O câncer de bexiga é a segunda neoplasia urogenital mais comum, atinge mais os homens e está relacionado principalmente com o fumo. Os tratamentos atualmente utilizados não são suficientemente efetivos, permitindo os diversos casos de recorrência, progressão do tumor e/ou morte do paciente. Assim, as pesquisas realizadas continuam buscando tratamentos mais efetivos. Diversos estudos revelam o envolvimento do sistema purinérgico na tumorigênese da bexiga, no âmbito das ectonucleotidases, há evidências de alterações em duas delas na progressão do câncer de bexiga: a NTPDase3 e a ecto-5’-NT/CD73. O urotélio normal dos camundongos expressa a NTPDase3 que é expressa em linhagem de câncer de bexiga de grau 1 (RT4), mas não em linhagem de grau 3 (T24). Já a ecto-5’-NT/CD73, não é expressa no urotélio normal de camundongos e tem baixa atividade em linhagem de câncer de bexiga de grau 1 (RT4) em comparação a linhagem de grau 3 (T24), evidenciando a possível participação destas proteínas na progressão do câncer de bexiga. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o envolvimento da NTPDase3 e da ecto-5'-NT/CD73 na progressão e malignidade do câncer de bexiga. A fim de caracterizar a expressão dessas enzimas durante a progressão do estabelecimento do câncer de bexiga, camundongos Balb-c receberam N-butil-N-(hidroxibutil)-nitrosamina (BBN) 0,05% em sua água de beber por 4, 8, 12, 18 e 24 semanas. Nas primeiras 8 semanas as bexigas dos animais apresentaram características de inflamação, em 12 semanas iniciaram as transformações neoplásicas que em 24 semanas caracterizaram câncer. NTPDase3 teve sua expressão diminuída nesse processo, enquanto a ecto-5’-NT/CD73 passou a ser expressa e sua expressão foi significativamente maior no utrotélio cancerígeno. A fim de verificar se a atividade das enzimas acompanhava as alterações de expressão, o câncer de bexiga foi induzido pela BBN em ratos Wistar por 24 semanas. As hidrólises de ATP e ADP são maiores nas bexigas dos animais controle do que no urotélio tumoral dos animais concordando com a expressão da NTPDase3. Por fim, no intuito de verificar o envolvimento dessas duas enzimas na malignidade do câncer de bexiga, a NTPDase3 foi superexpressa na linhagem T24, por transfecção com pcDNA3, e a ecto-5’-NT/CD73 foi silenciada utilizando o sistema CRISPR/Cas. Os clones de cada tranfecção foram caracterizados mostrando o sucesso de ambas transformações genéticas. As transfecções não alteraram significativamente as respostas purinérgicas testadas e os experimentos de implante tumoral in vivo mostram que a ecto-5’-NT/CD73 está provavelmente envolvida na malignidade dessa neoplasia. / The bladder cancer is the second most prevalent tumor of genitourinary tract. It is more common among men and it is mainly associated with smoking. The current treatments are not efficient enough to avoid the cases of tumor recurrence, progression and pacient death. So, the researches follow the pursuit of more effective treatments. Many studies have shown the involvement of purinergic system in the bladder tumorigenesis, in relation to the ectonucleotidases, there is evidence of the engagement of two of them, the NTPDase3 and the ecto05’-Nucleotidase/CD73. The health urothelium expresses NTPDase3, which is also expressed in a bladder cancer cell line of grade 1 (RT4) but it is not expressed in bladder cancer cell line of grade 3 (T24). While ecto-5’-NT/CD73 does not is expressed in the health urothelium of mice and presents a low activity in a bladder cancer cell line of grade 1 front of a high activity in a bladder cancer cell line of grade 3, highlighting the possible role of these proteins in the bladder cancer progression. In this way, the aim of this thesis was to investigate the involvement of NTPDase3 and ecto-5'-NT/CD73 in bladder cancer progression and malignancy. To investigate the enzymes expression during the progress of bladder cancer establishment, Balb-c mice received 0,05% of N-butyl-N-(hydroxybutyl)-nitrosamine (BBN) in its drinking water during 4, 8, 12, 18 and 24 weeks. Until the first 8 weeks just inflammation was observed in mice bladder, at 12 week beginning the neoplastic alterations that culminated in cancer after 24 weeks of induction. The NTPDase3 expression was decreased in this process while ecto-5’-NT/CD73 showed up and was significantly enhanced in cancerous urothelium. To verify if the enzyme activities were in agreement with their expression changes, bladder cancer was induced in Wistar rats with BBN for 24 weeks. The ATP and ADP hydrolysis was higher in the urothelium of control animals than in the cancerous urothelium, in accordance with NTPDase3 expression. Finally, in order to verify the involvement of these two enzymes in bladder cancer malignancy, NTPDase3 was overexpressed in T24 bladder cancer cell line, through transfection with pcDNA3, and ecto-5’-NT/CD73 was silenced with CRISPR/Cas system. The clones of each transfection were featured showing the success of both cell genetic transformations. The transfections did not significantly change the tested purinergic answers and the experiments of in vivo tumor implant shows that ecto-5’-NT/CD73 is probably involved in bladder cancer malignancy.

O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

As células estreladas hepáticas (HSCs) são a principal fonte de componentes de matriz extracelular em doenças crônicas do fígado e, por esta razão, exercem um papel fundamental no desenvolvimento e na manutenção da fibrose hepática. Os nucleotídeos e nucleosídeos são moléculas sinalizadoras que regulam diversos processos no fígado e têm um importante papel na patogênese da fibrose hepática. As ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotídeo pirofosfatase fosfodiesterases (E-NPPs), ecto-5’-nucleotidase (eNT/CD73) e a fosfatase alcalina tecido inespecífica (TNALP) são enzimas localizadas na superfície celular que regulam a concentração dos nucleotídeos no meio extracelular e, desse modo, modulam os efeitos biológicos mediados por eles via ativação dos receptores P1 e P2. Assim, neste estudo nós comparamos o metabolismo extracelular de nucleotídeos e o nível transcricional das ectoenzimas em HSCs quiescentes e ativadas usando uma linhagem de células estreladas hepáticas murina GRX. Estas células expressam o fenótipo miofibroblástico em meio basal e o tratamento com retinol ou indometacina induz a mudança das células GRX para o fenótipo quiescente das HSCs. Os dois fenótipos das células GRX expressam as NTPDase3 e 5, NPP1, 2 e 3, ecto-5’- nucleotidase e TNALP. Entretanto, apenas as HSCs ativadas expressam a NTPDase6. Nas HSCs quiescentes, a hidrólise de nucleosídeos trifosfatados foi significativamente mais alta e foi correlacionada com o aumento na expressão do mRNA da Entpd3 e ENPP3. Os nucleosídeos difosfatados foram hidrolisados de maneira similar pelos dois fenótipos das células GRX e esta atividade foi associada com o aumento da expressão do mRNA da Entpd5 nas células quiescentes e com a expressão da Entpd6 apenas nas HSCs ativadas. A atividade AMPásica foi maior nas células quiescentes do que nas células ativadas e foi relacionada com o aumento da atividade e da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase. O tratamento com retinol também envolve a ativação transcricional da TNALP. Para analisar o papel fisiológico da eNT/CD73 nas HSCs, o mRNA e a expressão desta proteína foram reduzidos nas células GRX utilizando a técnica de RNAi. O knockdown da eNT/CD73 aumentou a expressão do mRNA da TNALP e do colágeno I e alterou a adesão e a migração celular através de um mecanismo independente da hidrólise de nucleotídeos. Nós também avaliamos o efeito da adenosina na regulação de marcadores de ativação das HSCs. Este nucleosídeo diminuiu a proliferação, a migração, a transcrição de colágeno I e das metaloproteinases 2 e 9 e diminuiu a transcrição da eNT/CD73. As diferenças na atividade e expressão das ectonucleotidases entre os dois fenótipos das células GRX sugerem que estas enzimas modulam a concentração de nucleotídeos/nucleosídeos e geram efeitos distintos na sinalização purinérgica nos dois fenótipos e podem ser importantes alvos na regulação das funções das HSCs. / Hepatic stellate cells (HSC) are recognized as a primary cellular source of matrix components in chronic liver disease and, therefore, play a critical role in the development and maintenance of liver fibrosis. Nucleotides and nucleosides are signaling molecules that regulate a variety of activities within the liver and play a role in the pathogenesis of hepatic fibrosis. Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases (E-NPPs), ecto- 5’-nucleotidase (eNT/CD73) and tissue non-specific alkaline phosphatase (TNALP) are enzymes that are located at the cell surface and regulate the concentration of extracellular nucleotides, thereby modulating their biological effects by the activation of P1 and P2 receptors. Thus, in the study we compared the extracellular metabolism of nucleotides and transcriptional levels of ectoenzymes in activated and quiescent HSC of the mouse hepatic stellate cell line GRX. This cell line expresses a myofibroblast phenotype in basal medium and both retinol and indomethacin treatment induced a phenotypic change of GRX cells to quiescent HSC. Two phenotypes of GRX cells expressed NTPDase3 and 5, NPP1, 2 and 3, ecto-5’-nucleotidase/CD73 and TNALP. However, only activated HSC expressed NTPDase6. In quiescent HSC, the hydrolysis of triphosphonucleosides was significantly higher and was related to an increase in Entpd3 and ENPP3 mRNA expression. The diphosphonucleosides were hydrolyzed at a similar rate by two phenotypes of GRX cells and this hydrolysis was associated with an up-regulation of Entpd5 mRNA expression in quiescent-like HSC, whilst Entpd6 mRNA expression was observed only in activated HSC. The AMPase activity in quiescent HSC was higher than myofibroblasts and was related to an increase in ecto-5’-nucleotidase activity and its mRNA expression. The treatment with retinol also involves transcriptional activation of TNALP. To analyze the biological significance of eNT/CD73 in HSC, the expression of eNT/CD73 mRNA and protein was reduced in GRX cell line using the technique of RNAi. ENTCD73 knockdown leads to an increase in mRNA expression of TNALP and collagen I, and a clear alteration of cell adhesion and migration by a mechanism not dependent of changes in nucleotide metabolism. We also tested the effect of adenosine on the regulation of activation markers of in HSCs. This nucleotide decreased proliferation, migration, transcription of collagen I and matrix metalloproteinases 2 e 9 and increased transcription of eNT/CD73. The differential ectonucleotidases activities and expressions in two phenotypes of GRX cells suggest that these enzymes modulate the concentration of nucleotides/nucleosides and affect purinergic signaling differently in the two phenotypes and may play a role in the regulation of HSC functions.

Ectonucleotidases constituem uma cascata enzimática altamente organizada para regulação da sinalização mediada por nucleotídeos, controlando a quantidade e a taxa de degradação destes, além da formação do respectivo nucleosídeo. Nucleotídeos/ nucleosídeos extracelulares são conhecidos por regularem diversas respostas fisiológicas, incluindo o tônus vascular, função cardíaca e homeostasia. Neste estudo nós analisamos a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em tecido de ventrículo esquerdo (VE) de ratos. A análise por PCR mostrou a expressão da NTPDase1, 2, 3,5,6, ecto-5'-NT/CD73, NPP2 e NPP3, excluindo a presença da NPP1 e NTPDase8. Através da análise por PCR em tempo real, encontramos o maior nível de expressão de mRNA para a NTPDase2 no ventrículo esquerdo. Também caracterizamos as propriedades bioquímicas e atividades enzimáticas em sinaptossomas de terminal nervoso (sinaptossoma cardíaco) em VE. No estudo das propriedades das E-NTPDases e ecto-5'-NT, observamos dependência de cátions divalentes, pH ótimo de 8.0 para as hidrólises de ATP e ADP e 9.5 para a hidrólise de AMP. Os valores de Km aparente são 40 µM, 90 µM, 39 µM e os valores de Vmax aparente são 537, 219 and 111 nmol Pi liberado/min/mg de proteína para as hidrólises de ATP, ADP e AMP, respectivamente. Oligomicina e azida, ambos inibidores de ATPases mitocondriais, inibiram somente a hidrólise de ATP. A hidrólise de AMP não foi afetada por levamisole e tetramisole, enquanto molibdato de amônio praticamente aboliu a atividade da ecto-5'-nucleotidase. Utilizando o p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato marcador para E-NPPs na preparação de sinaptossoma cardíaco, observamos um pH alcalino, dependência de cátions divalentes e valores de Km de 91.42 ± 13.97 µM e Vmax calculado de 63.79 ± 3.59 nmol p-nitrofenol liberado/min/mg de proteína. Não houve alteração na hidrólise do substrato com adição de levamisole no pH de 8.9 (pH ótimo caracterizado), porém o suramin reduziu fortemente a hidrólise de p-Nph-5'-TMP. Para estudarmos se estas enzimas poderiam participar na patofisiologia das doenças diabéticas cardiovasculares, usamos um modelo de diabetes experimental por estreptozotocina (STZ) 65mg/kg. A injeção de STZ causou aumento da glicemia, perda de peso corporal, diminuição dos batimentos cardíacos e pressão sangüínea. Seis dias de tratamento com insulina foram capazes de reverter as alterações encontradas no diabetes. Houve uma inibição das hidrólises de ATP e ADP, mas não de AMP e p-Nph-5'-TMP em sinaptossoma cardíaco. O tratamento com insulina reverteu as hidrólises para os níveis do controle (citrato). A análise do metabolismo extracelular de ATP em sinaptossoma cardíaco por HPLC mostrou que o ATP é hidrolisado mais lentamente no grupo diabético. Dados preliminares de análise molecular sugerem a participação das NTPDases 1 e 2 nas hidrólises de nucleotídeos em sinaptossoma cardíaco. Com o intuito de analisar um material biológico de fácil obtenção, avaliamos as atividades das ectonucleotidases e o perfil extracelular de hidrólise de ATP em soro de ratos diabéticos e também a influência da glicemia nestas atividades. Trinta dias após a injeção de STZ, observamos um aumento nas hidrólises de ATP, ADP, AMP e p-Nph-5'-TMP, quando comparados ao grupo citrato e este aumento foi revertido com 6 dias de tratamento com insulina. Glicose (20 mM), in vitro, não afetou a atividade enzimática em soro de ratos controle, após 24 h de pré-incubação. A análise por HPLC mostrou uma rápida hidrólise de ATP em soro de animais diabéticos, diminuindo os níveis de ATP e ADP mais rapidamente do que os grupos controle e insulina. Mostramos uma alteração na hidrólise de nucleotídeos em sinaptossoma cardíaco e em soro de ratos diabéticos. A alteração encontrada em coração parece fazer parte da etiologia da doença cardiovascular diabética. No entando, a alteração encontrada no soro dos ratos diabéticos, diminuição de ADP (pró-agregante plaquetário) e aumento de adenosina (antiagregante plaquetário) parece participar de um sistema de proteção a possíveis danos vasculares decorrentes do diabetes. / Ectonucleotidases constitute a highly organized enzymatic cascade in the regulation of nucleotidemediated signaling, controlling the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. Extracellular nucleotides/nucleosides are known to regulate several physiological responses, including vascular tone, cardiac function and haemostasis. In this study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, ecto-5'-nucleotidase/CD73 and E-NPPs in rat heart left ventricle. RT-PCR analysis from left ventricle tissue demonstrated different levels of expression of NTPDase1, 2, 3, 5, 6, 5'-NT/CD73, NPP2 and NPP3, but excluded the presence of NPP1 and NTPDase8. By quantitative real-time PCR we identified the NTPDase2 as the enzyme with the highest mRNA expression in rat left ventricle. Moreover, we characterized the biochemical properties and enzyme activities from synaptosomes of the nerve terminal endings (cardiac synaptosomes) of heart left ventricle. In the E-NTPDases study, we observed divalent cation-dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 for ATP and ADP hydrolysis, and 9.5 for AMP hydrolysis. The apparent Km values are 40 µM, 90 µM and 39 µM and apparent Vmax values are 537, 219 and 111 nmol Pi released/min/mg of protein for ATP, ADP and AMP hydrolysis, respectively. Oligomycin and sodium azide, both mitochondrial ATPase inhibitors, inhibited only the ATP hydrolysis. AMP hydrolysis was not affected by levamisole and tetramisole, whereas ammonium molybdate practically abolished the ecto-5'-nucleotidase activity. Using p-nitrophenyl-5'- thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs in rat cardiac synaptosomes, we observed an alkaline pH dependence, divalent cation dependence and the Km value corresponded to 91.42 ± 13.97 μM and Vmax value calculated was 63,79 ± 3,59 nmol p-nitrophenol released/min/mg of protein. Levamisole was ineffective as inhibitor of p-Nph-5'-TMP hydrolysis in pH 8.9 (optimum pH for the enzyme characterized). Suramin strongly reduced the hydrolysis of p- Nph-5'-TMP. In order to study if these enzymes could participate in the pathophysiology of diabetic cardiovascular diseases, we induced experimental diabetes with an injection of streptozotocin 65mg/kg to study diabetic complications. The STZ injection caused a rise in glucose levels, loss of body weight, lower heart rate (HR) and systolic blood pressure (SBP) when compared to citrate group (control). The 6 days insulin treatment was able to reverse these parameters. There was an inhibition in ATP and ADP, but not in AMP and p-Nph-5'-TMP hydrolysis in cardiac synaptosomes and the insulin treatment returned the hydrolysis to the citrate group levels. The analysis of extracellular ATP metabolism in cardiac synaptosomes by HPLC shows that ATP was hydrolyzed slower in diabetes group. Preliminar data from molecular analysis suggest the participação of NTPDases 1 and 2 on nucleotide hydrolysis in cardiac synaptosomes. In order to analyse a readily available biological material, we evaluated the ectonucleotidases activities and the profile of extracellular ATP metabolism in blood serum of streptozotocin-diabetic rats and the influence of glycemic status. The 30 days of STZ injection was associated with a raise in ATP, ADP, AMP, and 5'-TMP hydrolysis in blood serum, when compared to the citrate group. In vitro, 20 mM glucose added did not affect ectonucleotidases activities in normal blood serum of rats with 24 h of preincubation. HPLC analysis showed a rapid hydrolysis of extracellular ATP by diabetic animals, decreasing the ATP and ADP levels faster than in serum of control and insulin groups, leading to the formation of high levels of adenosine when compared with citrate and insulin groups. We showed alterations in the nucleotides hydrolysis in the cardiac synaptosomes and in serum from diabetic rats. The cardiac alteration seems to be related to the ethiology of cardiac problems. However, the serum hydrolysis alterations seems to be related to a vascular protection, with the diminution of ADP (pro-agregant) and an increase in adenosine (antiagregant), found in diabetic serum rats.

Considerando que a deficiência hormonal causada pela ovariectomia promove alterações nas atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, acetilcolinesterase (AChE) e ectonucleotidases e pode prejudicar a memória em ratas, no presente trabalho nós investigamos a influência do exercício físico sobre a ativação da Na+,K+-ATPase e acetilcolinesterase em hipocampo e córtex cerebral causada pela ovariectomia em ratas adultas, bem como sobre a hidrólise de nucleotídeos de adenosina no córtex cerebral e no soro. Também investigamos o efeito do exercício sobre a memória espacial e aversiva em ratas adultas ovariectomizadas. Ratas Wistar adultas foram divididas em quatro grupos: sham (submetidas à cirurgia sem a remoção dos ovários), exercício, ovariectomizadas (Ovx) e Ovx+exercício. Trinta dias após a cirurgia, os animais foram submetidos a um mês de exercício físico por 20 min, três vezes por semana. Logo após, as ratas foram decapitados, o soro coletado e o hipocampo e córtex cerebral dissecados, ou foram submetidas às tarefas de esquiva inibitória e labirinto aquático de Morris. Os dados demonstraram que o exercício físico reverte a ativação das atividades da Na+,K+-ATPase e AChE em hipocampo e córtex cerebral de ratas ovariectomizadas. A ovariectomia diminuiu a hidrólise de AMP no córtex cerebral e não alterou a hidrólise de nucleotídeos de adenosina sérica. Exercício per se diminuiu a hidrólise de ADP e AMP em córtex cerebral. Resultados também mostraram que ratas ovariectomizadas apresentaram prejuízo na memória aversiva e espacial (memória de referência e de trabalho), quando comparadas ao grupo controle (sham). Confirmando nossa hipótese, o déficit na memória foi revertido pelo exercício físico. Nossos achados mostram que a ovariectomia prejudica significativamente a memória/aprendizado aversiva e espacial e altera as enzimas Na+,K+-ATPase e AChE, e que o exercício físico preveniu tais efeitos. Esses dados sugerem que o exercício físico pode se mostrar uma estratégia importante para minimizar déficits cognitivos encontrados em mulheres pósmenopáusicas. / Hormone deficiency following ovariectomy causes activation of Na+,K+- ATPase and acetylcholinesterase (AChE), that has been related to cognitive deficits in experimental animals, and memory impairment. Considering that physical exercise presents neuroprotector effects, we decide to investigate whether exercise training would affect enzyme activation in hippocampus and cerebral cortex, as well as adenosine nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of ovariectomized rats, and ovariectomy-induced memory deficits in inhibitory avoidance and Morris water maze tasks. Female adult Wistar rats were assigned to one of the following groups: sham (submitted to surgery without removal of the ovaries), exercise, ovariectomized (Ovx) and Ovx plus exercise. Thirty days after surgery, animals were submitted to one month of exercise training for 20 min, three times per week. After, rats were euthanized, blood serum was collected and hippocampus and cerebral cortex were dissected, or rats were tested in inhibitory avoidance and Morris water maze tasks. Data demonstrated that exercise reversed the activation of Na+,K+-ATPase and AChE activities both in hippocampus and cerebral cortex of ovariectomized rats. Ovariectomy decreased AMP hydrolysis in cerebral cortex and did not alter adenosine nucleotides hydrolysis in blood serum. Exercise per se decreased ADP and AMP hydrolysis in cerebral cortex. On the other hand, AMP hydrolysis in blood serum was increased by exercise in ovariectomized adult rats. Results also show that ovariectomized rats presented impairment in aversive memory and spatial navigation, both in reference and working memory protocols, when compared to sham group (control). Confirming our hypothesis, ovariectomized rats submitted to exercise had those impairments prevented. We conclude that ovariectomy significantly impairs aversive and spatial reference learning/memory and related enzymes, and that physical exercise prevents such effects. These findings support that physical exercise might constitute an important strategy to minimize cognitive deficits found in postmenopausal women.

O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

O câncer de bexiga é a segunda neoplasia urogenital mais comum, atinge mais os homens e está relacionado principalmente com o fumo. Os tratamentos atualmente utilizados não são suficientemente efetivos, permitindo os diversos casos de recorrência, progressão do tumor e/ou morte do paciente. Assim, as pesquisas realizadas continuam buscando tratamentos mais efetivos. Diversos estudos revelam o envolvimento do sistema purinérgico na tumorigênese da bexiga, no âmbito das ectonucleotidases, há evidências de alterações em duas delas na progressão do câncer de bexiga: a NTPDase3 e a ecto-5’-NT/CD73. O urotélio normal dos camundongos expressa a NTPDase3 que é expressa em linhagem de câncer de bexiga de grau 1 (RT4), mas não em linhagem de grau 3 (T24). Já a ecto-5’-NT/CD73, não é expressa no urotélio normal de camundongos e tem baixa atividade em linhagem de câncer de bexiga de grau 1 (RT4) em comparação a linhagem de grau 3 (T24), evidenciando a possível participação destas proteínas na progressão do câncer de bexiga. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o envolvimento da NTPDase3 e da ecto-5'-NT/CD73 na progressão e malignidade do câncer de bexiga. A fim de caracterizar a expressão dessas enzimas durante a progressão do estabelecimento do câncer de bexiga, camundongos Balb-c receberam N-butil-N-(hidroxibutil)-nitrosamina (BBN) 0,05% em sua água de beber por 4, 8, 12, 18 e 24 semanas. Nas primeiras 8 semanas as bexigas dos animais apresentaram características de inflamação, em 12 semanas iniciaram as transformações neoplásicas que em 24 semanas caracterizaram câncer. NTPDase3 teve sua expressão diminuída nesse processo, enquanto a ecto-5’-NT/CD73 passou a ser expressa e sua expressão foi significativamente maior no utrotélio cancerígeno. A fim de verificar se a atividade das enzimas acompanhava as alterações de expressão, o câncer de bexiga foi induzido pela BBN em ratos Wistar por 24 semanas. As hidrólises de ATP e ADP são maiores nas bexigas dos animais controle do que no urotélio tumoral dos animais concordando com a expressão da NTPDase3. Por fim, no intuito de verificar o envolvimento dessas duas enzimas na malignidade do câncer de bexiga, a NTPDase3 foi superexpressa na linhagem T24, por transfecção com pcDNA3, e a ecto-5’-NT/CD73 foi silenciada utilizando o sistema CRISPR/Cas. Os clones de cada tranfecção foram caracterizados mostrando o sucesso de ambas transformações genéticas. As transfecções não alteraram significativamente as respostas purinérgicas testadas e os experimentos de implante tumoral in vivo mostram que a ecto-5’-NT/CD73 está provavelmente envolvida na malignidade dessa neoplasia. / The bladder cancer is the second most prevalent tumor of genitourinary tract. It is more common among men and it is mainly associated with smoking. The current treatments are not efficient enough to avoid the cases of tumor recurrence, progression and pacient death. So, the researches follow the pursuit of more effective treatments. Many studies have shown the involvement of purinergic system in the bladder tumorigenesis, in relation to the ectonucleotidases, there is evidence of the engagement of two of them, the NTPDase3 and the ecto05’-Nucleotidase/CD73. The health urothelium expresses NTPDase3, which is also expressed in a bladder cancer cell line of grade 1 (RT4) but it is not expressed in bladder cancer cell line of grade 3 (T24). While ecto-5’-NT/CD73 does not is expressed in the health urothelium of mice and presents a low activity in a bladder cancer cell line of grade 1 front of a high activity in a bladder cancer cell line of grade 3, highlighting the possible role of these proteins in the bladder cancer progression. In this way, the aim of this thesis was to investigate the involvement of NTPDase3 and ecto-5'-NT/CD73 in bladder cancer progression and malignancy. To investigate the enzymes expression during the progress of bladder cancer establishment, Balb-c mice received 0,05% of N-butyl-N-(hydroxybutyl)-nitrosamine (BBN) in its drinking water during 4, 8, 12, 18 and 24 weeks. Until the first 8 weeks just inflammation was observed in mice bladder, at 12 week beginning the neoplastic alterations that culminated in cancer after 24 weeks of induction. The NTPDase3 expression was decreased in this process while ecto-5’-NT/CD73 showed up and was significantly enhanced in cancerous urothelium. To verify if the enzyme activities were in agreement with their expression changes, bladder cancer was induced in Wistar rats with BBN for 24 weeks. The ATP and ADP hydrolysis was higher in the urothelium of control animals than in the cancerous urothelium, in accordance with NTPDase3 expression. Finally, in order to verify the involvement of these two enzymes in bladder cancer malignancy, NTPDase3 was overexpressed in T24 bladder cancer cell line, through transfection with pcDNA3, and ecto-5’-NT/CD73 was silenced with CRISPR/Cas system. The clones of each transfection were featured showing the success of both cell genetic transformations. The transfections did not significantly change the tested purinergic answers and the experiments of in vivo tumor implant shows that ecto-5’-NT/CD73 is probably involved in bladder cancer malignancy.

A hiper-homocisteinemia leve é um fator de risco para doenças cerebrais e cardiovasculares embora os mecanismos subjacentes a essas alterações não estejam completamente elucidados. O objetivo principal desta tese de doutorado foi desenvolver um modelo experimental crônico quimicamente induzido de hiper-homocisteinemia leve em ratos adultos. Usando esse modelo, investigamos alguns parâmetros bioquímicos no sistema nervoso central e periférico, a fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos na toxicidade mediada pela homocisteína. A hiper-homocisteinemia leve foi induzida em ratos Wistar através da administração subcutânea de homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal), duas vezes ao dia, do 30° a 60° dia de vida. Ratos controle receberam o mesmo volume de solução salina. Resultados demonstraram que animais submetidos a esse modelo apresentaram níveis plasmáticos de homocisteína de aproximadamente 30 μM. Em relação aos parâmetros bioquímicos, a hiper-homocisteinemia leve experimental induziu estresse oxidativo em plasma, córtex cerebral, coração e aorta, bem como diminuiu a atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas α1 e α2 da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral e hipocampo de ratos adultos. Por outro lado, não foram observadas alterações nos níveis de mRNA transcrito da Na+,K+-ATPase em nenhuma estrutura cerebral estudada. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi significativamente diminuída em linfócitos e sinaptossomas obtidos de córtex cerebral, mas não foi alterada em soro de ratos adultos. A transcrição da ecto-5'-nucleotidase foi significativamente reduzida, mas a expressão das E-NTPDases não foi alterada em linfonodos mesentéricos de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve experimental. Foi observado um aumento nos níveis de mRNA transcrito da E-NTPDase1 e ecto-5'-nucleotidase em córtex cerebral de ratos. Os níveis de ATP foram aumentados, enquanto a adenosina foi diminuída no líquor de ratos tratados com homocisteína. Em relação aos parâmetros inflamatórios, foi observado um aumento nos níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e a quimiocina MCP-1 no hipocampo, enquanto os níveis de IL-1β e a IL-6 foram aumentados em córtex cerebral. Os ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve apresentaram um aumento na atividade da acetilcolinesterase em ambas as estruturas cerebrais testadas; o imunoconteúdo dessa enzima foi significativamente aumentado no córtex cerebral e diminuído no hipocampo, enquanto os níveis de mRNA transcrito da acetilcolinesterase não foram alterados. Perifericamente, a homocisteína aumentou os níveis de TNF-α, IL-6 e MCP-1 em coração e os níveis de IL-6 no soro, mas não alterou a atividade da enzima butirilcolinesterase. Em conjunto, os resultados deste trabalho mostram que a homocisteína promove um estado oxidativo e inflamatório central e periférico além de prejudicar a funcionalidade de enzimas cerebrais importantes. Considerando que a hiper-homocisteinemia leve é prevalente na população e tem sido considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cerebrais e cardíacas, o presente modelo experimental pode ser útil na investigação da patofisiologia de doenças causadas pela homocisteína e estratégias de prevenção. / Mild hyperhomocysteinemia is a risk factor for cerebral and cardiovascular diseases although the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to develop a chronic chemically-induced model of mild hyperhomocysteinemia in adult rats. By using this model, we investigated some biochemical parameters in the central nervous system and peripheral, in order to better understand the mechanisms involved in homocysteine-mediated toxicity. The mild hyperhomocysteinemia was induced in rats by subcutaneous administration of homocysteine (0.03 μmol/g body weight) twice a day to the 30th to 60 day of life. Control rats received the same volume of saline. Results showed that animals subjected to this model had plasma homocysteine levels of approximately 30 μM. Results demonstrated that the experimental mild hyperhomocysteinemia elicited oxidative stress in plasma, cerebral cortex, heart and aorta and decreased the activity and the immunocontent of the α1 and α2 subunits of the Na+,K+-ATPase in cerebral cortex and hippocampus of adult rats. On the other hand, no change in levels of Na+,K+-ATPase mRNA transcripts in such cerebral structures. ATP, ADP and AMP hydrolysis were significantly decreased in lymphocytes and in the synaptosomal fraction of cerebral cortex, without any alteration in serum of adult rats. The transcript of the ecto-5'-nucleotidase was significantly reduced, but the expression of E-NTPDases were not altered in mesenteric lymph nodes of hyperhomocysteinemic rats. I have been observed an increase in E-NTPDase1 and ecto-5′-nucleotidase transcripts in rat cerebral cortex. ATP levels were increased, while adenosine decreased in cerebrospinal fluid of Hcy-treated rats. In relation to inflammatory parameters, was observed an increase in TNF-α, IL-1β, IL-6 and the chemokine MCP-1 in the hippocampus, while IL-1β and IL-6 levels were enhanced in cerebral cortex. Rats subjected to mild hyperhomocysteinemia presented an increase in acetylcholinesterase activity in both cerebral structures tested; the immunocontent of this enzyme was significantly increased in the cerebral cortex and decreased in the hippocampus while levels of acetylcholinesterase mRNA transcripts were not altered. Peripherally, homocysteine increased TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels in the heart and IL-6 levels in serum, but not altered the butyrylcholinesterase activity. Together, the results of this work show that homocysteine promotes central and peripheral oxidative and inflammatory state besides affecting the functionality of important brain enzymes. Whereas mild hyperhomocysteinemia is prevalent in the population and has been considered a risk factor for the development of brain and heart diseases, this experimental model may be useful for the investigation of patophysiology of diseases caused by homocysteine and prevention strategies.

Ectonucleotidases constituem uma cascata enzimática altamente organizada para regulação da sinalização mediada por nucleotídeos, controlando a quantidade e a taxa de degradação destes, além da formação do respectivo nucleosídeo. Nucleotídeos/ nucleosídeos extracelulares são conhecidos por regularem diversas respostas fisiológicas, incluindo o tônus vascular, função cardíaca e homeostasia. Neste estudo nós analisamos a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em tecido de ventrículo esquerdo (VE) de ratos. A análise por PCR mostrou a expressão da NTPDase1, 2, 3,5,6, ecto-5'-NT/CD73, NPP2 e NPP3, excluindo a presença da NPP1 e NTPDase8. Através da análise por PCR em tempo real, encontramos o maior nível de expressão de mRNA para a NTPDase2 no ventrículo esquerdo. Também caracterizamos as propriedades bioquímicas e atividades enzimáticas em sinaptossomas de terminal nervoso (sinaptossoma cardíaco) em VE. No estudo das propriedades das E-NTPDases e ecto-5'-NT, observamos dependência de cátions divalentes, pH ótimo de 8.0 para as hidrólises de ATP e ADP e 9.5 para a hidrólise de AMP. Os valores de Km aparente são 40 µM, 90 µM, 39 µM e os valores de Vmax aparente são 537, 219 and 111 nmol Pi liberado/min/mg de proteína para as hidrólises de ATP, ADP e AMP, respectivamente. Oligomicina e azida, ambos inibidores de ATPases mitocondriais, inibiram somente a hidrólise de ATP. A hidrólise de AMP não foi afetada por levamisole e tetramisole, enquanto molibdato de amônio praticamente aboliu a atividade da ecto-5'-nucleotidase. Utilizando o p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato marcador para E-NPPs na preparação de sinaptossoma cardíaco, observamos um pH alcalino, dependência de cátions divalentes e valores de Km de 91.42 ± 13.97 µM e Vmax calculado de 63.79 ± 3.59 nmol p-nitrofenol liberado/min/mg de proteína. Não houve alteração na hidrólise do substrato com adição de levamisole no pH de 8.9 (pH ótimo caracterizado), porém o suramin reduziu fortemente a hidrólise de p-Nph-5'-TMP. Para estudarmos se estas enzimas poderiam participar na patofisiologia das doenças diabéticas cardiovasculares, usamos um modelo de diabetes experimental por estreptozotocina (STZ) 65mg/kg. A injeção de STZ causou aumento da glicemia, perda de peso corporal, diminuição dos batimentos cardíacos e pressão sangüínea. Seis dias de tratamento com insulina foram capazes de reverter as alterações encontradas no diabetes. Houve uma inibição das hidrólises de ATP e ADP, mas não de AMP e p-Nph-5'-TMP em sinaptossoma cardíaco. O tratamento com insulina reverteu as hidrólises para os níveis do controle (citrato). A análise do metabolismo extracelular de ATP em sinaptossoma cardíaco por HPLC mostrou que o ATP é hidrolisado mais lentamente no grupo diabético. Dados preliminares de análise molecular sugerem a participação das NTPDases 1 e 2 nas hidrólises de nucleotídeos em sinaptossoma cardíaco. Com o intuito de analisar um material biológico de fácil obtenção, avaliamos as atividades das ectonucleotidases e o perfil extracelular de hidrólise de ATP em soro de ratos diabéticos e também a influência da glicemia nestas atividades. Trinta dias após a injeção de STZ, observamos um aumento nas hidrólises de ATP, ADP, AMP e p-Nph-5'-TMP, quando comparados ao grupo citrato e este aumento foi revertido com 6 dias de tratamento com insulina. Glicose (20 mM), in vitro, não afetou a atividade enzimática em soro de ratos controle, após 24 h de pré-incubação. A análise por HPLC mostrou uma rápida hidrólise de ATP em soro de animais diabéticos, diminuindo os níveis de ATP e ADP mais rapidamente do que os grupos controle e insulina. Mostramos uma alteração na hidrólise de nucleotídeos em sinaptossoma cardíaco e em soro de ratos diabéticos. A alteração encontrada em coração parece fazer parte da etiologia da doença cardiovascular diabética. No entando, a alteração encontrada no soro dos ratos diabéticos, diminuição de ADP (pró-agregante plaquetário) e aumento de adenosina (antiagregante plaquetário) parece participar de um sistema de proteção a possíveis danos vasculares decorrentes do diabetes. / Ectonucleotidases constitute a highly organized enzymatic cascade in the regulation of nucleotidemediated signaling, controlling the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. Extracellular nucleotides/nucleosides are known to regulate several physiological responses, including vascular tone, cardiac function and haemostasis. In this study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, ecto-5'-nucleotidase/CD73 and E-NPPs in rat heart left ventricle. RT-PCR analysis from left ventricle tissue demonstrated different levels of expression of NTPDase1, 2, 3, 5, 6, 5'-NT/CD73, NPP2 and NPP3, but excluded the presence of NPP1 and NTPDase8. By quantitative real-time PCR we identified the NTPDase2 as the enzyme with the highest mRNA expression in rat left ventricle. Moreover, we characterized the biochemical properties and enzyme activities from synaptosomes of the nerve terminal endings (cardiac synaptosomes) of heart left ventricle. In the E-NTPDases study, we observed divalent cation-dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 for ATP and ADP hydrolysis, and 9.5 for AMP hydrolysis. The apparent Km values are 40 µM, 90 µM and 39 µM and apparent Vmax values are 537, 219 and 111 nmol Pi released/min/mg of protein for ATP, ADP and AMP hydrolysis, respectively. Oligomycin and sodium azide, both mitochondrial ATPase inhibitors, inhibited only the ATP hydrolysis. AMP hydrolysis was not affected by levamisole and tetramisole, whereas ammonium molybdate practically abolished the ecto-5'-nucleotidase activity. Using p-nitrophenyl-5'- thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs in rat cardiac synaptosomes, we observed an alkaline pH dependence, divalent cation dependence and the Km value corresponded to 91.42 ± 13.97 μM and Vmax value calculated was 63,79 ± 3,59 nmol p-nitrophenol released/min/mg of protein. Levamisole was ineffective as inhibitor of p-Nph-5'-TMP hydrolysis in pH 8.9 (optimum pH for the enzyme characterized). Suramin strongly reduced the hydrolysis of p- Nph-5'-TMP. In order to study if these enzymes could participate in the pathophysiology of diabetic cardiovascular diseases, we induced experimental diabetes with an injection of streptozotocin 65mg/kg to study diabetic complications. The STZ injection caused a rise in glucose levels, loss of body weight, lower heart rate (HR) and systolic blood pressure (SBP) when compared to citrate group (control). The 6 days insulin treatment was able to reverse these parameters. There was an inhibition in ATP and ADP, but not in AMP and p-Nph-5'-TMP hydrolysis in cardiac synaptosomes and the insulin treatment returned the hydrolysis to the citrate group levels. The analysis of extracellular ATP metabolism in cardiac synaptosomes by HPLC shows that ATP was hydrolyzed slower in diabetes group. Preliminar data from molecular analysis suggest the participação of NTPDases 1 and 2 on nucleotide hydrolysis in cardiac synaptosomes. In order to analyse a readily available biological material, we evaluated the ectonucleotidases activities and the profile of extracellular ATP metabolism in blood serum of streptozotocin-diabetic rats and the influence of glycemic status. The 30 days of STZ injection was associated with a raise in ATP, ADP, AMP, and 5'-TMP hydrolysis in blood serum, when compared to the citrate group. In vitro, 20 mM glucose added did not affect ectonucleotidases activities in normal blood serum of rats with 24 h of preincubation. HPLC analysis showed a rapid hydrolysis of extracellular ATP by diabetic animals, decreasing the ATP and ADP levels faster than in serum of control and insulin groups, leading to the formation of high levels of adenosine when compared with citrate and insulin groups. We showed alterations in the nucleotides hydrolysis in the cardiac synaptosomes and in serum from diabetic rats. The cardiac alteration seems to be related to the ethiology of cardiac problems. However, the serum hydrolysis alterations seems to be related to a vascular protection, with the diminution of ADP (pro-agregant) and an increase in adenosine (antiagregant), found in diabetic serum rats.

A hiper-homocisteinemia leve é um fator de risco para doenças cerebrais e cardiovasculares embora os mecanismos subjacentes a essas alterações não estejam completamente elucidados. O objetivo principal desta tese de doutorado foi desenvolver um modelo experimental crônico quimicamente induzido de hiper-homocisteinemia leve em ratos adultos. Usando esse modelo, investigamos alguns parâmetros bioquímicos no sistema nervoso central e periférico, a fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos na toxicidade mediada pela homocisteína. A hiper-homocisteinemia leve foi induzida em ratos Wistar através da administração subcutânea de homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal), duas vezes ao dia, do 30° a 60° dia de vida. Ratos controle receberam o mesmo volume de solução salina. Resultados demonstraram que animais submetidos a esse modelo apresentaram níveis plasmáticos de homocisteína de aproximadamente 30 μM. Em relação aos parâmetros bioquímicos, a hiper-homocisteinemia leve experimental induziu estresse oxidativo em plasma, córtex cerebral, coração e aorta, bem como diminuiu a atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas α1 e α2 da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral e hipocampo de ratos adultos. Por outro lado, não foram observadas alterações nos níveis de mRNA transcrito da Na+,K+-ATPase em nenhuma estrutura cerebral estudada. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi significativamente diminuída em linfócitos e sinaptossomas obtidos de córtex cerebral, mas não foi alterada em soro de ratos adultos. A transcrição da ecto-5'-nucleotidase foi significativamente reduzida, mas a expressão das E-NTPDases não foi alterada em linfonodos mesentéricos de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve experimental. Foi observado um aumento nos níveis de mRNA transcrito da E-NTPDase1 e ecto-5'-nucleotidase em córtex cerebral de ratos. Os níveis de ATP foram aumentados, enquanto a adenosina foi diminuída no líquor de ratos tratados com homocisteína. Em relação aos parâmetros inflamatórios, foi observado um aumento nos níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e a quimiocina MCP-1 no hipocampo, enquanto os níveis de IL-1β e a IL-6 foram aumentados em córtex cerebral. Os ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve apresentaram um aumento na atividade da acetilcolinesterase em ambas as estruturas cerebrais testadas; o imunoconteúdo dessa enzima foi significativamente aumentado no córtex cerebral e diminuído no hipocampo, enquanto os níveis de mRNA transcrito da acetilcolinesterase não foram alterados. Perifericamente, a homocisteína aumentou os níveis de TNF-α, IL-6 e MCP-1 em coração e os níveis de IL-6 no soro, mas não alterou a atividade da enzima butirilcolinesterase. Em conjunto, os resultados deste trabalho mostram que a homocisteína promove um estado oxidativo e inflamatório central e periférico além de prejudicar a funcionalidade de enzimas cerebrais importantes. Considerando que a hiper-homocisteinemia leve é prevalente na população e tem sido considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cerebrais e cardíacas, o presente modelo experimental pode ser útil na investigação da patofisiologia de doenças causadas pela homocisteína e estratégias de prevenção. / Mild hyperhomocysteinemia is a risk factor for cerebral and cardiovascular diseases although the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to develop a chronic chemically-induced model of mild hyperhomocysteinemia in adult rats. By using this model, we investigated some biochemical parameters in the central nervous system and peripheral, in order to better understand the mechanisms involved in homocysteine-mediated toxicity. The mild hyperhomocysteinemia was induced in rats by subcutaneous administration of homocysteine (0.03 μmol/g body weight) twice a day to the 30th to 60 day of life. Control rats received the same volume of saline. Results showed that animals subjected to this model had plasma homocysteine levels of approximately 30 μM. Results demonstrated that the experimental mild hyperhomocysteinemia elicited oxidative stress in plasma, cerebral cortex, heart and aorta and decreased the activity and the immunocontent of the α1 and α2 subunits of the Na+,K+-ATPase in cerebral cortex and hippocampus of adult rats. On the other hand, no change in levels of Na+,K+-ATPase mRNA transcripts in such cerebral structures. ATP, ADP and AMP hydrolysis were significantly decreased in lymphocytes and in the synaptosomal fraction of cerebral cortex, without any alteration in serum of adult rats. The transcript of the ecto-5'-nucleotidase was significantly reduced, but the expression of E-NTPDases were not altered in mesenteric lymph nodes of hyperhomocysteinemic rats. I have been observed an increase in E-NTPDase1 and ecto-5′-nucleotidase transcripts in rat cerebral cortex. ATP levels were increased, while adenosine decreased in cerebrospinal fluid of Hcy-treated rats. In relation to inflammatory parameters, was observed an increase in TNF-α, IL-1β, IL-6 and the chemokine MCP-1 in the hippocampus, while IL-1β and IL-6 levels were enhanced in cerebral cortex. Rats subjected to mild hyperhomocysteinemia presented an increase in acetylcholinesterase activity in both cerebral structures tested; the immunocontent of this enzyme was significantly increased in the cerebral cortex and decreased in the hippocampus while levels of acetylcholinesterase mRNA transcripts were not altered. Peripherally, homocysteine increased TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels in the heart and IL-6 levels in serum, but not altered the butyrylcholinesterase activity. Together, the results of this work show that homocysteine promotes central and peripheral oxidative and inflammatory state besides affecting the functionality of important brain enzymes. Whereas mild hyperhomocysteinemia is prevalent in the population and has been considered a risk factor for the development of brain and heart diseases, this experimental model may be useful for the investigation of patophysiology of diseases caused by homocysteine and prevention strategies.