Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-21T11:43:47Z No. of bitstreams: 1 alexandresilvachaves.pdf: 1552343 bytes, checksum: e93b7672976058e0adc057d62686adba (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-06-21T12:22:29Z (GMT) / Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-21T12:24:25Z No. of bitstreams: 1 alexandresilvachaves.pdf: 1552343 bytes, checksum: e93b7672976058e0adc057d62686adba (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:04:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alexandresilvachaves.pdf: 1552343 bytes, checksum: e93b7672976058e0adc057d62686adba (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:04:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alexandresilvachaves.pdf: 1552343 bytes, checksum: e93b7672976058e0adc057d62686adba (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / A tuberculose é uma doença infecciosa cujo principal agente etiológico é o Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Macrófagos constituem a primeira linha de defesa contra a tuberculose, bem como o habitat preferencial para o Mtb. Antígenos específicos do Mtb tais como ESAT-6, CFP-10 e Rv1733 podem modular a produção de citocinas, influenciando o curso da infecção. Macrófagos infectados liberam uma grande quantidade de citocinas incluindo fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a). As ações do TNF-a são iniciadas por seus dois receptores de membrana, mTNF-R1 e mTNF-R2, os quais podem sofrer clivagem proteolítica, resultando nas formas solúveis sTNF-R1 e sTNF-R2, respectivamente. No presente estudo, macrófagos RAW264.7 (2x105/mL) foram estimulados com a proteína de fusão ESAT6:CFP10 ou com o antígeno recombinante DosR, Rv1733, na concentração de 5pg/mL por 24 e 48 horas e a produção de TNF-a, bem como a expressão dos mTNF-Rs e concentração dos sTNF-Rs foram investigadas. Os sobrenadantes de cultura foram coletados e os níveis de TNF-a, IL-10, sTNF-R1 e sTNF-R2 foram avaliados por ELISA, enquanto que os níveis de óxido nítrico (NO) foram analisados pela reação de Griess. A determinação da viabilidade celular foi realizada pelo ensaio de MTT. Níveis de mTNF-R1 e mTNF-R2 foram analisados por citometria de fluxo e a expressão de iNOS e Arg-1 determinada por imunocitoquímica. Os resultados mostraram que ambos os antígenos induziram um aumento na expressão de TNF-a (p<0,05) sem afetar os níveis de NO, IL-10, iNOS e Arg-1. A expressão elevada de mTNF-R1 (p<0,05) em células RAW264.7 foi observada para ambos os antígenos após 24 horas de cultura, mas apenas o Rv1733 foi capaz de diminuir os níveis de sTNF-R1 (p<0,05) nos sobrenadantes de cultura. A expressão de mTNF-R2 e a detecção de sTNF-R2 (p<0,05) foi maior após estimulação com Rv1733, em 24 e 48 horas de cultura. Esses resultados sugerem que a proteína de fusão ESAT6:CFP10 e o antígeno DosR, Rv1733, modulam diferentemente a produção de TNF-a e a expressão de seus receptores em macrófagos, o que influenciar na suscetibilidade à infecção. / Tuberculosis is a severe infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Macrophages provide a first line of defense against tuberculosis and major habitat for Mtb. Specific Mtb antigens, such as ESAT-6, CFP-10 and Rv1733, may modulate the production of cytokines, influencing the course of infection. Infected macrophages release a range of cytokines including tumor necrosis factor-alpha (TNF-a). TNF-a actions are triggered by its two membrane receptors, mTNF-R1 and mTNF-R2, which may undergo a shedding process, resulting in the soluble form sTNF-R1 and sTNF-R2, respectively. In the present study, RAW264.7 macrophages (2 x 105/mL) were stimulated with the fusion protein ESAT6:CFP10 or the recombinant DosR antigen Rv1733 at 5[1,g/mL for 24 and 48 hours and the production of TNF-a and expression membrane and soluble TNFRs were investigated. Culture supernatants were collected and levels of TNF-a, IL-10, sTNF-R1 and sTNF-R2 evaluated by ELISA, while levels of nitric oxide (NO) were assessed by the Griess reaction. To determine cell viability the MTT assay was used. Levels of mTNF-R1 and mTNF-R2 were analysed by flow cytometry and the expression of iNOS and Arg-1 were determined by immunocytochemistry. The results show that both antigens induced an increase in TNF-a production (p<0.05) without affecting levels of NO, IL-10, iNOS and Arg-1. Elevated expression of mTNFR1 (p<0,05) in RAW264.7 cells was observed for both antigens after 24h of culture, but only Rv1733 decreased sTNF-R1(p<0,05) in culture supernatants. Expression of mTNF-R2 and detection of sTNF-R2 (p <0.05) was enhanced by Rv1733 after 24h and 48h of culture. These results suggest that the fusion protein ESAT6:CFP10 and the DosR antigen Rv1733 differentially modulate the production of TNF-a and the expression of its receptors on macrophages, which may affect the susceptibility to infection.

Face à une recrudescence préoccupante depuis 2004 des cas de tuberculose bovine (Tb) en Dordogne et du fait des défauts diagnostiques des méthodes de détection classiques comme l'intradermotuberculination simple (IDS), la bactériologie ou l'inspection systématique des carcasses à l'abattoir, deux nouveaux outils de diagnostic rapide, (i) le test de dosage d'interféron gamma (IFNγ) Bovigam® modifié, basé sur des dérivés protéiques purifiés bovins et aviaires (PPD) et des antigènes recombinants spécifiques, ESAT6 et CFP10 (R) et, (ii) une méthode PCR en temps réel basée sur la détection de la séquence d'insertion IS6110 (PCR), ont été intégrés dans le dispositif de lutte afin d'évaluer leurs utilités diagnostiques. Les différentes études réalisées ont montré que la méthode PCR est au moins aussi sensible que la bactériologie. Sa spécificité opérationnelle est très satisfaisante et sa valeur prédictive positive est excellente vis-à-vis de la bactériologie et l'histologie. Elle constitue donc un outil rapide et fiable de diagnostic de la Tb permettant, en complément d'une tuberculination ou une histologie positive, d'éviter d'attendre le résultat bactériologique pour déclarer l'infection. Elle permet ainsi de raccourcir considérablement les délais de confirmation définitive de l'infection (de 2,5 mois), ce qui constitue un avantage opérationnel crucial. L'application du test IFNγ modifié comme outil de confirmation des IDS non-négatives n'est pas parfait mais sa complémentarité vis-à-vis de l'IDS en fait un atout indéniable. D'un point de vue technique, un mode de calcul normalisé des résultats individuels doit être utilisé pour obtenir une meilleure reproductibilité et donc pouvoir établir des comparaisons intra et inter laboratoires. De plus, il est nécessaire d'adapter les critères d'analyse (seuils décisionnels des formules normalisées et méthodes d'interprétation du résultat final) au statut infectieux régional d'une part, (région de faible ou forte prévalence de Tb, réactions non-spécifiques rares ou fréquentes) et, aux conditions d'application du test d'autre part (dans la population générale ou dans une population d'IDS non-négatives), pour une utilisation appropriée du test IFNγ. Ces résultats satisfaisants ont conduit en août 2009 à la reconnaissance règlementaire des tests PCR IS6110 et IFNγ modifié comme outils de confirmation de l'infection de Tb et des IDS non-négatives respectivement.