositivo microfabricado com eletrodos completamente integrados para separação e detecção eletroquímica. Eletrodos de ouro ou de titânio/platina foram obtidos através da técnica lift-off. As máscaras para a fabricação de moldes metálicos e dos dispositivos integrados foram preparadas em fotolito de alta resolução. / This work describes the development of electrophoresis microchip fabricated by direct-printing and photolithographic processes. The channel structures of the devices fabricated by direct-printing process are defined by polyester films (base and cover) and by a toner layer (walls). The characterization of toner surface and composition were necessary for a better understanding of the chemistry composition and for this purpose we have used different techniques such as CHN-O elemental analysis, AFM, EDX and SEM. Besides the chemistry of toner, the possible dimensions for the channels as the depth and the width were also studied. The application of a gray-scale effect in the channels was evaluated in order to create a preconcentration device using the toner particles as obstacles for the flow. The polyester-toner microdevices were coupled with end-channel amperometric detection using electrodes produced by combination of the toner masks laser-printing and compact discs as a gold source. The performance of this electrophoresis microchip was evaluated by amperometric detection of iodide and ascorbate. The detection limits found were 500 nmol L-1 (135 amol) and 1.2 mmol L-1 (486 amol) for iodide and ascorbate, respectively. Besides the direct-printing process, the photolithographic process was also used for this purpose. In this process it was used the SU-8 negative photoresist and microdevices with 1-cm2 area were fabricated using different substrates such as glass, silicon and alumina. The alumina presented several irregularities for the microdevices fabricated. Problems with the absorption and dispersion of ultraviolet radiation were observed. However, the alumina was an excellent material for the steps in the production of two metallic molds for fast production of PDMS devices. One mold with complex geometry was obtained in order to study a new injection system and a second mold was prepared to evaluate the use of silicon rubber as molding material. Furthermore, in this work it was also reported the development of a microfabricated device with fully integrated electrodes for separation and electrochemical detection. The gold or titanium/platinum electrodes were obtained by lift-off technique. The masks for fabrication of the metallic molds and of the integrated microdevices were prepared in transparency films with high resolution.

A goiaba é o fruto da goiabeira, originária da América Tropical, e pertence à família Myrtaceae, gênero Psidium e espécie Psidium guajava L. Ela pode ser encontrada em todas as regiões do Brasil, sendo o Estado de São Paulo um dos principais produtores. Mundialmente o Brasil está entre os principais produtores, no entanto, sua participação no mercado internacional da fruta in natura ainda é inexpressiva. A goiaba é apreciada tanto fresca como processada industrialmente na forma de doces, compotas, geléias e sucos. Ela possui propriedades nutracêuticas devido a seus nutrientes, vitaminas e substâncias bioativas, como a vitamina C, além de possuir altos teores de carotenóides. Devido a crescente importância econômica da fruta, além do interesse em alimentos mais saudáveis, é importante conhecer os metabólitos presentes na goiaba, no intuito de promover seu consumo. Diferentes fatores podem influenciar na composição e qualidade da fruta, como tipo de solo, poda, fornecimento de água e adubação. Considerando a adubação, há poucos estudos no Brasil em relação aos níveis corretos para aumentar a produção sem afetar a qualidade do fruto. O objetivo desse trabalho foi avaliar características físicas e químicas da goiaba Paluma cultivada na região de Jaboticabal, submetida a diferentes doses de adubação nitrogenada, durante quatro diferentes estádios de desenvolvimento do fruto. As análises dos carboidratos e vitaminas foram realizadas por eletroforese capilar e dos carotenóides por cromatografia líquida em fase reversa, e os resultados avaliados por análise de componentes principais (PCA). Foi observada uma variação nos níveis de todos os metabólitos analisados em relação à quantidade de nitrogênio administrado, sendo que a concentração de glicose, frutose e sacarose na goiaba madura foram maiores nas amostras fertilizadas com duas doses de nitrogênio, assim como para o ácido ascórbico total e betacaroteno. Em geral, o nível de sacarose em relação à glicose e frutose diminuiu durante o desenvolvimento da fruta, enquanto o nível de betacaroteno aumentou para as amostras adubadas com uma e duas doses de nitrogênio. As análises de PCA permitiram diferenciar os estádios de desenvolvimento dos frutos, no entanto as diferentes doses de adubação não proporcionaram a formação de grupos distintos, indicando que cada variável foi influenciada diferentemente por cada nível de adubação. / The guava is the fruit from a guava tree, native from tropical America, belonging to the family of Myrtaceae, Psidium genus and Psidium guajava L. species. It can be found in all regions of Brazil, and the São Paulo State is one of the main producers. Globally, Brazil is among the main producers; however, its international market of the fresh fruit is still unimpressive. Guava is appreciated as both fresh and processed industrially as candies, jams, jellies, and juices. It has nutraceutical properties due to its nutrients, vitamins, and bioactive substances, such as vitamin C, besides having high levels of carotenoids. Due to the growing economic importance of this fruit and the interest in healthier foods, it is important to study the metabolites present in guava to promote their consumption. There are different factors that can influence the composition and quality of the fruit before harvesting, such as soil type, pruning, water supply, and fertilization. In relation to the fertilization, there are only a few studies in Brazil regarding the correct levels to increase the production of guava, maintaining the quality of the fruit. The aim of this study was to evaluate physical and chemical characteristics of guava Paluma from Jaboticabal region, under different nitrogen fertilizer levels during four stages of fruit development. The analyses of carbohydrates and vitamins were performed by capillary electrophoresis and the analyses of carotenoids were done by high performance liquid chromatography, and the results were evaluated by principal component analysis (PCA). It was observed a variation in levels of all metabolites in relation to nitrogen administered, being the concentration of glucose, fructose, and sucrose on the ripe guava higher on the samples fertilized with two doses of nitrogen, as well as for the total ascorbic acid and beta-carotene. In general, the levels o sucrose with respect to glucose and fructose decreased during the fruit development, whereas beta-corotene levels increased for the samples fertilized with one and two doses. The PCA data allowed differentiating among the stages of development, but the doses of nitrogen did not provide separate clusters, indicating that each variable was differently influenced by each fertilizer level.

by Lai, Shiu Hong. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 1993. / Includes bibliographical references (leaves 129-147). / TITLE PAGE --- p.I / THESIS COMMITTEE --- p.II / ABSTRACT --- p.III / ACKNOWLEDGMENTS --- p.V / ABBREVIATIONS --- p.VI / TABLE OF CONTENTS --- p.VII / LIST OF TABLES --- p.XI / LIST OF FIGURES --- p.XII / Chapter Chapter 1. --- Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction (AP-PCR) Analysis of Lent inula edodes / Chapter 1. --- Introduction / Chapter 1.1 --- General Introduction --- p.1 / Chapter 1.2 --- Purpose of Study --- p.4 / Chapter 2. --- Literature Review / Chapter 2.1 --- Biology of Lentinula edodes / Chapter 2.1.1 --- "Overview," --- p.6 / Chapter 2.1.2 --- Life Cycle of Lentinula edodes --- p.6 / Chapter 2.1.3 --- Dedikaryotization (Monokaryotization) --- p.12 / Chapter 2.2 --- Genome Analysis of the Mushroom --- p.13 / Chapter 2.3 --- Genetic Markers of Lentinula edodes / Chapter 2.3.1 --- Overview --- p.15 / Chapter 2.3.2 --- Auxotrophic Markers --- p.16 / Chapter 2.3.3 --- Biochemical Markers --- p.17 / Chapter 2.3.4 --- Molecular Markers / Chapter 2.3.4.1 --- RFLPs --- p.19 / Chapter 2.3.4.2 --- PCR-Based Markers --- p.20 / Chapter 2.4 --- Polymerase Chain Reaction (PCR) / Chapter 2.4.1 --- The principle of PCR --- p.22 / Chapter 2.4.2 --- Applications of PCR on Mushroom Studies --- p.26 / Chapter 2.5 --- Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction / Chapter 2.5.1 --- Principle of AP-PCR --- p.27 / Chapter 2.5.2 --- Applications of AP-PCR on Mushroom Studies --- p.29 / Chapter 2.6 --- Genetic Linkage Analysis / Chapter 2.6.1 --- Overview --- p.31 / Chapter 2.6.2 --- The LOD Score Method --- p.34 / Chapter 3. --- Materials and Methods / Chapter 3.1 --- Mushroom Strains and Culture Media --- p.36 / Chapter 3.2 --- Culture Method --- p.36 / Chapter 3.3 --- Solutions --- p.36 / Chapter 3.4 --- Primers --- p.38 / Chapter 3.5 --- Isolation of DNA from Lentinula edodes / Chapter 3.5.1 --- Mini-Preparation of Fungal DNA from L. edodes for PCR amplification --- p.42 / Chapter 3.5.2 --- Cesium Chloride Method: Mini-Preparation of Fungal DNA for PCR amplification --- p.43 / Chapter 3.6 --- Quantitative Measurements of DNA --- p.44 / Chapter 3.7 --- Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction (AP-PCR) for the Amplification of Genomic DNA of L. edodes --- p.45 / Chapter 3.8 --- Analysis of DNA Samples with Agarose Gel Electrophoresis --- p.46 / Chapter 3.9 --- Analysis of DNA Samples with Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) --- p.47 / Chapter 3.10 --- Silver Staining --- p.48 / Chapter 3.11 --- Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP) Analysis of Polymorphic DNA Fragments / Chapter 3.11.1 --- Elution and Amplification of DNA --- p.49 / Chapter 3.11.2 --- PCR-SSCP --- p.50 / Chapter 3.12 --- Segregation and Linkage Analysis / Chapter 3.12.1 --- Chi-Square Test --- p.51 / Chapter 3.12.2 --- The LOD Score Method --- p.52 / Chapter 4. --- Results / Chapter 4.1 --- DNA Extraction --- p.54 / Chapter 4.2 --- AP-PCR Amplified Fragments and Fragment Number --- p.58 / Chapter 4.3 --- Dedikaryotization Demonstration --- p.60 / Chapter 4.4 --- Identification of Polymorphic Genetic Markers --- p.64 / Chapter 4.4.1 --- AP-PCR Fingerprints from Single Primer --- p.66 / Chapter 4.4.2 --- AP-PCR Fingerprints Using Two Primers --- p.76 / Chapter 4.5 --- Segregation of Polymorphic Markers in Single Spore Isolates (SSIs) --- p.81 / Chapter 4.6 --- Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP) of Identified Polymorphic DNA Fragments --- p.86 / Chapter 4.7 --- Linkage Analysis of the Identified AP-PCR Markers --- p.89 / Chapter 5. --- Discussions / Chapter 5.1 --- DNA Extraction --- p.92 / Chapter 5.2 --- Arbitrary Primers --- p.93 / Chapter 5.3 --- Dedikaryotization Demonstration --- p.95 / Chapter 5.4 --- Identification of Polymorphic Genetic Markers --- p.96 / Chapter 5.5 --- AP-PCR Analysis of a Mushroom --- p.97 / Chapter 5.6 --- Mendelian Segregation Pattern of the Polymorphic Markers --- p.99 / Chapter 6. --- Conclusion and Further Studies --- p.101 / Chapter 2. Electrophoretic Karyotype Analysis of Lentinula edodes / Chapter 7. --- Introduction --- p.106 / Chapter 8. --- Literature Review / Chapter 8.1 --- Overview --- p.108 / Chapter 8.2 --- Protoplasts --- p.109 / Chapter 8.3 --- Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) / Chapter 8.3.1 --- Principle --- p.110 / Chapter 8.3.2 --- Applications of PFGE in Studies of Fungi --- p.112 / Chapter 9. --- Materials and Methods / Chapter 9.1 --- Strains and Culture Media --- p.114 / Chapter 9.2 --- Solutions --- p.114 / Chapter 9.3 --- Production of Lentinula edodes Protoplast --- p.115 / Chapter 9.4 --- Electrophoretic Conditions --- p.116 / Chapter 9.4.1 --- Condition for Saccharomyces cerevisiae chromosomes --- p.117 / Chapter 9.4.2 --- Condition for Candida albicans chromosomes --- p.117 / Chapter 9.4.3 --- Condition for Schizosaccharomyces pombe chromosomes --- p.118 / Chapter 10. --- Results / Chapter 10.1 --- Protoplast Production of Lentinula edodes / Chapter 10.1.1 --- Effects of Age of Mycelium on Protoplast Yield --- p.119 / Chapter 10.1.2 --- Effects of Various Osmotic Stabilizers on Protoplast Yield --- p.121 / Chapter 10.1.3 --- Effects of Two Lytic Enzymes on Protoplast Yield --- p.123 / Chapter 10.1.4 --- The Optimal Condition --- p.123 / Chapter 10.2 --- Electrophoretic Karyotype of L. edodes --- p.124 / Chapter 11. --- Discussions / Chapter 11.1 --- Protoplast Production of Lentinula edodes --- p.126 / Chapter 11.2 --- Electrophoretic Karyotype --- p.127 / REFERENCES

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A goiaba é o fruto da goiabeira, originária da América Tropical, e pertence à família Myrtaceae, gênero Psidium e espécie Psidium guajava L. Ela pode ser encontrada em todas as regiões do Brasil, sendo o Estado de São Paulo um dos principais produtores. Mundialmente o Brasil está entre os principais produtores, no entanto, sua participação no mercado internacional da fruta in natura ainda é inexpressiva. A goiaba é apreciada tanto fresca como processada industrialmente na forma de doces, compotas, geléias e sucos. Ela possui propriedades nutracêuticas devido a seus nutrientes, vitaminas e substâncias bioativas, como a vitamina C, além de possuir altos teores de carotenóides. Devido a crescente importância econômica da fruta, além do interesse em alimentos mais saudáveis, é importante conhecer os metabólitos presentes na goiaba, no intuito de promover seu consumo. Diferentes fatores podem influenciar na composição e qualidade da fruta, como tipo de solo, poda, fornecimento de água e adubação. Considerando a adubação, há poucos estudos no Brasil em relação aos níveis corretos para aumentar a produção sem afetar a qualidade do fruto. O objetivo desse trabalho foi avaliar características físicas e químicas da goiaba Paluma cultivada na região de Jaboticabal, submetida a diferentes doses de adubação nitrogenada, durante quatro diferentes estádios de desenvolvimento do fruto. As análises dos carboidratos e vitaminas foram realizadas por eletroforese capilar e dos carotenóides por cromatografia líquida em fase reversa, e os resultados avaliados por análise de componentes principais (PCA). Foi observada uma variação nos níveis de todos os metabólitos analisados em relação à quantidade de nitrogênio administrado, sendo que a concentração de glicose, frutose e sacarose na goiaba madura foram maiores nas amostras fertilizadas com duas doses de nitrogênio, assim como para o ácido ascórbico total e betacaroteno. Em geral, o nível de sacarose em relação à glicose e frutose diminuiu durante o desenvolvimento da fruta, enquanto o nível de betacaroteno aumentou para as amostras adubadas com uma e duas doses de nitrogênio. As análises de PCA permitiram diferenciar os estádios de desenvolvimento dos frutos, no entanto as diferentes doses de adubação não proporcionaram a formação de grupos distintos, indicando que cada variável foi influenciada diferentemente por cada nível de adubação. / The guava is the fruit from a guava tree, native from tropical America, belonging to the family of Myrtaceae, Psidium genus and Psidium guajava L. species. It can be found in all regions of Brazil, and the São Paulo State is one of the main producers. Globally, Brazil is among the main producers; however, its international market of the fresh fruit is still unimpressive. Guava is appreciated as both fresh and processed industrially as candies, jams, jellies, and juices. It has nutraceutical properties due to its nutrients, vitamins, and bioactive substances, such as vitamin C, besides having high levels of carotenoids. Due to the growing economic importance of this fruit and the interest in healthier foods, it is important to study the metabolites present in guava to promote their consumption. There are different factors that can influence the composition and quality of the fruit before harvesting, such as soil type, pruning, water supply, and fertilization. In relation to the fertilization, there are only a few studies in Brazil regarding the correct levels to increase the production of guava, maintaining the quality of the fruit. The aim of this study was to evaluate physical and chemical characteristics of guava Paluma from Jaboticabal region, under different nitrogen fertilizer levels during four stages of fruit development. The analyses of carbohydrates and vitamins were performed by capillary electrophoresis and the analyses of carotenoids were done by high performance liquid chromatography, and the results were evaluated by principal component analysis (PCA). It was observed a variation in levels of all metabolites in relation to nitrogen administered, being the concentration of glucose, fructose, and sucrose on the ripe guava higher on the samples fertilized with two doses of nitrogen, as well as for the total ascorbic acid and beta-carotene. In general, the levels o sucrose with respect to glucose and fructose decreased during the fruit development, whereas beta-corotene levels increased for the samples fertilized with one and two doses. The PCA data allowed differentiating among the stages of development, but the doses of nitrogen did not provide separate clusters, indicating that each variable was differently influenced by each fertilizer level.

Nos últimos anos a eletroforese capilar tem substituído a eletroforese em gel e está sendo usada para uma ampla variedade de aplicações forenses, incluindo tipagem de DNA. A fim de superar as desvantagens com relação à análise simultânea de amostras que a eletroforese em gel oferece, equipamentos com arranjos de capilares foram idealizados, assim como a possibilidade de análises multiplexadas em um único capilar por meio da utilização de corantes intercaladores. Neste trabalho foi otimizada a metodologia para amplificação de DNA pela reação em cadeia da polimerase para sete primers correspondentes a sete regiões padronizadas e legalmente aceitas para testes de paternidade. Três casos foram avaliados por eletroforese em microchip, indicando que um método mais reprodutível e de maior resolução deveria ser utilizado, fato que levou ao desenvolvimento de um método para separação de um padrão de tamanho de DNA de 25 pares de base por eletroforese capilar em soluções poliméricas em um equipamento comercial. Este método foi aplicado à separação do mesmo padrão intercalado a um corante dimérico em um equipamento de eletroforese capilar lab-made miniaturizado, com detecção espectrofotométrica na região visível, sugerindo a possibilidade de o equipamento desenvolvido ser utilizado para análises genéticas multiplexadas com custo e tempo minimizados. / In recent years capillary electrophoresis has substituted slab gel electrophoresis and has been used in a variety of forensic applications, such as DNA typing. In order to overcome the disavantages regarding the simultaneous samples analysis that slab gel offers, equipments with capillary arrays were developed, as well as the possibility of multiplex analysis in a single capillary by using intercalating dyes. In this work the metodology to amplify DNA by polimerase chain reaction was studied to seven primers corresponding to seven standardized and legaly accepted regions in paternity tests. Three cases were evaluated by microchip electrophoresis, indicating the need for a more reproductive and with better resolution method has to be used. This fact lead to the development of a method to separate a 25 base pairs DNA ladder by gel capillary electrophoresis in a comercial equipment. In the sequence, this method was apllied to the separation of the same ladder intercalated to a dimeric dye in a lab-made miniaturized capillary electrophoresis system with spectrophotometric detection at visible region, suggesting that the developed equipment can be used for multiplexed genetic analysis with reduced cost and time.

Li, Yuefang. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2010. / Includes bibliographical references (leaves 46-48). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / 摘要 --- p.ii / Acknowledgement --- p.iii / Table of contents --- p.iv / Chapter Chapter 1 --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Introduction to protein crystallization --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- Principles of protein crystallization --- p.2 / Chapter 1.1.2 --- Classical methods to crystallize protein --- p.4 / Chapter 1.2 --- Crystal growth in unique environments: the pursuit of better crystals --- p.6 / Chapter 1.2.1 --- Protein crystallization in space --- p.6 / Chapter 1.2.2 --- Crystallization in gel and capillary --- p.7 / Chapter 1.3 --- Microfluidic methods for protein crystallization: high through-put screenings --- p.9 / Chapter 1.3.1 --- Valve-controlled methods --- p.10 / Chapter 1.3.2 --- Droplet-based methods --- p.11 / Chapter 1.3.3 --- Microwell-based methods --- p.11 / Chapter 1.4 --- Objective of the project --- p.13 / Chapter Chapter 2 --- Rehydratable hydrogel in nanoliter microwells --- p.15 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.15 / Chapter 2.2 --- Experimental --- p.17 / Chapter 2.2.1 --- Fabrication of SU-8 mould --- p.17 / Chapter 2.2.2 --- Fabrication of the PDMS device --- p.19 / Chapter 2.2.3 --- Liquid dispensing in PDMS device --- p.20 / Chapter 2.2.4 --- Polymerization of PA gel --- p.21 / Chapter 2.2.5 --- Drying and Rehydration of PA gel --- p.22 / Chapter 2.3 --- Results and discussions --- p.23 / Chapter 2.3.1 --- Preparation of PA gel in PDMS device --- p.23 / Chapter 2.3.2 --- Immobilization of PA gel in microwells --- p.25 / Chapter 2.3.3 --- Dehydration and Rehydration of PA gel --- p.25 / Chapter 2.3.4 --- Liquid dispensing in the gel-preloaded microwells --- p.29 / Chapter 2.4 --- Conclusion --- p.31 / Chapter Chapter 3 --- Protein crystallization by gel-based FID --- p.32 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.32 / Chapter 3.2 --- Experimental --- p.34 / Chapter 3.2.1 --- Conditions used for crystallize proteins --- p.34 / Chapter 3.2.2 --- Protein crystallization by microbatch method --- p.34 / Chapter 3.2.3 --- Protein crystallization in microchip --- p.35 / Chapter 3.3 --- Results and discussions --- p.35 / Chapter 3.3.1 --- Crystallization in microplate --- p.36 / Chapter 3.3.2 --- Crystallization in microwells --- p.38 / Chapter 3.4 --- Conclusion --- p.41 / Chapter Chapter 4 --- Conclusions --- p.43 / Chapter 4.1 --- Summary of the work --- p.43 / Chapter 4.2 --- Future perspectives --- p.44 / Reference --- p.46

O hiperadrenocorticismo é uma das endocrinopatias mais comuns em cães, sendo caracterizado pela exposição excessiva de glicocorticóides secretados pelas adrenais. A hipercortisolemia crônica pode promover várias complicações, incluindo hipertensão sistêmica e glomerulonefrite. A glomerulonefrite pode desencadear variáveis graus de proteinúria e uma tendência de evolução para doença renal crônica. A perda de proteínas na urina, principalmente da albumina, é uma característica das doenças glomerulares e a determinação de variáveis laboratoriais, como a razão proteína:creatinina urinária (RPC), albuminúria (teste de ELISA) e eletroforese das proteínas urinárias, são recomendadas para a elucidação do diagnóstico. Assim, o objetivo do estudo é avaliar a relação entre proteinúria e hipertensão arterial sistêmica em cães com hiperadrenocorticismo e verificar, pela avaliação da albuminúria e do peso molecular das proteínas urinárias, o segmento do néfron que foi comprometido ou lesado. Foram avaliados 30 cães com diagnóstico de hiperadrenocorticismo, subdivididos em 13 cães com hipertensão arterial sistêmica (grupo I) e 17 cães normotensos (grupo II). Foram determinados a razão proteína:creatinina urinária (RPC); a albuminúria pela avaliação da albumina normalizada e razão albumina: creatinina urinária (RAC) e a eletroforese de proteínas pela técnica em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio (SDS - PAGE). Os resultados foram comparados com os dados obtidos de 30 cães clinicamente saudáveis e foi constatado que não houve influência da hipertensão arterial sistêmica nos cães com hiperadrenocorticismo em relação à quantificação da albuminúria, determinada pelo método ELISA, e nem na qualidade e quantidade das bandas de proteínas de baixo (< 60 kDa) e de alto peso molecular (> 60 kDa) determinada pela eletroforese. No entanto foi determinado que cães com hiperadrenocorticismo podem desenvolver lesões glomerulares e tubulares, caracterizadas pela presença de albuminúria e de proteínas de alto e de baixo pesos moleculares, independentemente da presença de hipertensão arterial sistêmica. Concluindo que os métodos laboratoriais, a eletroforese de proteína urinária em gel de poliacrilaminda associada à avaliação quantitativa da proteína total, como a determinação quantitativa da albuminúria, são passíveis de serem empregadas para a avaliação dos segmentos dos néfrons comprometidos que causaram as perdas de proteínas na urina. / Hyperadrenocorticism is a common endocrinopathie in dogs characterized by excessive glucocorticoid expousure secondary to adrenal secretion. Chronic hypercortisolemia may promote several complications, including sistemic hypertension and glomerulonephritis. Glomerulonephritis may lead to different proteinuria degrees and chronic renal disease. Urine protein loss, specially albumin, is characteristic in glomerular diseases. Laboratorial determination by the urinary protein/creatinin ratio (PCR), albuminuria (ELISA test) and urinary protein electrophoresis are recommended for diagnosis. The aim of this study is to evaluate the relationship between proteinuria and sistemic arterial hypertension in dogs with hyperadrenocorticism and to identify the nephron injured segment by evaluating albuminuria and urinary protein molecular weight. Thrithy dogs with hyperadrenocorticism were subdivided in 2 groups as following: 13 dogs with sistemic arterial hypertension (group I) and 17 normal dogs (group II). Urinary protein/creatinin ratio (PCR); albuminuria using the evaluation of normalized albumin and urinary albumin/creatinin ratio (ACR); and protein electrophoresis using polyacrylamide gel with sodium dodecil sulfate (SDS - PAGE) were performed. Results were compared with data of 30 clinically healthy dogs. No influence of sistemic arterial hypertension in dogs with hyperadrenocorticism was noticed in albuminuria magnitude using the ELISA method, nor in the quality and quantity of low (<60 kDa) and high (> 60 kDa) molecular weight bands observed in electrophoresis. However, dogs with hyperadrenocorticism can develop glomerular and tubular lesions, characterized by albuminuria and by the presence of high and low molecular weight proteins in urine independently of sistemic arterial hypertension. Furthermore, urinary protein electrophoresis in polyacrylaminde gel associated to quantitative evaluation of total protein such as the quantitative determination of the albuminuria, may be used in evaluating committed nephrons segments that caused urine protein loss.

O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento da semente de Araucaria angustifolia através da proteômica comparativa, buscando compreender as alterações fisiológicas e metabólicas que ocorrem durante esse processo. Inicialmente, foram avaliados três diferentes metodologias de extração de proteínas. A metodologia composta por solução de extração contendo 7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 1% de ditiotreitol, 2% de Triton-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 5 µM de pepstatina, seguido de precipitação em 20% de ácido tricloroacético apresentou géis de maior resolução e reprodutibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para o estudo das alterações no proteoma da semente de A. angustifolia. Uma dificuldade associada ao estudo do proteoma de espécies não sequenciadas é a baixa representatividade nos bancos de dados protéicos, resultando em identificações baseadas em homologia. Estratégias proteômicas baseadas em fracionamento em gel resultam em grandes contaminações por fragmentos de queratina. Sendo assim, foi desenvolvido um programa de remoção de espectros de baixa qualidade para utilização em proteômica baseada em homologia. As análises mostraram que o programa reduz o tempo de busca, melhora a qualidade dos alinhamentos e não resulta em perda de identificações positivas. Finalmente, utilizando as metodologias descritas, foram estudadas as alterações no proteoma durante o desenvolvimento da semente de A. angustifolia. Noventa e seis proteínas foram identificadas e agrupadas de acordo com sua função biológica e padrão de detecção. Os resultados obtidos permitiram o estabelecimento de marcadores protéicos no início e final do desenvolvimento embrionário. A análise das proteínas abundantes no início da embriogênese indica um maior controle no metabolismo oxidativo em relação aos estádios finais. Contrariamente, o final da embriogênese é caracterizado por um alto metabolismo de assimilação de carbono e acúmulo de proteínas de reserva. As implicações dos resultados obtidos no controle e melhoramento de sistemas de embriogênese somática na espécie também foram discutidas. / The aim of the present work was to characterize the seed development of Araucaria angustifolia through proteomics in order to understand the physiological and biochemical changes during this process. For that, initially, three different protein extraction methods were evaluated. The extraction based on protein solubilization in 7 M urea, 2 M thiourea, 1% dithiothreitol, 2% Triton-100, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 5 µM pepstatin, followed by 20% trichloroacetic acid precipitation showed the highest gel resolution and reprodutivity and, thus, was chosen to be used in the analysis of the proteome of A. angustifolia seeds. One aspect that hampers the proteome study of unsequenced species is the low protein representativity in databases. So, protein identification is usually carried out through homology. Strategies based on 2-DE result in high keratin contamination. In the present work a spectra filtering software was developed and evaluated for use in homology driven proteomics. The software reduced the time of search, improved alignment quality and did not result in lost of positive identifications. Finally, using the described strategies, the changes in the proteome of A. angustifolia seeds were studied. Ninety six proteins were identified and classified according to their biological functions and expression profiles during seed development. The identified proteins may be used as protein markers of early and late embryogenesis. Proteins involved in the control of oxidative metabolism were highly expressed during the early stages of seed development; while, carbon metabolism and storage proteins were highly expressed in late stages. Considerations on the improvement and control of somatic embryogenesis through medium manipulation and protein markers screening using data generated are also discussed.