Eimeria tenella est l’un des parasites apicomplexes à l’origine de la coccidiose aviaire, l’une des plus importantes maladies parasitaires de l’industrie avicole. Dans le but de caractériser les facteurs de pathogénicité d’E. tenella, nous nous sommes intéressés aux protéases et plus particulièrement aux aminopeptidases N. Nous avons caractérisé Et-ApN1 et identifié Et-ApN3, deux aminopeptidases d’E. tenella. Et-ApN1 présente de fortes homologies avec PfA-M1, l’homologue de Plasmodium falciparum, au niveau des séquences, des structures, des propriétés biochimiques, du clivage et de la localisation. L’ensemble des résultats suggèrent qu’Et-ApN1 est impliquée dans le développement parasitaire. Pour évaluer son rôle de cible thérapeutique potentielle, nous avons criblé une bibliothèque de molécules et identifié une nouvelle molécule le C36, qui inhibe directement l’activité d’Et-ApN1 et entraîne un arrêt du développement d’E. tenella in vitro. Cet effet inhibiteur est également observé chez Toxoplasma gondii et P. falciparum. Dans le but d’améliorer la solubilité du C36 pour de futures études in vivo, le C36 a été pharmaco-modulé. Les perspectives de ces travaux viseront à prouver l’implication directe des Et-ApN dans le développement d’E. tenella. / Eimeria tenella is an apicomplexan parasite causing avian coccidiosis, one of the most important parasitic diseases in world poultry industry. To identify E. tenella pathogenesis factors, we were interested in proteases and more specifically in aminopeptidases N. We characterized Et-ApN1 and identified Et-ApN3, two aminopeptidases of E. tenella. We revealed strong homologies in the sequences, structures, biochemical properties, cleavage patterns and localization between Et-ApN1 and PfA-M1, the homologue from Plasmodium falciparum. Taken together, our results suggest that, as PfA-M1, Et-ApN1 is involved in parasite development and could be considered as a therapeutic target. To confirm this hypothesis, we screened a small molecule library and identified the compound C36. This molecule not only inhibits Et-ApN1 but also the in vitro development of E. tenella. This inhibition of parasite development was also observed for Toxoplasma gondii and P. falciparum. In perspectives, a pharmaco-modulation approach will be performed to improve chemical properties of the compound C36. New molecules derived from C36 will then be tested in vivo. Future studies will aim to prove the direct implication of Et-ApN in E. tenella development.

Les parasites du genre Eimeria sont des parasites apicomplexes provoquant des maladies graves, appelées coccidioses. Ce genre compte sept espèces qui envahissent spécifiquement les cellules épithéliales des intestins de poulet. L’espèce de choix étudiée dans notre laboratoire est Eimeria tenella. La prophylaxie repose sur les vaccins qui sont onéreux et les traitements anticoccidiens, qui sont administrés dans l’alimentation dès l’éclosion du poussin. Depuis 50 ans, l’utilisation massive de ces molécules s’accompagne de l’émergence de populations parasitaires résistantes. Les modes d’action des cibles parasitaires des anticcocidiens étant peu connus, il est difficile de mettre en place une stratégie de contournement de la résistance. Dans l’optique de répondre aux besoins des éleveurs, une collaboration entre le laboratoire de chimie organique et celui de parasitologie a été mise en place en utilisant la capacité de composés chimiques à inhiber l’invasion ou le développement des parasites. Notre stratégie repose sur la syntèse, le développement ainsi que l’évaluation de l’efficacité des composés pouvant potentiellement être utilisés en tant qu’inhibiteurs de la coccidiose aviaire. Un criblage de composés nous a permis d’identifier deux composés « chefs de files », inhibant le processus d’invasion et de développement des parasites au sein de la cellule hôte. Les pharmacomodulations entreprises ont engendrés la découverte de composés plus actifs avec des valeurs d’IC50 égales à 0,8 et 3,4 µM respectivement. / Intracellular developing parasites that belong to the apicomplexan phylum represent a great threat to both animal and human being health. Apicomplexan contains a genus of parasites called Eimeria. This genus is composed of seven species which cause avian coccidiosis such as E. tenella, the most virulent agent. Control of E. tenella is presently accomplished by a prophylaxis that uses vaccines and anticoccidial drugs. However, the rapid emergence of drug resisitant parasites coupled with the expense of most vaccines has led us to a search of new approaches to control coccidiosis via the synthesis of new compounds. In order to achieve that goal, collaboration between two laboratories has been established. Our strategy relies on the laboratories scientific knowledge in two complementary domains such as oraganic chemistry and parasitology. Our research is based on the effectiveness that synthesized compounds could have to inhibit parasites first steps of infection of the host cells. The screening of compounds has led us to the discovery of two lead compound inhibiting the invasion and development process of the parasites. Undertaken pharmacomodulations of these leads have allowed us to lower these concentrations values to 0,8 and 3,4 µM

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_luciana_wendt.pdf: 2823644 bytes, checksum: cf4f4a14caafbe809001eb7426830a04 (MD5) Previous issue date: 2009-07-27 / The parasites of capybaras (Hydrochoerus hydrochaeris) in semi-intensive breeding were searched, and examined 39 capybaras (20 young and 19 adults) for ectoparasites, 34 capybaras (13 young and 21 adults) for gastrointestinal helminths. We estimated the parameters of parasitism: prevalence, abundance and mean intensity. Fifty two fecal samples were examined for identification of Eimeria spp. Ticks collected were Amblyomma dubitatum and immature of Amblyomma sp. Among the helminths, four species were identified in young capybaras, with the prevalence and intensity of infection: Capillaria hydrochoeri (46,15% and 11,5 specimens), Hydrochoerisnema anomalobursata (76,92% and 34,2 specimens), Protozoophaga obesa (46,15% and 6,33 specimens) and Monoecocestus hagmanni (23,07% and 1,66 specimens). In adults were found five species: C. hydrochoeri (66,66% and 16,42 specimens), H. anomalobursata (42,85% and 79,88 specimens), P. obesa (100% and 1655,42 specimens), M. hagmanni (14,28% and 38,33 specimens) and Monoecocestus macrobursatum (4,76% and two specimens). Reports of M. hagmanni and M. macrobursatum parasite capybaras in the state of Rio Grande do Sul are unpublished. P. obesa had significantly higher parameters in adult capybaras. In fecal samples, were identified: Eimeria trinidadensis (88,46%) with oocysts that measured 21,02μm (±1,03μm) length and 19,15 (±1,42μm) wide, and Eimeria ichiloensis (79,92%), with oocysts that measured 25,19μm (±1,77μm) length and 19,7μm (±1,3μm) wide. The diversity of founded parasites show the importance of control programs in semi-intensive breeding of capybaras. / A fauna parasitária de capivaras (Hydrochoerus hydrochaeris) em sistema de criação semi-intensivo no município de Capão do Leão, RS foi pesquisada. Foram examinadas 39 capivaras (20 filhotes e 19 adultas) para ectoparasitos, e 34 capivaras (13 filhotes e 21 adultas) para helmintos gastrintestinais, sendo estimados os parâmetros de parasitismo: prevalência, abundância e intensidade média. Também 52 amostras fecais foram analisadas para identificação de Eimeria spp. Observou-se adultos de Amblyomma dubitatum e imaturos de Amblyomma sp. Quatro espécies de helmintos foram identificadas nas capivaras filhotes, com a seguinte prevalência e intensidade de infecção: Capillaria hydrochoeri (46,15% e 11,5 espécimes), Hydrochoerisnema anomalobursata (76,92% e 34,2 espécimes), Protozoophaga obesa (46,15% e 6,33 espécimes), e Monoecocestus hagmanni (23,07% e 1,66 espécimes). Nas capivaras adultas houve cinco espécies: C. hydrochoeri (66,66% e 16,42 espécimes), H. anomalobursata (42,85% e 79,88 espécimes), P. obesa (100% e 1655,42 espécimes), M. hagmanni (14,28% e 38,33 espécimes) e Monoecocestus macrobursatum (4,76% e dois espécimes). Os relatos de M. hagmanni e de M. macrobursatum, parasitando capivaras no estado do Rio Grande do Sul são inéditos. P. obesa apresentou parâmetros significativamente superiores nas capivaras adultas. Nas amostras fecais identificou-se: Eimeria trinidadensis (88,46%) com oocistos subesféricos que mediram em média 21,02μm (±1,03μm) de comprimento e 19,15μm (±1,42μm) de largura, e Eimeria ichiloensis (79,92%), com oocistos que mediram em média 25,19μm (±1,77μm) de comprimento e 19,7μm (±1,3μm) de largura. A diversidade de parasitos encontrados evidencia a necessidade de medidas de controle em criações semi-intensivas de capivaras.

Eimeria tenella é umas das principais espécies que causam a coccidiose aviária. Para se estudar o perfil de expressão gênico quantitativo em estágios infectantes bibliotecas de LongSAGE foram geradas a partir de merozoítos e esporozoítos. Mais de 35.000 tags foram obtidas, das quais, 9.516 eram únicas. Para a identificação e anotação de genes diferencialmente expressos, as tags foram extraídas, contadas e analisadas estatisticamente por um pacote desenvolvido pelo nosso grupo, SAGE Analysis. Um total de 197 seqüências foram reconstruídas e anotadas automaticamente. Foi observado uma expressão estágio-específica e perfil transcricional distinto entre os estágios. Em merozoítos, foram encontradas proteínas envolvidas na tradução e manutenção da conformação protéica e em esporozoítos, os resultados positivos foram relacionados à cromatina, transporte e atividade catalítica. Para validação da técnica, a expressão diferencial de um pequeno conjunto de genes foi quantificada por RT-qPCR. Os resultados demonstraram uma boa correlação entre estas duas plataformas. / Eimeria tenella is one of the most important causing agents of poultry coccidiosis. To study the quantitative gene expression profile in zoite stages of LongSage libraries were generated from merozoites and sporozoites. More than 35.000 tags were obtained, whose 9.516 were unique. For identification and annotation of differential expressed genes, tags were extracted, counted and submitted to statistical analysis by Sage Analysis, software developed by our group. A total of 197 tags were reconstructed and automatic annotated. Stage-specific expression genes and distinct transcriptional profile were observed between these stages. In merozoites the results were related to protein translation and folding, and in sporozoites the proteins were involved to chromatin structure, transport and catalytic activity. To LongSAGE validation, differential expression was quantified using RT-qPCR to a small group of genes. Good correlation was observed between these platforms.

La coccidiosis es una enfermedad entérica de aves causada por protozoarios del genero Eimeria. A pesar del uso de los anticoccidiales, se ha comprobado que es imposible eliminar estos organismos de los galpones (Chapman, 1998), afectando mayormente la producción y teniendo como consecuencia una baja de peso e incremento de la conversión. Las drogas anticoccidiales usadas se dividen en dos grupos: a. Compuestos sintéticos conocidos como "coccidiostatos químicos" como nicarbacina, halofuginona y diclazuril, b. antibióticos ionòforos que son producidos por fermentación, que son más ampliamente utilizados en la avicultura. Algunas mezclas de drogas, de un compuesto sintético y un ionoforo (Ej. Maxiban que es una mezcla de narasina y nicarbacina)o dos drogas sintéticas (ej. Lerbek una mezcla de metil benzocuato de clopidol) también son usados. En la industria avícola usualmente se administra al ave varios tipos de raciones, se empieza con un iniciador (suministrado durante dos a tres semanas de vida) seguido de una ración de engorde (desde la tercera hasta la sexta semana de vida). La importancia de incorporar una droga efectiva tanto al iniciador como al engorde es para reducir las infecciones y proteger a las aves de coccidiosis clínica (Chapman, 1998). La aparición de cepas multirresistentes ha repercutido negativamente en el control de la coccidiosis y se genera por el uso continuo de estos productos preventivos en la ración. Por otro lado, las cepas presentes en el medio ambiente, por la acción parcial del coccidiostato del programa anticoccidial y por la ausencia de una desinfección especifica. aumenta la presión de infección inicial de los galpones generando la aparición de cepas resistentes. Por tanto la disminución de la contaminación ambiental por ooquistes sería de gran importancia para el éxito de un programa de control de la coccidiosis en planteles avícolas disminuyendo la presión de infección inicial y prolongando la eficiencia de los programas anticoccidianos (Di Fabio, 1994).En el campo se observa que el programa más efectivo depende de la sensibilidad de las cepas locales de Eimeria a las drogas en cuestión. Los coccidiostatos han tenido gran éxito y realmente han permitido que la industria avícola tenga un crecimiento constante, sin embargo se han observado cepas resistentes de coccidias; por lo cual se sigue investigando otros métodos para controlar la coccidosis (Allen y Augustine 1996). Una de las características más importantes de las cepas eimerias es la capacidad de producir una respuesta inmune en el pollo y después de una exposición repetida a ooquistes infectivos, las aves adquieren inmunidad y protección contra reinfecciones posteriores. Algunas especies (E. acervulina y E. máxima) son más inmunogenicas que otras (E. tenella y E. necatrix). El desarrollo de la inmunidad dependerá de varios factores; siendo el más importante la frecuencia de la magnitud de la exposición a los parásitos (Chapman, 1998). Muchas drogas anticoccidiales han sido suspendidas porque no eran efectivas o carecían de la eficacia adecuada contra algunas especies de eimeria. En otros casos las drogas eran retiradas por la posible transmisión de resistencia antibacterial (sulfonamidas). La razón más importante de las fallas de los anticoccidiales, ha sido el desarrollo de la resistencia de la droga. La medicación preventiva asegura que algunos parásitos escapen a los efectos de la medicación. Esto resulta en una selección continua de parásitos que son capaces de sobrevivir a Concentraciones letales de drogas y llevar al desarrollo de poblaciones de organismo resistente. (Chapman, 1998) El manejo de la resistencia requiere información sobre la sensibilidad de la coccidia al rango de drogas, incluyendo las de uso actual. Esto se puede obtener por medio de estudios de sensibilidad con parásitos obtenidos de las granjas afectadas donde las drogas han sido utilizadas durante largo tiempo. Los resultados de las cepas obtenidas de una o dos granjas pueden aplicarse a todo el complejo de pollos; sin embargo si las drogas han sido utilizadas con poca frecuencia, se deben de examinar cepas de por lo menos cinco granjas. Estos estudios son tediosos y caros, y generalmente se hace necesario cambiar de droga en el campo antes de que los resultados sean disponibles (McCarter 1999). Debido que el desarrollo de la inmunidad contribuye a la eficacia de los programas tradicionales se puede debatir el efecto de la vacunación (utilizando organismo vivos, virulentos o atenuados) como importante en el control de la coccidiosis. (Danford y Ruff 1999) La vacunación contra coccidiosis no es un concepto nuevo, pero métodos nuevos de administración y la tendencia de criar una ave más grande, la han convertido en un medio practico, confiable y económico de prevención de la coccidiosis (McCarthy1999). La vacunación introduce oocistos de las diferentes especies a las aves y a través de ciclos repetidos del organismo, se desarrolla la inmunidad, que se incrementa a través del tiempo. El impacto de la vacunación en el desarrollo del ave es ligeramente negativo 2-3 semanas más tarde, cuando él número de parásitos llega al máximo. Los efectos productivos entonces se recuperan cuando él número de occistos declina(Bafundo, 1996). La búsqueda de nuevos productos, hace que las empresas gasten enormes cantidades de dinero en desarrollar nuevas drogas anticoccidiales las cuales demoran entre 15 a 20 años en producirse y a la vez muy rápidamente se produce la resistencia. Las demandas crecientes para criar aves con dietas libres de drogas está promoviendo la investigación de nuevas alternativas de prevención que eviten el uso de productos químicos. El objetivo del presente estudio es evaluar la eficacia productiva de un programa anticoccidial usando una vacuna que contiene cepas no atenuadas de eimerias, sobre el peso, índice de conversión y uniformidad del lote.

Se analizaron 478 muestras fecales de crías aparentemente saludables de 1-90 días de edad colectadas por 3 semanas durante la época de parición del 2008 en la Estación experimental de La Raya, Puno. Las muestras se procesaron mediante la técnica de Sedimentación y Flotación en solución saturada de azúcar para hallar la presencia de ooquistes y el método de Mc Master en solución saturada de azúcar para determinar la carga parasitaria. El 87.45% de las muestras estuvieron infectadas por varias especies de Eimeria spp. con medianas de ooquistes por gramo de heces (OPG) de 4500 y rangos de 50-1 202 400 OPG y preferentemente por las especies de E. lamae (60.4%) y E. macusaniensis (50%) y en menores tasas por E.ivitaensis (5.4%). El 50% de 24 muestras de crías menores a 30 días de edad estuvieron infectadas (Mediana 3825 OPGH) y progresivamente el 93% de 82 muestras de las edades entre 31-45 (Mediana 8700 OPGH), 85% de 144 en las edades de 46-60 (Mediana 5900 OPG), 94% de 183 muestras de 61-75 días (Mediana 3750 OPG) y el 80% de 45 muestras de 76-90 (Mediana 1750 OPG). Las infecciones por E. lamae se detecta muy tempranamente (42% en crías menores a 30 días) y en altas tasas en el resto de las crías pero con un pico en los animales de 46-60 días (67%). La E. macusaniensis se observa en el 4.2% en crías de menores a 30 días, pero con picos de infección en edades de 61-75 días (71%) y en tasas menores en el resto de los grupos etarios. En 118 muestras (24.7%) analizadas se detectaron co-infecciones duales preferentemente asociaciones de E. lamae y E. alpacae (11%) seguida de E. lamae y E. macusaniensis (8.4%)] y triples 10.8% (mayoritariamente E. lamae, E. alpacae y E. macusaniensis) y aún presencia de hasta 4 distintas especies con predominancia de E. lamae, alpacae, E. punoensis y E. macusaniensis (9.8%). El análisis de regresión logística multivariada mostró el estrato de 61 a 75 días de edad influye 12.8 veces más, para la presencia de eimerias en heces de crías ajustado al resto de variables (OR:12.8, IC 95% 4.5 – 36.1; p< 0.05). Palabras claves: Eimeriosis, crías, alpacas, co-infecciones, E. lamae, E. macusaniensis, Factpr de Riesgo, Puno, Perú. / --- A total of 478 fecal samples taken from healthy alpaca crias aged 1-90 days at Centro de Investigación y Producción (CIP - La Raya), Universidad Nacional del Altiplano, Puno, were processed by the sedimentation and flotation technique in saturated sugar solution to detect oocysts and by the McMaster method to determine oocysts per gram (OPG) of fecal sample. Eimeria spp were present in 418 (87.5%) of the samples with a median of 4500 OPGH (CI of 7,534 and range 50-1,202,400). The most frequent species were E. lamae (60.4%), E. macusaniensis (50.4%), E. alpacae (45.6%), E. punoensis (30%), and E. ivitaensis (6.24%). Parasite load increased with age, 50% of 24 samples at 1-30 days were positive with an average load of 3825 OPG, at 31-45 days 93% of 82 (median of 8700 OPGH), at 46-60 days 85% of 144 (median of 5900 OPG), at 61-75 days 94% of 183 (median of 3750 OPG) and at 76-90 days 80% of 45 with 1750 OPG. E. lamae comprised 41% of all coccidian oocysts at 1-30 days and the highest rate of infection (67%) was reached at 46-60 days, whereas E. macusaniensis was present in only 4.2% of crias at 1-30 days, but peaked (71%) at 61-75 days. Double, triple, and quadruple infections were found in 28.2, 28.2, and 11.2% of positive samples respectively. The coexistence of E. lamae with E. alpacae and, E. lamae with E. macusaniensi infection were common in double infections, whereas E. lamae, E. alpacae and E. macusaniensis were mainly found in triple infections, and E. lamae, E. alpacae, E. punoensis and E. macusaniensis in quadruple infections. The multivariate logistic regression analysis showed in alpaca crias aged 61-75 days represent a risk factor for Eimeria spp, infection (OR:12.8, IC 95% 4.5 – 36.1; p< 0.05). Palabras llave: eimeriosis; crias; alpacas; eimeria co-infections; E. lamae; E. macusaniensis; risk factor.

Cecal coccidiosis, caused by the protozoan Eimeria tenella, may manifest as a devastating disease in young chickens and result in substantial economic loss for producers. The parasite progresses through a complex life cycle, exhibiting both asexual and sexual (gamont) stages of development. The purpose of this study was to produce a panel of monoclonal antibodies (MoAbs) against epitopes contained on surface antigens (Ags) of the gamonts of E. tenella with the intent of blocking the fertilization process. Gamonts were harvested from infected ceca, partially purified by differential centrifugation throught a discontinuous 5050% Percoll density gradient and used as a source of Ag for the production of MoAbs. Immune spleen cells collected from Robertsonian (strain RBF/Dn) mice were fused with FOX-NY myeloma cells and the resultant MoAb-secreting hybridomas screened by an indirect immunofluorescent antibody test (IFAT). A panel of 13 MoAbs (1 IgG2a and 12 IgG1) was selected form a bank of 94 hybridomas. The Ag specificity of the MoAbs was determined by processing infected cecal mucosa smears and noninfected and infected cecal cross sections through the IFAT procedures. It is likely that the panel of 13 MoAbs exhibits specificity for Ags on or in the macrogamonts of E. tenella. Specificity may not be restricted to macrogamonts, however, since common epitopes make exist between microgamonts and microgamonts. In vitro studies were begun to determine the ability of the MoAbs to inhibit gamont fertilization. Merozoites were inoculated into a monolayer of chick kidney cells, and in vitro development of the parasite was monitored. Data were insufficient for statistical analysis, since the merozoites did not develop to the oocyst stage.

The objective of this investigation was to evaluate the effects of administering CpG-ODN to commercial strain chickens as a potential adjuvant to vaccination against Salmonella, Eimeria spp., and Newcastle disease virus, or immunization to bovine serum albumin (BSA). During Experiment 1, which evaluated the dual application of CpG-ODN and a Newcastle disease virus vaccine, in the first of three replicate trials, on day 28 of the experiment, animals in the Vaccine + CpG 1& 14 experimental group were observed to have the highest levels of (p<0.05) anti-NDV IgG in serum. These levels were elevated above levels in animals from all other experimental groups. This suggestion for an adjuvant effect associated with CpG-ODN administration was not supported in the remaining two trials of experiment 1. Experiment 2 evaluated the potential for CpG-ODN to adjuvant a commercial live oocyst coccidial vaccine when applied by an oral route to neonatal broiler chickens. Overall, when body weight gain during challenge, development of intestinal lesions, and anti-Eimeria IgG levels were evaluated, vaccine administration alone was demonstrated to provide the best measure of protection among animals in all experimental groups, including those receiving either CpG-ODN or Non CpG-ODN. Experiment 3 investigated the simultaneous administration of CpG-ODN or Non-CpG ODN and a commercially acquired Salmonella typhimurium vaccine to SCWL chickens. Similar to experiments 1 and 2, antigen specific IgG responses in serum and indices of protection against field strain Salmonella challenge were variable and inconsistent. Anti-BSA IgG levels were compared in broiler and SCWL chickens immunized against BSA by a drinking water route of administration alone, or in combination with two different concentrations of CpG-ODN or Non CpG-ODN in experiment 4. The only observation where CpG-ODN and BSA co-administration resulted in anti-BSA IgG levels that were elevated above BSA alone immunized chickens was measured in broilers at day 19 post-final immunization. Taken together, given the variable results reported in this investigation related to the co-administration of ODN and vaccine or protein antigen, these data are largely inconclusive for suggesting that CpG-ODN can effectively adjuvant humoral immune responses in commercial strain chickens.

Ziel dieser epidemiologischen Studie war es, das Vorkommen und das Artenspektrum von Eimeria spp. sowie den Infektionsverlauf in zwei konventionell geführten landwirtschaftlichen Betrieben in Schleswig-Holstein unter Feldbedingungen zu untersuchen und eine Behandlungsstrategie abzuleiten.

The endogenous development of the rabbit coccidium Eimeria exigua was studied by light and electron microscopy in coccidia-free rabbits.