Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-05T17:48:01Z No. of bitstreams: 1 2016_JoãoHeitorColombelliManfrãoNetto.pdf: 1500333 bytes, checksum: 58867afadd739ebf359eaf75cd3a70fc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-20T19:51:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JoãoHeitorColombelliManfrãoNetto.pdf: 1500333 bytes, checksum: 58867afadd739ebf359eaf75cd3a70fc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T19:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JoãoHeitorColombelliManfrãoNetto.pdf: 1500333 bytes, checksum: 58867afadd739ebf359eaf75cd3a70fc (MD5) / Humicolagriseavar.thermoidea é um ascomiceto termofílicoprodutor de enzimas lignocelulolíticas, principalmente celulases e xilanases, sendo proposto para utilização na bioconversão de resíduos agrícolas em produtos úteis. A metilação de DNA é um mecanismo epigenético de regulação gênica que tem sido amplamente estudado, sendo geralmente associado à repressão transcricional. Enzimas DNA metiltransferases (DNMsT) são responsáveis por realizar a metilação do DNA. Drogas que inibem as DNMTs são frequentemente utilizadas em estudos de patologias como o câncer, entre outros, porém nada se sabe a respeito de um possível efeito na produção, atividade ou secreção de enzimas hidrolíticas de fungos, assim como na regulação da expressão dos respectivos genes. No presente trabalho, avaliou-se o efeito da droga 5-aza-2’-desoxicitidina (5-AZA; inibidora da ação de DNMTs), em duas concentrações (25 e 50 µM), sobre a atividade enzimática secretada e os níveis de transcritos de genes de celulase e xilanase de H. grisea crescido em diferentes resíduos agrícolas [bagaço de cana de açúcar explodido a vapor (BCA), feno moído e farelo de trigo (FT)], e em glicose. A presença de 5-AZA mostrou-se relacionada a um aumento de atividade de CMCase após crescimento do fungo H. grisea em FT 12 h/50 μM (67,15%) e em glicose 2 h/50 μM (47,62%). Uma diminuição dessa atividade foi verificada quando do crescimento do fungo em BCA 96 h em 5-AZA 25 (29,12%) e 50 µM (29,95%).A atividade de xilanase secretada por H. grisea, na presença de 5-AZA, diminuiu em cultivo em BCA/96 h 25 (32,39%) e 50 µM (30,59%) e FT 2 h/50 μM (59,72%). Porém, em crescimento em FT por 12 e 96 h, na concentração de 25 μM, a 5-AZA levou a um aumento na atividade xilanolítica (19,97% e 25,35%, respectivamente).A produção de proteínas totais secretadas para o sobrenadante não foi afetada pelo crescimento de H. grisea em presença de 5-AZA, independentemente do substrato empregado como fonte de carbono.A 5-AZA afetou diferencialmente a expressão dos genes de celulase egl1, cbh.1.1, cbh1.2 e de xilanasexyn1 e xyn2 de H. grisea, provocando diminuição ou aumento do acúmulo de transcritos, dependendo da concentração utilizada e do resíduo agrícola empregado para o crescimento. Já em crescimento em glicose, a 5-AZA mostrou-se capaz de superar a repressão catabólica e aumentar os níveis dos transcritos de egl1, cbh1.1, cbh1.2 e xyn2. O acúmulo de transcritos dos genes de celulase egl4 e bgl4 não foi alterado em nenhuma condição experimental. Os dados desse trabalho indicam, pela primeira vez na literatura científica, que a modulação epigenética, no nível de metilação do DNA, exerce papel na regulação da expressão dos genes de celulase e xilanase de fungos e que pode ser empregada visando à otimização de processos biotecnológicos de conversão de resíduos agrícolas em produtos de maior valor agregado. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Humicolagrisea var. thermoidea is a thermophilicascomycete that produces lignocellulolytic enzymes, particularly cellulases and xylanases and, in this view, it is proposed as a bioagent for the conversion of agricultural residues into useful byproducts. DNA methylation is an epigenetic mechanism of gene regulation that has been widely studied, being generally associated with transcriptional repression. DNA methyltransferases (DNMTs) are the enzymes responsible for performing DNA methylation. Drugs that inhibit DNMTs activity are frequently employed in studies of diseases such as cancer, amongst others, but nothing is known about a possible effect on the production, secretion, or activity of fungal hydrolytic enzymes, as well as on the regulation of expression the respective genes. In this study we evaluated the effect of the drug 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AZA; an inhibitor of DNMTs activity) at two concentrations (25 and 50 µM) on secreted enzyme activity and on the levels of xylanase and cellulase gene transcripts from H. grisea grown in different agricultural residues [steam exploded sugarcane bagasse (BCA), ground hay and wheat bran (FT)], as well as in glucose, as the sole carbon source.The presence of 5-AZA led to an increase in CMCase activity after H. grisea was grown in FT 12 h/50 µM (67,18%) and glucose 2 h/50 µM (47,62%). A decrease in this activity was observed when the fungus was grown in BCA in the presence of 25 (29,12%) or 50 µM (29,95%) 5-AZA for 96 h.The xylanase activity secreted by H. grisea grown in the presence of 5-AZA decreased upon cultivation on BCA for 96 h 25 (32,39%) and 50 µM (30,59%) and on FT 2 h/50 µM (59,72%). However, upon growth on FT for 12 and 96 h, at a concentration of 25 µM, 5-AZA led to an increased xylanolytic activity (19,97% and 25,35%, respectively).The production of total secreted proteins into the supernatant was not affected by H. grisea growth in the presence of 5-AZA, regardless of the substrate used as the carbon source.5-AZA differentially affected the expression of H. grisea egl1, cbh1.1 and cbh1.2 cellulase genes, and of the xyn1 and xyn2 xylanase genes, causing decreased or increased accumulation of transcripts, depending on the concentration used and on the agricultural residue employed to support fungal growth. Notably, when H. grisea was grown on glucose as the sole carbon source, 5-AZA overcame catabolite repression and increased the levels of the egl1, cbh1.1, cbh1.2 and xyn2 transcripts. The accumulation of transcripts of the egl4 and bgl4 cellulase genes was not altered under any experimental condition. Our data indicate that epigenetic modulation, at the level of DNA methylation, plays a role in regulating the expression of fungal cellulase and xylanase genes. This information is pioneering in the scientific literature and can be used with the aim of optimizing biotechnological processes for the conversion of agricultural wastes into valuable products.

Orientador: Mirela Tinucci Costa / Resumo: - Cutaneous lymphoma constitutes a form of extranodal lymphoma that affects initially the skin and/or adnexal structures and eventually presents an aggressive clinical behavior, causing internal organ infiltration in late-stage disease. The main immunophenotype is T-cell lymphoma (CTCL) and it represents the most common diagnosed type. It is expected that dogs with CTCL develop resistance to chemotherapy at any point during treatment, resulting in short survival times. A need for new therapeutic targets that improve survival expectation in dogs with CTCL is increasing. In humans, therapies based on epigenetic mechanisms helped to control the disease, since epigenetics became a main objective in the search for longer clinical responses in advance-stages. In the first two reported chapters, CTCL is described with particularities of international literature that contrast with data found in this institution, as well as, the role of epigenetics in the neoplasia carcinogenesis and the mechanism of histone modification as a base for treatment. More specifically, in the second chapter, 21 dogs with CTCL were defined as having high grade CTCL due to their large cell size, absence of epithelial tropism, mean value of Ki67 of 63,9% and estimated survival time of 31 days. Clinicopathological characteristics were analyzed for identifying prognostic markers, being the intrathoracic involvement caused by lymphoma seen on thoracic radiography an independent prognostic factor after multivaria... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-26Bitstream added on 2014-12-02T11:21:03Z : No. of bitstreams: 1 000774986_20150601.pdf: 1296692 bytes, checksum: 21e36e9a6a948cafbd5e35952816c786 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:46Z: 000774986_20150601.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:11Z : No. of bitstreams: 1 000774986.pdf: 9422731 bytes, checksum: e40055dff4f7f745ade353914c6e7948 (MD5) / Os produtos naturais têm desempenhado um papel importante pela humanidade, no uso da medicina popular e na geração da descoberta de novos fármacos. Fungos endofíticos são micro-organismos que vivem em associação mutualística com a espécie hospedeira trazendo benefícios a ambos, e são uma promissora fonte de produtos naturais. A espécie vegetal Eugenia jambolana tem sido intensamente explorada química e biologicamente devido a seus usos populares e por apresentar diversas atividades biológicas. No intuito de explorar a potencionalidade dessa espécie vegetal, E. jambolana foi submetida ao isolamento dos fungos endofíticos presentes nas folhas, caule e frutos, dos quais foram isolados treze fungos endofíticos. Estes endófitos foram cultivados em escala reduzida em Czapek (400 mL) para obtenção dos extratos brutos AcOEt. Os extratos brutos AcOEt foram submetidos a análises químicas (cromatografia em camada delgada comparativa, cromatografia líquida de alta eficiência e ressonância magnética nuclear de 1H) e biológicas (ensaios antioxidante, antifúngico, anticolinesterásico e citotóxico). Todos os extratos brutos apresentaram pelo menos uma atividade biológica positiva, o que adicionado as análises químicas permitiram selecionar dois fungos endofíticos para crescimento em escala ampliada, e isolamento dos metabólitos secundários. Destes, o fungo endofítico isolado do caule de E. jambolana codificado como Ej-c3 foi identificado como Saccharicola sp., foi possível isolar 7 substâncias das quais 4 são inéditas (4-7), os compostos 4 e 5 foram inativo nos ensaios realizados. Do estudo químico do fungo endofítico Botryosphaeria parva (Ej-f1), isolado das folhas, foram isolados 4 substâncias da classe das isocumarinas [meleina (3), 4-hidroximeleina (11), 5-hidroximeleina (13), 7-hidroximeleina (12)], as substâncias 3 e 13 foram ativas no ensaio antifúngico contra C. sphaerospermum. No intuito de aumentar a... / The natural products have occuped an important role for humanity, in the use of folk medicine and in the generation of drug discovery. Endophytic fungi are microorganism that living in a mutualist association with host species, refleting benefits to both, and they are a promising source for natural products. The vegetal species Eugenia jambolana has been intensively explored chemically and biologically, because of its popular uses and it has several biological activities. In order to explore the potencionality of this plant species, E. jambolana was submitted to isolation of endophytic fungi in the leaves stems and fruits, of which thirteen endophytic fungi were isolated. The endophytes were cultived in small scale in Czapek (400 mL) to give the EtOAc crude extract. The EtOAc crude extract were submited to chemistry (thin layer chromatography, high performace liquid chromatography and 1H nuclear magnetic ressonance) and biological (antioxidant, antifungal, anticholinesterase and cytotoxic activities) analysis. All of crude extract showed at least one positive biological activity, which added the chemical analyzes allowed us to select two endophytic fungi to growing on a larger scale, and isolation of secondary metabolites. The endophytic fungus isolated from stems of E. jambolana encoded Ej-c3 was identified as Saccharicola sp. it was isolated 7 substances of which 4 are new (4-7). The substances 4 e 5 were inactive in the biological assays. Chemical study of Botryosphaeria parva (Ej-f1) isolated from leaves, was isolated 4 isocoumains [melein (3), 4-hidroxymelein (11), 5-hidroxymelein (13), 7-hidroxymelein (12)]. The substances 3 and 13 were active in antifungal assay agains the fungus C. sphaerospermum. In order to increase the metabolite production and activate the silent biossintetic pathway, the epigenetic appear as a useful and simple tool to gene expression. Lecythophora sp. an endolichenic fungus from Parmotrema tinctorum, was...

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-01T13:08:28Z No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-07-26T22:27:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T22:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FabianaBrandãoAlvesSilva.pdf: 6438172 bytes, checksum: 73b5269f03e7db3bc90d6fea9386fb12 (MD5) / Os genes de histonas desacetilases (HDAC) são altamente conservados entre diferentes espécies e dirigem importantes processos epigenéticos na manutenção da estrutura e funcionamento do genoma. Entretanto, o papel das HDAC na regulação dos traços de virulência de patógenos permanece pobremente explorado. O fungo patogênico em humanos Cryptococcus neoformans passa por mudanças fenotípicas que promovem persistência e sobrevida dentro do hospedeiro ou em nichos ecológicos. Tais mudanças estão associadas à regulação diferencial da expressão gênica. Neste contexto, inicialmente foi avaliado o efeito de dois inibidores químicos de histona desacetilases (HDACi), o butirato de sódio (NaBut) e a tricostatina A (TSA), sobre as células de C. neoformans. Os resultados demonstraram que ambos inibidores foram capazes de afetar os principais traços de virulência de C. neoformans. Em seguida, foram identificados e deletados 8 genes de HDAC de Classe I e Classe II em C. neoformans. A maioria dos processos previamente associados à virulência em C. neoformans foi afetada pelo tratamento com HDACi eou pela deleção de genes: a capacidade de crescimento a 37 – 39 ºC, a formação da cápsula polissacarídica, a produção de melanina, as atividades de fosfolipase e de proteases, a formação de hifas de acasalamento e a integridade da parede celular. Os mutantes de HDAC também mostraram defeitos na sobrevivência intracelular quando co-cultivados com macrófagos murinos, assim como virulência comprometida nos modelos de infecção de Galleria mellonella e camundongos. A histona desacetilase Clr3 foi apontada como um importante regulador da virulência em C. neoformans. A linhagem de C. neoformans clr3mutante mostrou-se hipovirulenta em ambos os modelos de criptococose animal. Outrossim, a análise de RNA-seq indicou que a proteína Clr3 regula a expressão de vários genes importantes para a adaptação e sobrevivência de C. neoformans ao ambiente hospedeiro. Os resultados indicam que a remodelação da cromatina, por meio das conservadas HDAC, é um importante mecanismo envolvido na virulência de C. neoformans. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Histone Deacetylase (HDAC) genes are highly conserved among different species, directing one of the most important epigenetic processes regulating gene expression – chromatin remodeling. However, the role of HDACs in the regulation of virulence traits in pathogens remains poorly explored. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans undergoes phenotypic changes to promote persistence and survival inside the host or in specific ecological niches. Very likely, these changes are associated with epigenetic regulation. In this context, we initially evaluated the effect of two chemical inhibitors of histone deacetylases (HDACi): Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA). The results showed that both were able to impair the expression of the main virulence traits of C. neoformans. Based on these data, we identified and deleted eight genes encoding predicted class I/II HDACs in C. neoformans. In this way, we predicted that we would be able to assign specific function to each HDAC, especially in regards to virulence trait expression. Phenotypes of specific HDAC mutant strains indicate that individual proteins control non-identical but overlapping cellular processes associated with virulence. In the other hand, for some genes we also have observed an opposite regulation. Most processes previously related to virulence in C. neoformans were affected here, such as thermotolerance (growth at 37-39 oC); capsule, melanin and protease formation; and cell wall integrity. Additionally, defects in mating and hyphal development were observed for the clr3HDAC mutant strain. HDAC mutants also displayed defects in intracellular survival when co-cultured with activated macrophages, a finding highly correlated with altered virulence in vivo. Also, we tested the virulence in Galleria mellonella and mice. Overall our results support that the Clr3 histone deacetylase is a newly identified regulator of fungal virulence. The corresponding mutant was hypovirulent in both animal models of cryptococcosis. Furthermore transcriptional profiling shows that the Clr3 protein regulates the expression of many genes that are important for the adaptation of C. neoformans for survival inside the host. Our work displays that chromatin remodeling by the conserved histone deacetylases is an important mechanism behind the virulence of C. neoformans.

Orientador: Angela Regina Araujo / Banca: Isabele Rodrigues Nascimento / Banca: Edson Rodrigues Filho / Banca: Carmen Lúcia Cardoso / Banca: Luiz Alberto Beraldo de Moraes / Resumo: Os produtos naturais têm desempenhado um papel importante pela humanidade, no uso da medicina popular e na geração da descoberta de novos fármacos. Fungos endofíticos são micro-organismos que vivem em associação mutualística com a espécie hospedeira trazendo benefícios a ambos, e são uma promissora fonte de produtos naturais. A espécie vegetal Eugenia jambolana tem sido intensamente explorada química e biologicamente devido a seus usos populares e por apresentar diversas atividades biológicas. No intuito de explorar a potencionalidade dessa espécie vegetal, E. jambolana foi submetida ao isolamento dos fungos endofíticos presentes nas folhas, caule e frutos, dos quais foram isolados treze fungos endofíticos. Estes endófitos foram cultivados em escala reduzida em Czapek (400 mL) para obtenção dos extratos brutos AcOEt. Os extratos brutos AcOEt foram submetidos a análises químicas (cromatografia em camada delgada comparativa, cromatografia líquida de alta eficiência e ressonância magnética nuclear de 1H) e biológicas (ensaios antioxidante, antifúngico, anticolinesterásico e citotóxico). Todos os extratos brutos apresentaram pelo menos uma atividade biológica positiva, o que adicionado as análises químicas permitiram selecionar dois fungos endofíticos para crescimento em escala ampliada, e isolamento dos metabólitos secundários. Destes, o fungo endofítico isolado do caule de E. jambolana codificado como Ej-c3 foi identificado como Saccharicola sp., foi possível isolar 7 substâncias das quais 4 são inéditas (4-7), os compostos 4 e 5 foram inativo nos ensaios realizados. Do estudo químico do fungo endofítico Botryosphaeria parva (Ej-f1), isolado das folhas, foram isolados 4 substâncias da classe das isocumarinas [meleina (3), 4-hidroximeleina (11), 5-hidroximeleina (13), 7-hidroximeleina (12)], as substâncias 3 e 13 foram ativas no ensaio antifúngico contra C. sphaerospermum. No intuito de aumentar a... / Abstract: The natural products have occuped an important role for humanity, in the use of folk medicine and in the generation of drug discovery. Endophytic fungi are microorganism that living in a mutualist association with host species, refleting benefits to both, and they are a promising source for natural products. The vegetal species Eugenia jambolana has been intensively explored chemically and biologically, because of its popular uses and it has several biological activities. In order to explore the potencionality of this plant species, E. jambolana was submitted to isolation of endophytic fungi in the leaves stems and fruits, of which thirteen endophytic fungi were isolated. The endophytes were cultived in small scale in Czapek (400 mL) to give the EtOAc crude extract. The EtOAc crude extract were submited to chemistry (thin layer chromatography, high performace liquid chromatography and 1H nuclear magnetic ressonance) and biological (antioxidant, antifungal, anticholinesterase and cytotoxic activities) analysis. All of crude extract showed at least one positive biological activity, which added the chemical analyzes allowed us to select two endophytic fungi to growing on a larger scale, and isolation of secondary metabolites. The endophytic fungus isolated from stems of E. jambolana encoded Ej-c3 was identified as Saccharicola sp. it was isolated 7 substances of which 4 are new (4-7). The substances 4 e 5 were inactive in the biological assays. Chemical study of Botryosphaeria parva (Ej-f1) isolated from leaves, was isolated 4 isocoumains [melein (3), 4-hidroxymelein (11), 5-hidroxymelein (13), 7-hidroxymelein (12)]. The substances 3 and 13 were active in antifungal assay agains the fungus C. sphaerospermum. In order to increase the metabolite production and activate the silent biossintetic pathway, the epigenetic appear as a useful and simple tool to gene expression. Lecythophora sp. an endolichenic fungus from Parmotrema tinctorum, was... / Doutor

A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.

A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12339_Dissertação_Vinicius Mendes Eduardo.pdf: 1080730 bytes, checksum: 5a5942cebcb4a270d6c8129b73cfc107 (MD5) Previous issue date: 2018-03-19 / Determinação e validação de biomarcadores tumorais são importantes para avaliar o prognóstico de pacientes com câncer. Este estudo teve como objetivo avaliar o perfil de metilação e de expressão do gene CDKN2a como possível a biomarcador de prognóstico em pacientes com carcinoma epidermóide oral (CEO). Foram selecionados 115 casos com diagnóstico conclusivo de CEO destes 70 apresentavam tecido tumoral congelado. Dados clínico-patológicos foram obtidos por meio de entrevista e análise de prontuários. Cinquenta e cinco amostras de DNA com qualidade obtidas foram submetidas a PCR específica para metilação, e os casos positivos foram submetidos ao sequenciamento de Sanger para avaliar os dinucleotídeos citosina-guanina hipermetilados. Expressão da proteína p16 foi avaliada por imunohistoquímica. As análises estatísticas relacionando os resultados foram feitas e as curvas de Sobrevida Global e Sobrevida Livre de Doença foram elaboradas pelo método de Kaplan-Meier. A frequência de hipermetilação do CDKN2a na população estudada foi de 36,4%, sendo que a maior parte das citosinas localizadas em regiões CpG estavam hipermetiladas e citosinas fora da região CG também apresentaram metilação. A expressão de p16 foi predominantemente baixa (76,7%) nestas amostras. O perfil de metilação não mostrou associação com os indicadores de prognóstico, bem como não interferiu na Sobrevida Global e Livre de Doença. No entanto, os indicadores de prognóstico tamanho do tumor, estádio clínico, metástase linfonodal e modalidade de tratamento mostraram estar associados à Sobrevida Global. Concluímos que a hipermetilação do gene CDKN2a não se mostrou um bom biomarcador de prognóstico no grupo analisado neste estudo, mas parece desempenhar papel importante na carcinogênese do CEO.

O objetivo do estudo foi avaliar, in vitro, a influência da fotobiomodulação (PBM) na, viabilidade e migração, relacionados à acetilação das histonas, e na diferenciação de células-tronco da polpa de dentes permanentes humanos (hDPSCs); e, in vivo, sua influência no reparo radicular de molares de ratos com necrose pulpar e rizogênese incompleta. hDPSCs foram caracterizadas e utilizadas nos experimentos de três artigos científicos. A PBM foi empregada utilizando-se laser diodo InGaAlP (100mW, 660nm, 3J/cm2, energia total por aplicação 1J em 10s). Em todos os experimentos in vitro os grupos foram divididos de acordo com o uso da PBM e os intervalos de irradiação foram de 6 horas. A viabilidade destas células foi avaliada pelo ensaio de MTT e a migração pelo scratch. A acetilação das histonas das hDPSCs foi avaliada por imunofluorescência. Para avaliar o potencial de diferenciação e a deposição de tecido mineralizado, foram utilizados os meios adipogênico, condrogênico e osteogênico, complementado pelo ensaio de atividade ALP, em modelo 3D, em gel de agarose 0,3%. Nos ensaios de diferenciação também foi avaliada a condição nutricional (regular: 10% SFB; ou déficit: 5%SFB). Os resultados do MTT, scratch e da acetilação das histonas foram obtidos em até 24 horas e nos ensaios de diferenciação foram analisados em 7 e 14 dias. Para o experimento in vivo, molares inferiores de ratos Wistar foram expostos ao meio bucal por 3 semanas e, após, tratados com pasta antibiótica por uma semana. A seguir, os canais foram irrigados e divididos em 6 grupos (n=6): MTA; coágulo sanguíneo (CS); hDPSC; MTA+PBM; CS+PBM; hDPSC+PBM. Dois grupos não foram expostos ao meio bucal: Dente hígido+PBM (n=6), Dente hígido (controle positivo, n=3); e um grupo foi mantido exposto durante todo o período experimental: Dente necrótico (controle negativo, n=3). Durante 30 dias as irradiações foram feitas com intervalos de 24 horas. Após, os ratos foram eutanasiados e realizou-se avaliação histológica e imunohistoquímica. Os dados obtidos foram tabulados e analisados estatisticamente. A PBM aumentou a viabilidade das células (P<0.001). No ensaio de scratch o grupo PBM acelerou o fechamento do ferida até 12 horas (P<0.001) e esta fechou em 18 horas, sendo mais rápido que o controle (P<0.05). A PBM aumentou a acetilação das histonas (P<0.001); Após 14 dias, a PBM intensificou a diferenciação nos três meios empregados e na atividade ALP, comparado com os controles (P<0.05). No estudo in vivo, o controle negativo apresentou infiltrado de neutrófilos maior do que os demais grupos (P<0.05). Os grupos Controle negativo, Dente hígido e Dente hígido+PBM apresentaram menos condensação fibrosa (P<0.05). Todos os grupos formaram mais tecido mineralizado que o controle negativo (P<0.05). PBM+MTA, +CS ou +hDPSC formaram mais tecido mineralizado que os grupos não irradiados (P<0.05). MTA+PBM induziu apicificação (P<0.05). A marcação para BSP confirmou os achados histológicos relacionados a formação de tecido mineralizado e as hDPSCs, com e sem PBM, exibiram maior porcentagem de células positivas para BSP. Conclui-se que a PBM desempenhou papel importante, in vitro, aumentando a diferenciação, viabilidade e migração celular que estão relacionados a acetilação das histonas. Além disso, a PBM pode ser uma alternativa de tratamento adjuvante para dentes permanentes com necrose pulpar e rizogênese incompleta favorecendo o reparo radicular. / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the influence of photobiomodulation (PBM) on viability and migration, related to histone acetylation, and differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs); and, in vivo, its influence on the root repair of rat molars with pulp necrosis and open apex. The hDPSCs were characterized and used in the experiments of three scientific papers. The PBM was applied using InGaAlP diode laser (100mW, 660nm, 3J / cm2, total energy per application 1J in 10s). In all in vitro experiments, the groups were divided according to the use of PBM, with 6-hour irradiation intervals. The viability of these cells was assessed by MTT assay and migration by scratch. The histone acetylationof hDPSCs was evaluated by immunofluorescence. To evaluate the potential for differentiation and deposition of mineralized tissue, adipogenic, chondrogenic and osteogenic mediums were used, complemented by the ALP activity assay in 3D model, in 0.3% agarose gel. In differentiation assays, the nutritional status was also evaluated (regular: 10% FBS; or deficit: 5% FBS). The MTT, scratch and histone acetylation results were obtained until 24 hours, and the differentiation assays were analyzed at 7 and 14 days. For the in vivo experiment, lower molars of Wistar rats were exposed to oral environment for 3 weeks and then treated with antibiotic paste for one week. Next the root canals were irrigated and divided into 6 groups (n=6): MTA; BC (blood clot); hDPSC; healthy tooth+PBM; MTA+PBM; BC+PBM; hDPSC+PBM. In hDSPC groups, 1% agarose gel scaffold was used for cell support. Two groups were not exposed to the oral environment: healthy tooth+PBM (n=6), healthy tooth (positive control, n=3); and one stayed exposed during the role experimental period: necrotic tooth (negative control, n=3). For 30 days the irradiations were done at 24-hour intervals. Thereafter, the rats were euthanized and histological and immunohistochemical evaluations were performed. Data were tabulated and statistically analyzed. PBM increased cell viability (P<0.001). In the scratch assay, the PBM group accelerated wound closure up to 12 hours (P<0.001) and closed at 18 hours, being faster than the control (P<0.05). PBM increased histone acetylation (P<0.001). After 14 days, PBM improved the differentiation in the three mediums employed and the ALP activity, compared to the controls (P<0.05). In the in vivo study, the negative control had greater neutrophil infiltrate than the other groups (P<0.05). Negative Control, Healthy tooth and Healthy tooth+PBM groups presented less fibrous condensation (P<0.05). All groups formed more mineralized tissue than the negative control (P<0.05). PBM+MTA, +BC or +hDPSC formed more mineralized tissue than non-irradiated groups (P<0.05). MTA+PBM induced inoculation (P<0.05). BSP labeling confirmed the histological findings related to mineralized tissue formation and hDPSCs, with and without PBM, exhibited a higher percentage of BSP-positive cells. It is concluded that PBM played an important role, in vitro, increasing differentiation, viability and cell migration that are related to histone acetylation. Moreover, the PBM may be an adjutant treatment alternative for permanent teeth with pulp necrosis and open apex, favoring root repair.