Neste trabalho, a decomposição por via úmida em sistema fechado assistida por radiação micro-ondas (MW-AD) e a decomposição por via úmida em sistema fechado assistida por radiação micro-ondas e ultravioleta (MW-UV) foram avaliadas para amostras comerciais de biodiesel para posterior determinação de Ba, Co, Cr, Cu, Mn, Mo, Ni, Pb, Sr, V e Zn por espectrometria de massa com setor eletromagnético com plasma indutivamente acoplado (SF-ICP-MS). A MW-AD empregando ácido diluído foi primeiramente avaliada sendo possível a decomposição de até 700 mg de biodiesel com HNO3 7 mol L-1 e 2 mL de H2O2 30% (m/m). As soluções finais apresentaram teor de carbono residual (RCC) de 8,7% e acidez residual (RA) de 4%. Posteriormente, com o objetivo de obter maior eficiência de decomposição, o método MW-UV foi avaliado para a decomposição de biodiesel. Com o emprego deste método até 950 mg de amostra foram decompostas com HNO3 7 mol L-1 e soluções finais com RCC de 17,4% e RA de 19,3% foram obtidas. As soluções finais, para ambos os métodos, foram adequadas para a determinação de elementos traço por SF-ICP-MS. Possíveis interferências na etapa de determinação dos analitos, causadas pela presença de carbono residual, foram estudadas através do emprego de padrão interno 115In e de ensaios de recuperação de analito para monitorar a formação de espécies poliatômicas no plasma. Os resultados obtidos mostraram a necessidade da utilização de padrão interno, sendo o instrumento operado no modo de baixa resolução para a determinação da maioria dos analitos, com exceção de 52Cr, para o qual o instrumento foi operado no modo de média resolução. A exatidão dos métodos propostos foi avaliada mediante a análise de material de referência certificado, obtendo-se resultados concordantes, com nível de confiança de 95% (teste t-student), com os valores certificados para a maioria dos elementos. Ensaios de adição de analito também foram feitos para a avaliação da exatidão e recuperações de 92 à 109% foram obtidas. Os limites de detecção (LD) obtidos para o método MW-UV foram inferiores aos obtidos para MW-AD, na faixa de 0,08 a 6,9 ng g-1 e 1,0 a 14 ng g-1, respectivamente. / In this work, the microwave-assisted digestion (MW-AD) and microwave-assisted ultraviolet digestion (MW-UV) were evaluated for commercial biodiesel samples for subsequent determination of Ba, Co, Cr, Cu, Mn, Mo, Ni, Pb, Sr, V and Zn by sector field inductively coupled plasma mass spectrometry (SF-ICP-MS). Using the MW-AD method with diluted acid up to 700 mg of biodiesel were digested with 7 mol L-1 HNO3 and 2 mL of 30% (w/w) H2O2. Final solutions presented residual carbon content (RCC) of 8.7% and residual acidity (RA) of 4%. In order to improve the digestion efficiency, the MW-UV method was evaluated for biodiesel digestion. Using MW-UV method up to 950 mg of sample were digested with 7 mol L-1 HNO3 and the final solutions with RCC of 17.4% and RA of 19.3% were obtained. The final solutions obtained for both methods were suitable for the determination of trace elements by SF-ICP-MS. Interferences in the determination step were studied using 115In as internal standard and analyte recovery to monitor the formation of polyatomic species in the plasma. The low resolution mode was used for the determination of almost of the analytes with the exception of 52Cr that was determine using medium resolution mode. Accuracy of the investigated methods were evaluated by analysis of certified reference material and the values obtained were in agreement with 95% confidence level (t-student test) with the certified values for all elements. Analyte recovery was also performed to evaluate the accuracy and recoveries of 92 to 109% were obtained. The limits of detection (LOD) obtained by the MW-UV method were lower than MW-AD method and are in the range of 0.08 to 6.9 ng g -1 and 1.0 to 14 ng g -1, respectively.

A modulação da resposta inflamatória uterina equina recebe atenção, devido a um distúrbio imunológico, que parece ocorrer em uma população de éguas, classificadas como suscetíveis à endometrite. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da corticoterapia aplicada na presença e na ausência de inflamação uterina sobre a proteômica e a concentração de óxido nítrico no líquido endometrial de éguas suscetíveis à endometrite. Éguas foram sincronizadas com 5 mg de prostaglandina F2α e após a verificação dos sinais de estro foram submetidas a quatro tratamentos. O primeiro foi o Controle, que não recebeu nenhum tipo de tratamento. O segundo foi o GC, onde as éguas receberam aplicação de um glicocorticóide, a cada 12 horas, por três dias consecutivos. O terceiro foi o Infectado, onde as éguas receberam uma infusão intrauterina de Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) e o quarto foi o GC + Infectado, onde as éguas receberam a aplicação do glicocorticóide e a infusão intrauterina descrita acima. Doze horas após o final de cada tratamento, amostras de líquido endometrial puro e de lavados uterinos foram coletadas para análise proteômica e determinação de óxido nítrico, respectivamente. O primeiro artigo relata os dados preliminares da análise proteômica, com a contagem das bandas protéicas e a observação de 33 bandas protéicas no Controle, 54 no GC, 51 no Infectado e 72 no GC + Infectado. A corticoterapia pode induzir o aparecimento de um número maior de bandas protéicas, pois os géis com as maiores contagens foram nos tratamentos onde ela foi aplicada. No segundo artigo, foi realizada a identificação das bandas protéicas significativas, em relação à densidade óptica relativa e à frequência. A corticoterapia provocou uma alteração na proteômica do líquido endometrial, caracterizada pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação, com as maiores alterações observadas quando a corticoterapia foi aplicada na presença do processo infeccioso. A infusão de Streptococcus zooepidemicus provocou alterações na proteômica do líquido endometrial, caracterizadas pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação. Os resultados do estudo indicam que a corticoterapia provoca alterações imunológicas no endométrio equino, não apenas como depressiva, mas estimuladora da defesa local, através de uma ação imunomoduladora. No terceiro artigo, foi realizada a determinação da concentração de óxido nítrico, não sendo observada diferença significativa nos quatro tratamentos. Portanto, a corticoterapia provoca alterações proteômicas no líquido endometrial de éguas suscetíveis em estro, onde a presença de um estímulo inflamatório causado pela infusão intrauterina bacteriana induz a uma maior alteração, do que a ausência. A infecção do lúmen uterino provoca alterações proteômicas no líquido endometrial e a corticoterapia não influencia a concentração de óxido nítrico de éguas em estro. / The modulation of the equine uterine inflammatory response recieves much attention, due to an immunological disorder, which appears to happen in a population of mares, classified as suscetipble to endometritis. The aim of this study was to verify the effect of corticotherapy applied in the presence and in the absence of uterine inflammation on the proteomics and nitric oxide concentration of the endometrial fluid of mares susceptible to endometritis. Mares were synchronized with 5 mg prostaglandin F2α and after the observation of the signs of estrus were submitted to four treatments. The first was the Control, which did not recieve any kind of treatment. The second was the GC, where mares recieved the administration of a glucocorticoid, each 12 hours, for three consecutive days. The third was the Infected, where mares received an intrauterine infusion of Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) and the fourth was the GC + Infected, where mares received the administration of glucocorticoid and intrauterine infusion as described above. Twelve hours after the end of each treatment, pure endometrial fluid and uterine flushings were collected for proteomic analysis and nitric oxide determination, respectively. The first article reports the preliminary data of the proteomic analysis, where protein band counts were done, being observed 33 protein bands in Control, 54 in GC, 51 in Infected and 72 in GC + Infected. Corticotherapy can induce the appearance of a higher number of protein bands, because the gels with the highest counts were in the treatments where it was applied. In the second article, the identification of the significative protein bands was done, regarding the relative optic density and frequency. Corticotherapy provoked an alteration in the endometrial proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins, with the major alterations observed when corticotherapy was applied in the presence of an infectious process. Streptococcus zooepidemicus infusion provoked alterations in the endometrial fluid proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins. Results from this study indicate that corticotherapy provokes immunological alterations in the equine endometrium, not only as depressor, but enhancer of local defense, through an immunomodulatory action. In the third article, the nitric oxide concentration was determined, with no significative diference observed in the four treatments. So, corticotherapy provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid of susceptible mares in estrus, where the presence of an inflammatory stimulus caused by intrauterine bacterial infusion induces a major alteration, than the absence. Uterine lumen infection provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid and corticotherapy does not influence nitric oxide concentration in mares in estrus.

O fumarato de fesoterodina (FESO) é um potente fármaco antimuscarínico recentemente desenvolvido para o tratamento da síndrome da bexiga hiperativa, também conhecida como incontinência urinária. A análise de fármacos é necessária em todas as fases do desenvolvimento farmacêutico, como estabilidade e controle de qualidade dos produtos comercializados. Nenhum relato de determinação quantitativa e de estudos de estabilidade do fármaco em comprimidos foi encontrado na literatura. No presente trabalho, a caracterização da substância química de referência de FESO foi realizada por espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear de hidrogênio. Métodos analíticos por espectrofotometria derivada, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), eletroforese capilar e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial foram desenvolvidos para determinação qualitativa e quantitativa de FESO em comprimidos de liberação prolongada. Os procedimentos foram validados, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de detecção e quantificação, cujos resultados cumpriram os requisitos preconizados. Os resultados obtidos através destes métodos foram comparados estatisticamente por ANOVA, que indicou não haver diferenças estatisticamente significativas entre os mesmos. A cinética de fotodegradação da FESO também foi avaliada utilizando o método por CLAE, na qual foi obtido um modelo de ordem zero. Um método por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas foi aplicado para análise de FESO e de seus produtos de degradação, possibilitando identificar os íons moleculares destes e propor a rota de fragmentação do fármaco. Além disso, desenvolveu-se e validou-se um método de dissolução de FESO em comprimidos. Através deste método, foi observado que a formulação possui uma cinética de dissolução de acordo com o modelo de Higuchi. Desse modo, estabeleceram-se procedimentos que podem ser aplicados para aprimorar o controle da qualidade dos medicamentos comercializados, bem como contribuir para garantir a segurança e eficácia no uso terapêutico. / Fesoterodine fumarate (FESO) is a potent antimuscarinic drug recently developed for the treatment of overactive bladder, a lower urinary tract disorder characterized by urinary urgency. The drug analysis is necessary in all steps of the pharmaceutical development, as stability and quality control tests of marketed products. The absence of the reports in the literature of quantitative determination and stability studies of the drug in pharmaceutical formulation were observed. In the present study, the characterization of the FESO reference substance was performed by mass spectrometry and proton nuclear magnetic resonance techniques. Analytical methods by derivative spectrophotometry, liquid chromatography (LC), capillary electrophoresis and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry were developed for qualitative and quantitative determination of FESO in extended-release tablets. The procedures were validated, evaluating the parameters of specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, and limit of detection and quantitation, whose results have met the requirements recommended. The results obtained through these analytical methods were compared by ANOVA, which showed no significant statistically difference between them. The photodegradation kinetic of FESO was also evaluated using the validated LC method, following the zero-order kinetics. A liquid chromatography coupled to mass spectrometry method was applied for analysis of FESO and its degradation products, enabling to identify the respective molecular ions and propose the drug photodegradation pathway. Besides, a dissolution method for FESO extended-release tablets was developed and validated. It method allowed to observe that the kinetics of drug release of the presented pharmaceutical formulation was better described by the Higuchi model. Then, the established procedures can be applied to improve the quality control of the commercialized pharmaceutical formulations, as well as to contribute for assure the safety and therapeutic efficacy of the drug.

O Brasil ocupa posição de destaque no consumo mundial de anfetaminas, contrariamente à tendência mundial de retração. Devido aos efeitos colaterais e ao alto potencial de abuso, a produção e comercialização de anfetaminas vêm sendo controladas no mundo inteiro. Com a restrição de uso, houve um retorno a procura pelos equivalentes naturais, especialmente as efedrinas presentes em diversas especialidades farmacêuticas, utilizadas no tratamento de doenças respiratórias. São componentes de vários compostos emagrecedores, suplementos alimentares e dietéticos utilizados para perda de peso e ganho de massa muscular. Face ao uso indiscriminado e a grande incidência de resultados falso-positivos nos testes de triagem para anfetaminas por imunoensaio enzimático homogêneo, fazem-se necessários testes confirmatórios. Neste sentido, este trabalho se propôs a desenvolver um método confirmatório simples e rápido para detecção, identificação e quantificação de efedrinas (efedrina/pseudoefedrina) em amostras de urina por por cromatografia a gás / espectrometria de massas-massas (CG/EM/EM), passível de ser adotado na rotina de laboratórios de análises toxicológicas. Devido à complexidade da matriz e as peculiaridades do analito, inicialmente procedeu-se o estudo do tratamento da amostra, considerando as etapas de derivatização, extração, pré-concentração e purificação, de modo a fornecer um extrato límpido, livre de impurezas, interferentes e com melhor sensibilidade, linearidade e seletividade analítica. Os métodos de extração usados foram extração líquido-líquido (ELL), extração em fase sólida (SPE) e microextração em fase sólida (SPME). Os resultados indicaram que o reagente de derivatização ciclohexanona foi o que apresentou melhor desempenho, menor custo e promoveu maior seletividade dos diasterômeros EF/PEF em colunas normais de CG. Sendo que o método mais apropriado para a detecção e identificação de efedrinas/anfetamina por CG/EM é a SPME levando em consideração características como simplicidade, rapidez, custo, recuperação e ausência de interferentes. Entretanto, considera-se valido o uso de SPE para a quantificação, devido à possibilidade de pré-concentração do analito. / Brazil is one of the biggest amphetamine consumers in the world, going against the worldwide retraction tendency. Due to serious adverse effects and high abuse potential, the production and commercialization of amphetamines has been controlled around the world. With the restriction of its use, there was a return in the search of natural equivalents, especially the ephedrines found in many medicines utilized in the treatment of respiratory diseases. Furthermore, they are components of dietary supplements used to lose weight and muscular mass gain. Because of the indiscriminate use and the high incidence of false-positive results in the amphetamines screening tests by enzyme immunoassay technique, it is necessary confirmatory tests. In this way, the aim of this work is to develop a confirmatory simple and quickly method for the detection and quantification of ephedrines (ephedrine and pseudoephedrine) gas chromatography / mass-mass spectrometry (GC/MS/MS), with possibility to be adopted in toxicological analyses laboratorial routine. Due to the complexity of the matrix and analyte peculiarities, initially proceeds the study of sample treatment, considering the derivatization, extraction, pre-concentration and purification steps, obtaining a limpidous extract, free of impurities, interferents and with better sensitivity, linearity and analytical selectivity. The extraction method used were liquid-liquid extraction (LLE), solid-phase extraction (SPE) and solid-phase microextraction (SPME). The results indicate that cyclohexanone was the derivatization agent with the best performance, lower price and good selectivity in diasteromers EF/PEF separation in normal GC columns. The most appropriate method for detection and identification of ephedrines/amphetamine by GC/MS is SPME, considering characteristics as simplicity, speed, cost, recovery and absence of interferents. However, the use of SPE must be considered to quantification, since it allowed analyte pre-concentration.

SIMÕES, Rafael da Conceição. Caracterização de lectinas de leguminosas por espectrometria de massa. 2011. 91 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-29T13:14:44Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_rcsimoes.pdf: 16302885 bytes, checksum: aaccf965c78f4557403cda206b305a40 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:14:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_rcsimoes.pdf: 16302885 bytes, checksum: aaccf965c78f4557403cda206b305a40 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:14:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_rcsimoes.pdf: 16302885 bytes, checksum: aaccf965c78f4557403cda206b305a40 (MD5) Previous issue date: 2011 / Mass spectrometry is a technique widely used in all prod uctive sectors. Since the late '80s with the emergence of soft ionization techniques, mass spectrometry has been widely disseminated in the analysis of biopolymers such as fatty acids, nucleic acids, oligosaccharides and especially proteins. Lectins are proteins of nonimmune origin that have at least one specific and reversible binding carbohydrate domain, without the ability to modify them. These proteins are widely distributed in nature. Lectins isolated from seeds of legumes are among the most studied and have high homology degree, being an important molecular marker of evolution in this clade. This study aimed to characterize some legume lectins by m ass spectrometry. Lectin EVA and LAA with 240 and 237 amino acid residues respectively, were analyzed for native mass and sequence of amino acids determined, showing a high degree of homology with other legume lectins. Lectin ConGF, a ConA-like, was analyzed for protein content in the crystal. Was determined that bot h mature chain and proteolytic fragments are present to form crystal, which indicates no difference between the chains structure covalently linked together by weak interactions. The partial sequence shows that ConGF has several structural features within the subtribe Diocleinae. All results demonstrate that mass spectrometry is a versatile and robust tool for characterizing proteins and can be successfully used to obtain structural information of lectins. / A espectrometria de massa é uma técnica amplamente utilizada em todos os setores produtivos. Desde o final dos anos 80 com o surgimento de técnicas de ionização brandas, a espectrometria de massa vem sendo amplamente difundida na análise de biopolímeros como ácidos graxos, ácidos nucléicos, oligossacarídeos e principalmente proteínas. Lectinas são proteínas de origem não imune que possuem pelo menos um domínio de ligação específica e reversível a carboidratos, sem a capacidade de modificá-los. Estas proteínas são amplamente distribuídas na natureza. As lectinas isoladas de sementes de leguminosas estão entre as mais estudadas e possuem alta homologia, sendo importantes marcadores moleculares da evolução dentro desta família vegetal. Este trabalho teve como objetivo caracterizar lectinas da família Leguminosae através de espectrometria de massa. As lectinas de Erythrina velutina (EVA) e Luetzelburgia auriculata (LAA) com 240 e 237 resíduos de aminoácidos respectivamente foram analisadas quanto a massa molecular nativa e foi determinada a sequencia de aminoácidos. As estruturas primárias mostraram alto grau de homologia com outras lectinas de leguminosas. A lectina ConGF, uma ConA-Like, foi analisada quanto ao conteúdo protéico do cristal. O cristal está composto da cadeia madura alfa e seus os fragmentos proteolíticos, o que indica não haver diferença entre a estrutura ligada covalentemente e as cadeias unidas por interações fracas. A sequência parcial demonstra que ConGF possui características estruturais da subtribo Diocleinae. Todos os resultados demonstram que a técnica de espectrometria de massa é uma ferramenta versátil e robusta para caracterização de proteínas e pode ser usada com sucesso para obtenção de informações estruturais de lectinas.

A espectrometria de massas, acoplada ou não a outras técnicas, tem sido de grande utilidade na determinação de novos compostos, produtos de transformação/degradação, metabólitos e na quantificação em nível de traços nas mais diferentes matrizes, devido à grande versatilidade dessa técnica, especialmente em relação aos modos de análise. Neste trabalho foi sistematizada uma metodologia para a aplicação das técnicas de espectrometria de massas na identificação de produtos de transformação/degradação de fármacos de uso humano e veterinário. Ferramentas da química computacional foram utilizadas para auxiliar na elucidação das estruturas dos compostos formados. A metodologia foi empregada para a identificação e quantificação dos produtos de transformação/degradação da rosuvastatina, gerados durante o processo de fotocatálise heterogênea com ZnO, para a identificação dos produtos de transformação/degradação gerados durante a fotólise em meio aquoso do sulfamentoxazol, ciprofloxacino e norfloxacino, e para a quantificação da amoxicilina transferida ao leite bovino. A viabilidade de se realizar a identificação de metabólitos da amoxicilina presentes no leite bovino por meio do mesmo processo de preparo de amostra e de análise utilizado para a quantificação também foi avaliada. Foram identificados dez principais produtos de transformação/degradação da fotocatálise da rosuvstatina, dez principais produtos de transformação/degradação da fotólise em meio aquoso do sulfametoxazol, quinze principais produtos de transformação/degradação da fotólise em meio aquoso do ciprofloxacino e quinze principais produtos de transformação/degradação da fotólise em meio aquoso do norfloxacino. A metodologia empregada para a quantificação da amoxicilina em leite bovino se demostrou adequada, mas estudos adicionais são necessários para que seja possível identificar os seus metabólitos nessa matriz. Os resultados dos cálculos ab initio que foram utilizados para o estudo dos produtos de transformação/degradação da rosuvastatina e sulfametoxazol mostram que essa técnica pode ser bastante útil na elucidação estrutural dos compostos que são formados. / Mass spectrometry, coupled or not with other techniques, is very useful for the determination of new compounds, transformation/degradation products, metabolites and quantification at trace levels in many different matrices, due to the versatility of such a technique, specially regarding to analysis modes. In the present work a methodology was systematized for the application of mass spectrometry techniques in order to identify metabolites and transformation/degradation products for human and veterinary drugs usage. Computational chemistry tools were used to assist in the elucidation of the structure of the compounds formed during the process. The methodology was employed for identification and quantification of rosuvastatin transformation/degradation products generated during the heterogeneous photocatalysis process with ZnO, for the identification of sulfamethoxazole, ciprofloxacin and norfloxacion transformation/degradation products generated during the photolysis in aqueous medium and for quantifying amoxicillin transferred to bovine milk. The feasibility of identification of amoxicillin metabolites present in bovine milk using the same sample preparation procedure exploited for the quantification analysis was also assessed. Ten main transformation/degradation products of rosuvastatin photocatalysis were identified, as well as ten main transformation/degradation products of sulfamethoxaxole photolysis in aqueous medium, fifteen main transformation/degradation products of ciprofloxacin photolysis in aqueous medium and fifteen main transformation/degradation products of norfloxacin photolysis in aqueous medium. The methodology applied for the bovine milk amoxicillin quantification was demonstrated to be adequate, but additional studies are needed to identify amoxicillin metabolites in the milk matrix. The results of ab initio calculations utilised for the study of rosuvastatin and sulfamethoxazole transformation/degradation products show that this technique can be very useful for the structural elucidation of chemical compounds which are formed.

O Brasil ocupa posição de destaque no consumo mundial de anfetaminas, contrariamente à tendência mundial de retração. Devido aos efeitos colaterais e ao alto potencial de abuso, a produção e comercialização de anfetaminas vêm sendo controladas no mundo inteiro. Com a restrição de uso, houve um retorno a procura pelos equivalentes naturais, especialmente as efedrinas presentes em diversas especialidades farmacêuticas, utilizadas no tratamento de doenças respiratórias. São componentes de vários compostos emagrecedores, suplementos alimentares e dietéticos utilizados para perda de peso e ganho de massa muscular. Face ao uso indiscriminado e a grande incidência de resultados falso-positivos nos testes de triagem para anfetaminas por imunoensaio enzimático homogêneo, fazem-se necessários testes confirmatórios. Neste sentido, este trabalho se propôs a desenvolver um método confirmatório simples e rápido para detecção, identificação e quantificação de efedrinas (efedrina/pseudoefedrina) em amostras de urina por por cromatografia a gás / espectrometria de massas-massas (CG/EM/EM), passível de ser adotado na rotina de laboratórios de análises toxicológicas. Devido à complexidade da matriz e as peculiaridades do analito, inicialmente procedeu-se o estudo do tratamento da amostra, considerando as etapas de derivatização, extração, pré-concentração e purificação, de modo a fornecer um extrato límpido, livre de impurezas, interferentes e com melhor sensibilidade, linearidade e seletividade analítica. Os métodos de extração usados foram extração líquido-líquido (ELL), extração em fase sólida (SPE) e microextração em fase sólida (SPME). Os resultados indicaram que o reagente de derivatização ciclohexanona foi o que apresentou melhor desempenho, menor custo e promoveu maior seletividade dos diasterômeros EF/PEF em colunas normais de CG. Sendo que o método mais apropriado para a detecção e identificação de efedrinas/anfetamina por CG/EM é a SPME levando em consideração características como simplicidade, rapidez, custo, recuperação e ausência de interferentes. Entretanto, considera-se valido o uso de SPE para a quantificação, devido à possibilidade de pré-concentração do analito. / Brazil is one of the biggest amphetamine consumers in the world, going against the worldwide retraction tendency. Due to serious adverse effects and high abuse potential, the production and commercialization of amphetamines has been controlled around the world. With the restriction of its use, there was a return in the search of natural equivalents, especially the ephedrines found in many medicines utilized in the treatment of respiratory diseases. Furthermore, they are components of dietary supplements used to lose weight and muscular mass gain. Because of the indiscriminate use and the high incidence of false-positive results in the amphetamines screening tests by enzyme immunoassay technique, it is necessary confirmatory tests. In this way, the aim of this work is to develop a confirmatory simple and quickly method for the detection and quantification of ephedrines (ephedrine and pseudoephedrine) gas chromatography / mass-mass spectrometry (GC/MS/MS), with possibility to be adopted in toxicological analyses laboratorial routine. Due to the complexity of the matrix and analyte peculiarities, initially proceeds the study of sample treatment, considering the derivatization, extraction, pre-concentration and purification steps, obtaining a limpidous extract, free of impurities, interferents and with better sensitivity, linearity and analytical selectivity. The extraction method used were liquid-liquid extraction (LLE), solid-phase extraction (SPE) and solid-phase microextraction (SPME). The results indicate that cyclohexanone was the derivatization agent with the best performance, lower price and good selectivity in diasteromers EF/PEF separation in normal GC columns. The most appropriate method for detection and identification of ephedrines/amphetamine by GC/MS is SPME, considering characteristics as simplicity, speed, cost, recovery and absence of interferents. However, the use of SPE must be considered to quantification, since it allowed analyte pre-concentration.

A modulação da resposta inflamatória uterina equina recebe atenção, devido a um distúrbio imunológico, que parece ocorrer em uma população de éguas, classificadas como suscetíveis à endometrite. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da corticoterapia aplicada na presença e na ausência de inflamação uterina sobre a proteômica e a concentração de óxido nítrico no líquido endometrial de éguas suscetíveis à endometrite. Éguas foram sincronizadas com 5 mg de prostaglandina F2α e após a verificação dos sinais de estro foram submetidas a quatro tratamentos. O primeiro foi o Controle, que não recebeu nenhum tipo de tratamento. O segundo foi o GC, onde as éguas receberam aplicação de um glicocorticóide, a cada 12 horas, por três dias consecutivos. O terceiro foi o Infectado, onde as éguas receberam uma infusão intrauterina de Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) e o quarto foi o GC + Infectado, onde as éguas receberam a aplicação do glicocorticóide e a infusão intrauterina descrita acima. Doze horas após o final de cada tratamento, amostras de líquido endometrial puro e de lavados uterinos foram coletadas para análise proteômica e determinação de óxido nítrico, respectivamente. O primeiro artigo relata os dados preliminares da análise proteômica, com a contagem das bandas protéicas e a observação de 33 bandas protéicas no Controle, 54 no GC, 51 no Infectado e 72 no GC + Infectado. A corticoterapia pode induzir o aparecimento de um número maior de bandas protéicas, pois os géis com as maiores contagens foram nos tratamentos onde ela foi aplicada. No segundo artigo, foi realizada a identificação das bandas protéicas significativas, em relação à densidade óptica relativa e à frequência. A corticoterapia provocou uma alteração na proteômica do líquido endometrial, caracterizada pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação, com as maiores alterações observadas quando a corticoterapia foi aplicada na presença do processo infeccioso. A infusão de Streptococcus zooepidemicus provocou alterações na proteômica do líquido endometrial, caracterizadas pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação. Os resultados do estudo indicam que a corticoterapia provoca alterações imunológicas no endométrio equino, não apenas como depressiva, mas estimuladora da defesa local, através de uma ação imunomoduladora. No terceiro artigo, foi realizada a determinação da concentração de óxido nítrico, não sendo observada diferença significativa nos quatro tratamentos. Portanto, a corticoterapia provoca alterações proteômicas no líquido endometrial de éguas suscetíveis em estro, onde a presença de um estímulo inflamatório causado pela infusão intrauterina bacteriana induz a uma maior alteração, do que a ausência. A infecção do lúmen uterino provoca alterações proteômicas no líquido endometrial e a corticoterapia não influencia a concentração de óxido nítrico de éguas em estro. / The modulation of the equine uterine inflammatory response recieves much attention, due to an immunological disorder, which appears to happen in a population of mares, classified as suscetipble to endometritis. The aim of this study was to verify the effect of corticotherapy applied in the presence and in the absence of uterine inflammation on the proteomics and nitric oxide concentration of the endometrial fluid of mares susceptible to endometritis. Mares were synchronized with 5 mg prostaglandin F2α and after the observation of the signs of estrus were submitted to four treatments. The first was the Control, which did not recieve any kind of treatment. The second was the GC, where mares recieved the administration of a glucocorticoid, each 12 hours, for three consecutive days. The third was the Infected, where mares received an intrauterine infusion of Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) and the fourth was the GC + Infected, where mares received the administration of glucocorticoid and intrauterine infusion as described above. Twelve hours after the end of each treatment, pure endometrial fluid and uterine flushings were collected for proteomic analysis and nitric oxide determination, respectively. The first article reports the preliminary data of the proteomic analysis, where protein band counts were done, being observed 33 protein bands in Control, 54 in GC, 51 in Infected and 72 in GC + Infected. Corticotherapy can induce the appearance of a higher number of protein bands, because the gels with the highest counts were in the treatments where it was applied. In the second article, the identification of the significative protein bands was done, regarding the relative optic density and frequency. Corticotherapy provoked an alteration in the endometrial proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins, with the major alterations observed when corticotherapy was applied in the presence of an infectious process. Streptococcus zooepidemicus infusion provoked alterations in the endometrial fluid proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins. Results from this study indicate that corticotherapy provokes immunological alterations in the equine endometrium, not only as depressor, but enhancer of local defense, through an immunomodulatory action. In the third article, the nitric oxide concentration was determined, with no significative diference observed in the four treatments. So, corticotherapy provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid of susceptible mares in estrus, where the presence of an inflammatory stimulus caused by intrauterine bacterial infusion induces a major alteration, than the absence. Uterine lumen infection provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid and corticotherapy does not influence nitric oxide concentration in mares in estrus.

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Deste modo, nos últimos anos a consequência da ingestão destes corantes presentes na agua potável servida à população é discutida por diversos autores. Este estudo avalia a ação de microssomas de fígado de rato, enzimas redutoras produzidas pela bactéria Escherichia coli (E. coli) e nitroredutase imobilizada na biotransformação de três corantes dispersos que possuem grupos azo, Disperse Red 73 (DR 73), Disperse Red 78 (DR 78) e Disperse Red 167 (DR 167). A técnica de Espectrofotometria de absorção molecular na região do Uv- visível, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) foram técnicas usadas para identificar os principais produtos gerados após os processos de degradação dos corantes. Polímeros de impressão molecular magnéticos (MMIPs) foram investigados usando reações de polimerização por precipitação para pré-concentração do corante DR 73, juntamente com a degradação por fotoeletrocatálise e subsequente análise dos produtos por LC-MS/MS. Os estudos in vitro do metabolismo de biotransformação dos corantes têxteis com microssoma de fígado de rato mostraram que as reações ocorreram preferencialmente no grupo azo e nitro dos corantes, indicando a redução destes grupos pelas enzimas do citocromo P-450. Foram obtidos dois produtos de degradação para cada corante após reação com a bactéria E. coli; o corante DR 73 originou os produtos 3-((4-aminofenil)(etil)amino)propanitrila e 4-nitroanilina, os produtos 3-((4-aminofenil)(etil)amino)propanitrila e 2-cloro-4-nitroanilina foram obtidos após reação com o corante DR78 e o DR 167 originou dimetil 3,3`-((3-acetamido-4aminofenil)azanediyl)dipropanoato e 2-cloro-4-nitroanilina, indicando a clivagem do grupo azo, possivelmente, pela enzima azoredutase, produzida pela bacteria. A enzima nitroredutase, imobilizada em partículas magnéticas modificadas com tosil, mostrou que a redução dos corantes ocorreu preferencialmente no grupo nitro, enquanto que a enzima livre no meio reacional resultou em mais de um produto de biotransformação para cada corante, atuando em mais de um sítio da molécula, comprovando a eficácia da imobilização enzimática para estudos de biotransformação e formação de produtos majoritários. A mutagenicidade dos corantes foi avaliado pelo ensaio de Salmonella/microssoma realizado nas estirpes TA 98 e TA 100, com e sem S9. De acordo com este ensaio, DR 73 foi o mais mutagênico. O MMIP para o corante DR 73 apresentou excelentes valores de religação (16 mg g−1 e 6 mg g−1, para MMIP e MNIP, respectivamente) indicando que o polímero molecularmente impresso formou cavidades específicas para retenção do corante. Através dos resultados obtidos por LCMS/MS, observou-se 100% de degradação do corante em apenas 60 min de tratamento via fotoeletrocatálise para soluções mais diluidas do mesmo, comprovando a eficiência da técnica na degradação de poluentes. Sendo assim, estes resultados sugerem que o MMIP mostrou uma excelente especificidade e seletividade para o corante DR 73 e uma técnica promissora na captação de corantes mutagênicos de águas superficiais, com grande potencial de aplicação e exploração na pré-concentração antes do tratamento. Além disso, a redução destes corantes por sistemas biológicos representa uma grande preocupação ambiental devido ao aumento da genotoxicidade para os seres vivos, em especial a seres humanos, produzindo compostos nocivos, tais como aminas condenadas pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer. / Synthetic azo dyes have been a matter of great concern due to the genotoxic and mutagenic potential of the products originating from azo dye biotransformation. Thus, in recent years the result of the intake of these dyes present in drinking water supplied to a population is discussed by several authors. This work evaluates the action of rat liver microsomes, reducing enzymes produced by the Escherichia coli (E. coli) and nitroreductase immobilized on biotransformation of three disperse dyes bearing azo groups, namely Disperse Red 73 (DR 73), Disperse Red 78 (DR 78), and Disperse Red 167 (DR 167). UV-Vis spectrophotometry, high-performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD), and liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) were techniques used to identify the main products generated after the process degradation of dyes. Magnetic molecularly imprinted polymers (MMIPs) were investigated using precipitation polymerization reactions for preconcentration of the dye DR 73, together with the photoelectrocatalysis degradation and subsequent analysis of the products by LC-MS/MS. In vitro studies of biotransformation metabolism of textile dyes with rat liver microsome showed that the reactions occur preferentially in the group of azo and nitro dyes, indicating the reduction of these groups by enzymes of the cytochrome P-450. There were obtained two degradation products for each dye after reaction with E. coli; the dye DR 73 gave the product 3 - ((4-aminophenyl) (ethyl) amino) propanitrila and 4-nitroaniline, the product 3 - ((4-aminophenyl) (ethyl) amino) propanitrila and 2-chloro-4-nitroaniline were obtained after reaction with the dye DR78 and DR 167 gave 3,3`-dimethyl-((3-acetamido-4-aminophenyl) azanediyl) dipropanoato and 2chloro-4-nitroaniline; indicating cleavage of the azo group, possibly by azoredutase enzyme produced by bacteria. The nitroreductase enzyme immobilized on modified magnetic particles Tosyl showed that the reduction of dyes occurred preferentially in the nitro group, while the free enzyme in the reaction medium resulted in more than a product of biotransformation for each dye, acting in more than one site of the molecule, proving the efficacy of enzyme immobilization for biotransformation studies and formation of major products. The mutagenicity of the dyes was evaluated by the Salmonella/microsome assay performed on strains TA 98 and TA 100, with and without S9. According to this assay, DR 73 was the most mutagenic. The MMIP to the dye DR 73 showed excellent rebinding values (16 mg g−1 and 6 mg g−1, for MMIP and MNIP, respectively) indicating that the molecularly imprinted polymer formed cavities for specific dye retention. Through the results obtained by LC-MS/MS, it was observed 100% dye degradation in 60 min treatment for more dilute solutions thereof, proving the efficiency of technique in pollutant degradation. Thus, these results suggest that MMIP showed excellent specificity and selectivity for the dye DR 73 and a promising technique in capturing mutagenic dyes of surface water, with great potential for application and operation in the pre-concentration before treatment. Moreover, the reduction of these dyes by biological systems is a major environmental concern due to increased of genotoxicity for living beings, especially humans, producing harmful compounds, such as condemned amines by the International Agency for Research on Cancer.

Orientador: Waldemar Gastoni Venturini Filho / Banca: Carlos Ducatti / Banca: Marcelo Zacharias Moreira / Banca: Iraê Amaral Guerrini / Banca: João Batista de A. e Silva / Resumo: O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia para quantificar a proporcao de malte e adjunto utilizada na elaboracao de cervejas do tipo Pilsen. Alem disso, verificou-se a possivel ocorrencia de fraude nas cervejas comerciais fabricadas no Brasil e foi avaliada a correlacao entre o percentual de malte com o preco de varejo da bebida. Para isso, foi testada a metodologia de isotopos estaveis atraves dos elementos quimicos carbono (13C) e nitrogenio (15N). Materias-primas cervejeiras (malte, grits de milho, quirera de arroz, xarope de maltose (HMCS) e acucar de cana), oriundas de diferentes regioes geograficas, foram usadas para a producao de mostos puros e misturas destes, a fim de produzir fermentados padroes de referencia para a construcao de gretas de calibracao-h, a partir das quais se propos um modelo de comportamento para a populacao de cervejas, atraves de analise de regressao linear invertida. Tambem foi calculado um intervalo de confianca ao nivel de 90% para a quantificacao do percentual mais provavel (PMP) de malte presente nas cervejas. Posteriormente, foram feitas analises isotopicas e fisico-quimicas de cervejas comerciais de dezessete estados brasileiros produtores da bebida. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a cevada e o malte assemelham-se entre si para os dois isotopos analisados, nao sendo possivel sua diferenciacao. As analises de Â13C sao mais indicadas para 2 se calcular o PMP de malte para cervejas elaboradas com malte e adjunto proveniente de planta de ciclo fotossintetico C4, enquanto que as analises de Â15N sao recomendadas para o calculo do PMP de malte em amostras de cerveja elaboradas com malte e arroz (C3). Foram analisadas 161 amostras de cervejas, sendo que 91,3 % utilizaram malte e adjuntos derivados de planta de ciclo C4 em sua formulacao, 4,3 % apresentaram arroz... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this work was to develop a methodology to quantify the proportion of malt and the adjunct used in the Pilsen beer brewing, to verify the possible occurrence of fraud in beer brewed in Brazil and to evaluate the correlation between the percent of malt with the beer retail price. Therefore, the methodology of stable isotopes using the chemical elements carbon (13C) and nitrogen (15N) was tested. Raw material of beer (malt, corn grits, rice, high maltose corn syrup and sugar cane) coming from different geographical regions, were used for the production of pure worts and their mixtures. These mixtures turned fermented standards of reference to make calibration straight lines, from which a model was proposed by inverted linear regression analysis, that to conduct for all Pilsen beer. Also a range of trust was calculated at a level of 90 % to quantify the most likely percentage (MLP) of malt present in beer. After that, stable isotopic analyses and physical-chemical analyses were made of brewing beer from seventeen Brazilian States brewers of beer. The results showed that barley and malt are similar in the two analyzed isotopes, not being possible to separate them. The analysis of ä13C presented the MLP of malt in brewed beer with malt and the adjunct coming from the C4 plant, and the analysis of ä15N provided the MLP of malt in beer brewed with malt and rice (both C3 plant). One hundred sixty one samples of Brazilian beer were analyzed, from which 91,3 % used malt and adjuncts of the C4 plant in its formulation, 4,3 % showed rice, 4,3% were classify like pure malt beer. From the total, 28,6 % were in the doubt range as for the MLP of malt... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor