O presente estudo científico tem como objetivo descrever o desenvolvimento dos Sistemas Renais bovinos, durante o período embrionário. Para tanto, foram utilizados embriões coletados em frigoríficos da região, e após a coleta os mesmos foram fotografados e medidos utilizando-se o método Crow-Rump (CR). Para descrição morfológica foram colocados em solução de Bouin para microscopia de luz e em solução de Glutaraldeído 2,5% para microscopia eletrônica de transmissão. Nos embriões com idade gestacional aproximada de 14 a 15 dias, não observamos a presença do pronefro, entretanto encontramos o mesonefro e indícios morfológicos que indicam sua atividade funcional. O mesonefro apresenta no interior de suas células tubulares inúmeras mitocôndrias e interdigitações, indicando uma alta atividade de transporte iônico. Observamos que o metanefro, ou rim definitivo, inicia seu desenvolvimento em embriões apresentando idade gestacional aproximada de 23 e 24 dias. Nossos achados mostram que a involução do mesonefro acontece simultaneamente com a diferenciação metanefrogênica. Em idade gestacional entre 45 e 46 dias, já iniciando sua fase fetal, o metanefro possui as unidades filtradoras (néfrons), com seus respectivos glomérulos, túbulos contorcidos proximais e distais e alça de Henle. / The present scientific study it has as objective to describe the development of the bovine Renais Systems, during the embryonic period. For in such a way, embryos collected in freezers of the region had been used, and after the collection the same ones had been photographed and measured using the Crow-Rump method (CR). For morphologic description they had been placed in solution of Bouin for light microscopy and in solution of Glutaraldeide 2.5% for electronic microscopy of transmission. In the embryos with approached gestational age of 14 the 15 days, we do not observe the presence of pronephro, however we found mesonephro and morphologic indications that shows functional activity. Mesonephro presents in the interior of its tubular cells innumerable mitochondria and interdigitações, indicating one high activity of ionic transport. We observe that metanephro, or definitive kidney, initiates its development in embryos presenting approached gestational age of 23 and 24 days. Our findings show that the involution of mesonephro happens simultaneously with the metanephrogenic differentiation. In gestational age between 45 and 46 days, already initiating its fetal phase, metanephro possess the filter units (nephrons), with its respective glomeruli, proximal and distal twisted tubules and handle of Henle.

Apesar do grande desenvolvimento das biotecnologias da reprodução animal, como a produção in vitro de embriões (PIV), o diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) ainda é aplicado com restrição na rotina da transferência de embriões em animais. Os recentes avanços da genômica têm permitido associar características fenotípicas com informações moleculares, possibilitando a realização da seleção assistida por marcadores moleculares. O objetivo do presente estudo foi de realizar o PGD de embriões bovinos em plataforma de alta densidade de SNP (BeadChip/6.909 SNP). A pequena quantidade de DNA genômico (gDNA) obtida na biópsia embrionária é a principal limitação para a análise de grande número de SNP. Dessa forma, a metodologia de amplificação total do genoma (WGA) (Repli-g Mini Kit, Qiagen, Hilden, Alemanha) foi utilizada para aumentar a quantidade de gDNA da biópsia e permitir a análise de milhares de SNP simultaneamente. Foram utilizados 88 embriões bovinos PIV, submetidos à micromanipulação pela técnica de microaspiração, possibilitando a formação de 3 grupos com diferentes números de células biopsiadas: G1) 5-10 (n=28); G2) 10-20 (n=37); G3) >100 - blastocisto eclodido (n=23). Todas as amostras foram submetidas ao mesmo protocolo de WGA e 4&micro;L de cada amostra foram utilizados para a genotipagem em plataforma iScan/Illumina. A qualidade dos genótipos foi avaliada pela análise do Call Rate (CR), 10o percentil do GCScore (GC10), Alelle Drop In (ADI) e Alelle Drop Out (ADO). O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para investigar diferenças na distribuição das variáveis entre os grupos. O coeficiente de correlação de postos de Spearman revelou correlação significativa entre todas as variáveis. Os resultados apresentaram correlação positiva entre o CR e GC10 (0,99/P<0,001), enquanto as taxas de ADI e ADO apresentaram correlação negativa com o CR e CG10 (ADI/CR: - 0,87; ADI/GC10:-0,88; ADO/CR:-0,87; ADO/GC10:-0,86), com P<0,001 para todas as variáveis. O teste de Kruskal-Wallis apontou para diferença significativa em todas as variáveis analisadas (CR, GC10, ADI e ADO) entre os 3 grupos de biópsias (G1, G2 e G3). O CR médio foi de 59,26%, 78,47% e 95,97%, para G1, G2 e G3, respectivamente. Foi desenvolvido programa computacional (mendelFix) baseado na Lei da Segregação, para inferência dos genótipos não determinados baseado no genótipo do progenitores, aumentando o CR dos grupos 1, 2 e 3 para 79,69%, 88,20% e 97,28%, respectivamente. Os resultados do presente estudo permitem concluir que é possível realizar a genotipagem de embriões bovinos em plataforma de alta densidade de SNP com amostras submetidas ao protocolo WGA/MDA, mas o número de células obtidas na biópsia embrionária afeta a qualidade da genotipagem. A associação das biotecnologias descritas no presente trabalho permite a aplicação da seleção assistida por marcadores moleculares em embriões bovinos, contribuindo para acelerar ainda mais o processo de melhoramento genético animal. / Despite the great development of animal reproduction biotechnology, such as embryo in vitro production (IVP), preimplantation genetic diagnosis (PGD) is still applied with restraint in animals embryo transfer. Recent advances in genomics have associated phenotypic characteristics with molecular information, allowing the development of marker assisted selection. The aim of this study was to perform PGD in bovine embryos using high-throughput SNP platform (BeadChip/6,909 SNP). The small amount of genomic DNA (gDNA) obtained from embryo biopsy is the main limitation for the high-density SNP analysis. Thus, the Whole Genome Amplification (WGA) (Repli-g Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany) was used to increase the amount of gDNA from embryo biopsy and allow the analysis of thousands SNP simultaneously. Eighty-eight IVP bovine embryos were subjected to micromanipulation by microaspiration, allowing the formation of three groups with different numbers of biopsied cells: G1) 5-10 (n=28); G2) 10-20 (n=37); G3) > 100 - hatched blastocyst (n = 23). All samples were subjected to the same WGA protocol, and 4&micro;L of each sample were used for genotyping on iScan/Illumina platform. The genotyping quality was assessed using the Call Rate (CR), 10th percentile GCScore (GC10), Alelle Drop In (ADI) and Alelle Drop Out (ADO). Kruskal-Wallis test was applied to investigate differences in the distribution of variables among groups. Spearman`s rank correlation coefficient revealed a significant correlation between all variables. The results showed a positive correlation between CR and GC10 (0.99/P <0.001), while ADI and ADO rates were negatively correlated with CR and CG10 (ADI/CR: -0.87; ADI/GC10: - 0.88; ADO/CR: -0.87; ADO/GC10: -0.86), P<0.001 for all variables. Kruskal Wallis pointed to significant differences in all variables (CR, GC10, ADO and ADI) among the 3 groups of biopsies (G1, G2 and G3). The CR average was 59.26%, 78.47% and 95.97% for G1, G2 and G3, respectively. Was developed a script (mendellFix) based on the \"Law of Segregation\", for inference of not determined genotypes based on the parents genotypes, thus increasing the CR of group 1, 2 and 3 to 79.69%, 88.20% and 97 28%, respectively. The results of this study show that it is possible to perform the genotyping of bovine embryos in highthroughput SNP platform with samples subjected to WGA/MDA protocol, but the number of cells obtained by embryo biopsy affects the quality of genotyping. The association of biotechnologies described in this work allows the application of marker-assisted selection in bovine embryo, contributing to further accelerate the process of animal breeding.

Os objetivos desse trabalho foram avaliar in vitro a sensibilidade de zigotos murinos à Brucella abortus, assim como a eficácia das lavagens seqüenciais e do tratamento com tripsina, padronizados pela International Embryo Transfer Society, na sua remoção e/ou inativação, a fim de estabelecer um modelo acessível para o estudo de interações embriões-patógenos. Para a coleta dos zigotos, foram utilizados camundongos fêmeas (Swiss Webster), púberes, nulíparas, 6-8 semanas de idade, acasaladas com machos inteiros da mesma linhagem, após superestimulação ovariana. Para a infecção foi utilizada a bactéria B.abortus 1119.3. A suspensão de bactérias foi preparada no momento da inoculação, na diluição de 106 bactérias/ml. Os zigotos obtidos foram separados em controle e infectados. A infecção dos zigotos foi feita com 30&micro;l da suspensão de bactérias, e após 24h e 96h foram analisados quanto à morfologia e taxa de clivagem. Os procedimentos de lavagem seqüencial e tratamento com tripsina foram realizados após 24h. Para detecção da bactéria após os procedimentos de lavagem, as amostras foram inoculadas em cultura de bactérias e submetidas ao teste de reação em cadeia pela polimerase (PCR). Uma amostra da última gota de lavagem de cada grupo também foi testada. Para analise estatística dos resultados foi utilizado o teste do &chi;2. No grupo controle não foram verificadas alterações morfológicas, já no infectado foi possível verificar a presença de blastômeros irregulares, falha de divisão, citoplasma com granulação e aspecto degenerativo. As taxas de clivagem obtidas foram de 77,4% (controle) e 59,2% (infectados) (&chi;2 de 0,001674; p<0,05) após 24h e após 96h de infecção 14,5% (controle) e 7% (infectados) (&chi;2 de 0,141616; p<0,05). Não foi possível isolar B.abortus em cultura após os procedimentos de lavagem para ambos os grupos. As amostras do grupo controle apresentaram-se negativas na PCR. Já no grupo infectado foram obtidos resultados positivos e negativos, para os embriões e para a alíquota da última gota de lavagem dos grupos tratados com a lavagem seqüencial. Foi verificada apenas em uma amostra a presença de embriões positivos para a B.abortus com amostra da última gota de lavagem negativa. Para outras duas amostras os embriões apresentaram-se livres de B.abortus, mas foram detectadas na alíquota da última gota de lavagem. Apenas em uma amostra foram obtidos resultados negativos tanto para os embriões, quanto para o meio de lavagem. Os resultados da PCR para os grupos infectados tratados com tripsina foram positivos para praticamente todas as amostras, contendo embriões ou apenas da alíquota da última gota de lavagem, com exceção dos embriões de uma amostra que apresentaram-se negativos. As novas tecnologias desenvolvidas em reprodução animal promovem manipulação invasiva do embrião. Portanto, tratamentos preconizados para a remoção de patógenos podem não ser eficazes. O risco a ser considerado é da presença de patógenos associados à zona pelúcida ou nas proximidades, que possam ser introduzidos, ou ter sua entrada facilitada no embrião. Considerando os dados apresentados, torna-se clara a importância do desenvolvimento de um modelo animal para estudos de interações embriões- patógenos, a fim de se evitar a transmissão e disseminação de doenças. / The aim of this study was evaluate in vitro mouse zygotes sensitivity to Brucella abortus, such as the embryo washing procedure and trypsin treatment, recommended by the International Embryo Transfer Society, efficacy in its removal and/or inactivation, with the purpose of established an accessible model for embryo- pathogen interaction studies. The female mice (Balb C) aging 6 to 8 weeks were superovulated and matted with fertile males of the same strain, then the zygote retrieval was performed. The bacterial suspension was prepared in the moment of inoculation and the dilution was 106 brucellas/ml. The zygotes were divided in control and infected groups (30&micro;l of the bacterial suspension); after 24h and 96h their morphology and viability were analised. The zygotes of each group were washed sequentially or treated with trypsin after 24h exposition. To verify the presence of B. abortus pos-washing the zygotes and a sample of the last wash drop of each group were tested on bacterial culture system and polimerase chain reaction (PCR). The statistical analyses was performed with the &chi;2 test. Morphological changes were not observed at the control group, but the infected one presented irregular blastomeres, clivage defective, granular cytoplasm with degenerative like morphology. The clivage rates were 77,4% (control) and 59,2% (infected) (&chi;2 de 0,001674; p<0,05) after 24h and after 96h 14,5% (control) e 7% (infected) (&chi;2 de 0,141616; p<0,05). Our results showed that the bacterial culture presented negative growing for all groups tested. The control group presented only negative results on PCR analyses. The infected group presented positive and negative results on PCR, for embryos or last wash drop sample, submitted to the sequential washing procedure. Positive embryos were found in just one sample with the last wash drop negative. To two other samples embryos presented negative PCR results but positive at the last wash drop. Negative results for embryos and last wash drop was found in just one sample. The PCR results for the groups treated with trypsin were almost all positives, for embryos or last wash drop samples, except one embryo sample that presented negative. The recent developed reproductive technologies promote excessive manipulation of the embryo. Therefore, preexistent procedures for microorganisms\' removal could not be efficient. The preeminent risk to be considered here is the potential or probability of the presence of pathogens associated with or in proximity to the zona pelúcida, which could be introduced, or facilitated its entrance on embryo. According to the data presented become clear the importance of develop a model for studies of embryo- pathogen interactions, with the aim of avoid disease transmission.

Os objetivos deste trabalho foram verificar a relação existente entre a morfologia interna de sementes de tomate e de berinjela e a germinação e verificar a possibilidade de utilização do sistema computadorizado de análise de imagens de plântulas SVIS (Seed Vigour Image System) para detectar diferenças de vigor entre lotes de sementes de tomate e de berinjela em comparação as informações fornecidas por testes de vigor tradicionalmente utilizados. A primeira etapa da pesquisa foi o estudo da morfologia interna de sementes, que foi realizado com sementes de tomate dos cultivares Santa Clara e Mariana, representadas por 10 lotes cada, e sementes de berinjela, cultivar Embu, também representada por 10 lotes, as quais foram avaliadas por meio do teste de raios X e após submetidas ao teste de germinação, com avaliação aos 5 e 7 dias (tomate e berinjela, respectivamente) após a instalação do teste. As imagens das sementes foram analisadas com o software Image Pro Plus® e o espaço livre entre o embrião e o endosperma de cada semente foi mensurado, calculando-se, por diferença, o espaço da cavidade interna das sementes preenchido pelo embrião e endosperma; com base nestes dados e na análise visual das sementes, foi realizada a classificação das sementes em categorias e estes resultados foram confrontados com os dados de germinação. Na segunda etapa do trabalho dez lotes de sementes de tomate dos cultivares Santa Clara e Mariana e dez lotes de sementes de berinjela cultivar Embu foram armazenados por 12 meses em sala com ambiente controlado a 20±1°C e 45-50% de umidade relativa do ar. O teor de água das sementes foi monitorado e o potencial fisiológico avaliado aos 0, 3, 6, 9 e 12 meses após o armazenamento, com os testes de germinação, primeira contagem de germinação, envelhecimento acelerado (tradicional e com solução salina saturada), condutividade elétrica, emergência de plântulas e o sistema de análise computadorizada de plântulas SVIS (comprimento de plântulas, índices de vigor, de crescimento e de uniformidade de crescimento). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com 4 repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e comparação de médias por meio do teste de Tukey a 5% de probabilidade. Concluiu-se que a análise de raios X permite a visualização clara das partes componentes das sementes de tomate e de berinjela e, assim, possibilita o estudo da relação entre a morfologia interna das sementes e a germinação; para sementes de tomate e de berinjela a presença de maior área livre na cavidade interna das sementes não significa necessariamente redução na capacidade germinativa; a presença de danos nas sementes pode afetar a germinação, dependendo da extensão destes e de sua localização; a análise computadorizada de plântulas com o software SVIS® é eficiente para avaliar o potencial fisiológico de sementes de tomate e de berinjela; a coerência de seus resultados com as informações fornecidas por meio dos testes de vigor tradicionalmente utilizados depende do índice utilizado; de maneira geral, os índices de vigor e de crescimento de plântulas e o comprimento de plântulas são mais eficientes para avaliação do potencial fisiológico de sementes de tomate. Para sementes de berinjela, todos os índices obtidos na análise via SVIS são eficientes para separar os lotes em níveis de vigor de forma similar às avaliações rotineiramente utilizadas para essa finalidade. / The aim of this work was study the relationship between eggplant and tomato seed morphology and seed germination and verify the possibility of computerized seedling image system (SVIS) detect vigour differences between tomato and eggplant seed lots compared to traditional vigour tests. Tomato seeds cultivars Santa Clara and Mariana, represented by 10 lots each one, and eggplant seeds cultivar Embu, also represented by 10 lots, were used in this work. In the first study seeds were evaluated by X ray image analysis and germination standard test. Seed image analysis was performed by Image Pro Plus® software and whole seed area and free spaces between embryo and endosperm were measured. Seed internal area filled by embryo and endosperm was calculated by difference between whole seed area and free space areas. Based in these results and visual seed analysis, seeds were classify in to three categories, in each one germination information were studied. In the second experiment tomato and eggplant seeds were stored for 12 months in a room with controlled environmental conditions at 20±1 °C and 45-50% RH. Seed moisture content was verified and seed physiological potential evaluated at 0, 3, 6, 9 and 12 months after storage, by germination test, first count of germination, accelerated aging (traditional and with saturated salt solution), electrical conductivity, seedling emergence, and with SVIS system (seedling length, vigour index, growth index and uniformity of growth index). A randomized complete design was used with 4 replications. Data were submitted to Tukey test at 5% of probability. In the first experiment was possible verify that X ray image analyzis allows a perfect view of internal seed parts and seed morphology studies. Increase on seed areas filled by endosperm and embryo do not improve seed germination. Seed damages could affect germination, but it depends of damage extension and localization. Seedling image analysis by SVIS was efficient to evaluate tomato and eggplant seed physiological potential; coincidence on SVIS results and traditional vigour tests results is dependent of each index is used; in general, vigour index, growth index and seedling length are more efficient to evaluate tomato seed vigour; for eggplant seeds all SVIS indexes are efficient to classify seed lots by vigour as traditional tests.

O período embrionário apresenta maior susceptibilidade a teratógenos, sendo a fase que as primitivas camadas germinativas e rudimento dos órgãos são formados. Cada órgão tem uma fase crítica de desenvolvimento e os processos bioquímicos envolvidos no crescimento e diferenciação tem uma seqüência ordenada, controlada por vários genes. A ossificação endocondral tem inicio sobre um molde de cartilagem hialina, com formato semelhante ao osso que irá se originar, sendo o principal responsável pela formação dos ossos curtos e longos. Assim, julgamos ser de grande valia um estudo embasado no desenvolvimento normal dos membros de embriões e fetos bovinos provenientes de vacas criadas em ambiente natural, através de estudos em microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. No processo de formação, desenvolvimento e ossificação dos membros observamos a formação de tecido mesenquimal condensado em embriões por volta da quarta semana gestacional, passando pelo processo de diferenciação em células cartilaginosas. Ao redor da sétima semana gestacional inicia-se o processo de calcificação da cartilagem com depósitos de cálcio e fósforo para formação de tecido ósseo, seguido de morte dos condrócitos. / The embryonary period presents a bigger susceptibility to theratogens, being the phase in which the primitive germinative layers and rudiment of organs are been formed. Each organ has a critical phase of development and the biochemical processes involved in growing and differentiation have an ordered sequence, controlled by several genes. The endochondrial ossification has begun over a hyaline cartilage mould, having a shape similar to the bone that will be grow, being the principal responsible for the short and long bones formation. Thus, we think it is much valid a study based on normal development of bovine embryos and fetuses\' limbs coming from cows bred in a natural environment, through studies in light microscopy and transmission electronic microscopy. In the process of formation, development and ossification of limbs, we saw condensed mesenchymal tissue formation in the embryos at around the gestational fourth week, passing through differentiation process in cartilaginous cells. At around the gestational seventh week, it has begun the calcification process of cartilage with calcium and phosphorous deposits to the bone tissue formation, followed by chondrocites death.

O objetivo deste trabalho foi buscar genes MHC classe I em bovinos expressos durante o desenvolvimento embrionário e gestação que apresentassem similaridade ao gene Ped murino. Para tanto, embriões de PIV e placentas de fetos produzidos por monta natural ou clonados tiveram seu RNA extraído. A partir do RNA extraído foi realizada a produção de cDNA para tentar o isolamento de fragmentos com similaridade ao gene descrito em murinos. Uma vez isolados, os fragmentos foram purificados ou clonados em plasmídeo. As amostras foram seqüenciadas e as seqüências obtidas foram avaliadas, editadas e comparadas a outras seqüências pelo programa BLAST. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada em embriões (D7) e nas amostras de placenta utilizando anticorpo monoclonal de camundongo anti-Qa-2 marcado com FITC. A seqüência consenso obtida produziu alinhamentos significantes com os genes do complexo Bola que faz parte do MHC classe I bovino. O alinhamento entre a seqüência consenso e as seqüências de Q7 (Ped) e HLA-G publicados anteriormente demonstrou poucas variações de nucleotídeos entre as seqüências. As amplificações de cDNA de embriões que atingiram o quarto ciclo celular em até 48 hpi (R8) e em 48-90 hpi (L8) e de embriões que atingiram o estádio de blastocisto expandido em 7 dias de cultivo (RR) e em 9 dias de cultivo (RL) mostraram que o fragmento cuja seqüência apresenta alta similaridade ao gene Ped, está presente em embriões RR e RL, mas não em embriões no estádio de 8 células. Em placentas, o resultado da PCR mostrou a amplificação de oito fragmentos em diferentes fases da gestação. O sequenciamento dos fragmentos gerou nove seqüências consenso similares ao gene Ped e também a seqüências obtidas a partir de embriões bovinos. O alinhamento das seqüências mostrou a existência de duas isoformas contendo edição alternativa no exon 2 ou no exon 3. O resultado indicou a existência de polimorfismo ou mais de um gene com alta similaridade ao gene Q7 sendo transcritos durante o período gestacional. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada na membrana de células do trofoblasto e da MCI de embriões e na porção materno fetal de placentas, com uma maior expressão na porção fetal. Placentas oriundas de fetos clonados apresentam maior fluorescência comparada àquelas oriundas de monta natural. Este trabalho identificou, em embriões bovinos, um possível gene homólogo ao Ped murino e a expressão de proteína semelhante àquela codificada por este gene e conclui que existem vários transcritos com similaridade ao gene Q7 sendo expressos na região materno-fetal da placenta, durante a gestação em bovinos, assim como nos embriões / The aim of the present work was to identify bovine MHC class I genes similar to the murine Ped gene expressing during embryonic development and pregnancy. Bovine in vitro produced embryos and placentas obtained from natural mating or cloning-derived fetuses had their RNA extracted. cDNA was synthesized to isolate fragments showing similarity with the gene described in mice. Once isolated the fragments were purified or cloned into plasmids. The samples were sequenced and obtained sequences edited and compared to other sequences by means of the BLAST software. The expression of MHC-Ib protein was evaluated in embryos (D7) and in placentas using a FITC conjugated mouse monoclonal antibody anti-Qa-2. The consensus sequence amplified from blastocyst cDNA produced significant alignments with genes of the Bola complex, which is part of the bovine MHC class I. The alignment between the consensus sequence and the previously published Q7 and HLA-G sequences demonstrated little nucleotide variations among the sequences. The cDNA amplifications of embryos at the fourth cellular cicle in 48hpi (F8); 48-90hpi (S8) and embryos that reached blastocyst expanded stage in 7 days (FF); in 9 days (FS) showed that the Ped candidate gene is present in FF and FS but not in 8-cell embryos. In placentas, the PCR resulted in amplification of eight fragments at different pregnancy stages. Sequencing of the fragments generated nine consensus sequences, similar to the Ped gene and also to sequences obtained from bovine embryos. The alignment of the sequences showed the existence of two isoforms containing an alternative splicing on exon 2 or 3. This result indicates the existence of polymorphisms or that more than one gene with high similarity to the Q7 gene are transcribed during pregnancy. Expression of MHC-Ib protein was verified in trophoblast membrane and embryos inner cell mass cells and in the maternal-fetal portion in placentas, with a greater expression in the fetal portion. Cloned fetuses placentas presented grater fluorescence compared to natural mated. Overall this work identified in bovine embryos a possible gene homologous to the murine Ped and the expression of protein similar to that coded by this gene and concluded that there are many transcripts similar to the Q7 gene being expressed in the maternal-fetal region of the placenta during pregnancy in bovine and such as in embryos

Os gânglios da raiz dorsal (GRD) armazenam neurônios TrkA-positivos. A percepção e transmissão de estímulos por estes neurônios dependem de uma neuritogênese adequada. Miosina (MioVa) é expressa no tecido nervoso e está presente em neuritos, corpo celular e cone de crescimento. Caracterizamos o padrão de expressão de MioVa na neuritogênese de células TrkA-positivas do GRD de galinha in vivo e in vitro. In vivo, MioVa é expressa em células que não começaram a emitir neuritos em HH25, e sua expressão persiste por toda neuritogênese. In vitro, é recrutada para o processo de re-emissão de neuritos de neurônios TrkA positivos na presença de NGF, sendo expressa em neuritos em diferentes estádios de neo-neuritogênese. Nos ensaios funcionais, observamos que a superexpressão do domínio globular de MioVa em culturas de GRD com 10 ou 100ng/ml de NGF reduz a população de células com neuritos longos e aumenta a população de células com neuritos curtos ou sem neuritos. Em conjunto, estes dados sugerem que a MioVa é importante para o estabelecimento de neuritos nociceptores. / The dorsal root ganglia (DRG) harbor the TrkA-positive neurons. The stimuli perception and transmission by these neurons depend on a proper neuritogenesis. Myosin (MyoVa) is widely expressed in nervous tissue and is present in neurites, cell body and growth cone. Here, we characterized the MyoVa expression pattern in chicken DRG TrkA-positive cells neuritogenesis, in vivo and in vitro. In vivo, at stage HH25, MyoVa was present both in cells with and without neurites and its expression persists throughout neuritogenesis. In vitro, it is recruited for the regeneration process and TrkA-positive neurons neurites re-emission in the presence of NGF, being expressed in neurites at different stages of neo-neuritogenesis. In functional assays, we observed that MyoVa globular tail overexpression in GRD cultures maintained with 10 or 100ng/ml NGF reduces the number of neurons with long neurites and increased the number of neurons with short neurites or no neurites. Taken together, these results suggest that Myosin Va is important for the establishment of nociceptor neurites.

Os grandes avanços obtidos em quantidade de massa muscular nos animais domésticos foram alcançados por programas de melhoramento genético baseados na seleção de características fenotípicas observados na fase adulta do animal. No entanto, o número de precursores miogênicos e conseqüentemente, de fibras musculares, é determinado nos estádios embrionários do desenvolvimento. Este fato direcionou o programa miogênico como alvo de busca de potenciais transcritos candidatos que possam causar impacto sobre a deposição muscular em animais domésticos. Este trabalho objetivou identificar transcritos candidatos originais associados ao desenvolvimento e crescimento do tecido muscular esquelético em frangos (Gallus gallus). Um total de 4.534 transcritos (ESTs) identificados em trabalhos anteriores foram imobilizados em membrana de náilon (microarranjo) para permitir a investigação das diferenças no padrão de expressão entre genótipos e tecidos. O perfil transcricional do tecido muscular peitoral entre linhagens contrastantes para potencial de crescimento e deposição muscular da Embrapa Suíno Aves permitiu identificar 98 transcritos diferencialmente expressos, que foram validados por amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-PCRq), e localizados em regiões coincidentes às anteriormente mapeadas por QTLs. Estes transcritos são agora os candidatos preferenciais para a identificação de mutações e desenvolvimento de marcadores específicos que possam ser empregados em programas de melhoramento e seleção precoce ou indireta de aves. O mesmo microarranjo foi utilizado para caracterizar os transcritos desconhecidos pelo padrão de expressão entre cinco tecidos (cérebro, coração, fígado, músculo e pele). Esta abordagem permitiu identificar transcritos com padrão de expressão tecido-específico e tecido-preferencialmente expressos e caracterizar 24 transcritos desconhecidos como co-expressos aos transcritos músculo esquelético-específicos. Por fim, o orientador de axônio RGM-A (Repulsive guidance molecule A), identificado como músculo esquelético-específico, foi selecionado para ser funcionalmente analisado in vivo, para investigar uma possível função deste transcrito atípico no tecido muscular e comprovar a eficiência dos microarranjos em orientar a seleção de transcritos candidatos. O padrão de expressão de RGM-A em embriões de frango e os efeitos da super-expressão sobre Pax3 indicaram uma possível associação deste orientador de axônio com a formação da musculatura esquelética dos vertebrados superiores. Os transcritos candidatos indicados por análises de microarranjo deste trabalho serão úteis não apenas para que os programas de melhoramento sejam capazes de manter ou aumentar os índices de crescimento das aves, que atualmente buscam por informações adicionais para superar os limites impostos pelo próprio perfil genético alcançado em anos de seleção. Estes resultados também abriram novas perspectivas para a caracterização funcional in vivo de transcritos desconhecidos, tendo embriões de frango como modelo animal. / by animal breeding programs along the years based on the observation of adult phenotypic characters. But, the number of myogenic precursor cells and, consequently, the number of muscle fibers is determined during the embryonic stages of development. Therefore, the embryonic myogenic program is an ideal target for searching potential candidate-transcripts, that can influence skeletal muscle deposition in domestic animals. This work aimed to identify original candidate-transcripts associated with skeletal muscle development and growth in chicken embryos (Gallus gallus). A total of previously identified 4,534 transcripts (Expressed Sequence Tags) were transferred to a nylon membrane (microarray) to investigate differences in expression patterns among genotypes and tissues. The pectoral skeletal muscle transcriptional pattern between broiler and layer chicken lines allowed the identification of 98 differentially expressed transcripts, whose expression were validated by quantitative RT-PCR (Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction), and were co-localized in coincident regions with previously mapped QTLs (Quantitative Trait Loci). These transcripts are now preferential candidates to further identify mutations, and/or to develop specific markers to be used in breeding programs for early or indirect selection of superior animals. The same microarray was used to characterize unknown transcripts by expression patterns among five tissues (brain, heart, liver, muscle and skin). This approach allowed to identify tissue-specific and/or preferentially-expressed transcripts, and to characterize 24 unknown transcripts as co-expressed with skeletal musclespecific ones. Finally, the axon guidance molecule RGM-A, identified as skeletal muscle-specific transcript by microarrays, was selected to be functionally analyzed in vivo, to investigate the function of this atypical transcript in the skeletal muscle and to demonstrate the approach efficiency to guide selection of candidate transcripts. The RGM-A expression pattern and the Pax3 phenotype after over-expression in chicken embryos indicated a possible association of this axon guidance with the skeletal muscle formation. The candidate transcripts identified by mycroarray analyses may be useful in animal breeding programs to increase the present gains in chicken growth rate, since additional information is urgently required to surpass current limits of selection gains. The results have also opened a new range of possibilities to promote the functional characterization in vivo of unknown transcripts, having chicken embryos as models.

Patologias causadas por mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) constituem um importante grupo de doenças genéticas em humanos. Todavia, devido ao desconhecimento dos mecanismos que governam a herança mitocondrial, não existem métodos eficientes que permitam prever ou intervir na herança destas patologias. Estudos recentes indicam que mutações no mtDNA são seletivamente eliminadas na linhagem germinativa. O presente projeto investigou se o embrião é capaz de eliminar mitocôndrias disfuncionais durante o desenvolvimento pré-implantação. Para tanto, zigotos de camundongo foram tratados com clorometil-X-rosamina (MitoTracker Red CMXRos) e fotossensibilizados por 0, 2,5, 5, 10, 20 e 60 s. Houve diminuição da taxa de blastocisto, com bloqueio total do desenvolvimento quando a fotossensibilização foi realizada por período igual ou superior a 20 s. A fotossensibilização também resultou em disfunção mitocondrial, como indicado por diminuição do potencial de membrana mitocondrial. No entanto, a transferência de citoplasma de zigotos NZB/BINJ (NZB) fotossensibilizados por 20 s não afetou o desenvolvimento de embriões C57BL/6 (B6). A quantidade de mtDNA NZB também não diferiu entre os zigotos B6, independente de terem recebido citoplasma exposto ou não à fotossensibilização (30,6% ± 1,73 vs. 30,8% ± 1,73). Porém, a quantidade de mtDNA NZB foi menor (P = 0,008) nos blastocistos que receberam citoplasma fotossensibilizado (31,4% ± 1,43 vs. 24,7% ± 1,43). Como a quantidade total de mtDNA não diferiu entre os grupos, estes resultados sugerem que as mitocôndrias disfuncionais introduzidas foram destruídas. A análise de autofagossomos indicou, no entanto, que as mitocôndrias NZB não foram eliminadas por mitofagia. Diferente do esperado, o cultivo na presença de rapamicina reverteu o efeito causado pela introdução de citoplasma fotossensibilizado, resultando em níveis semelhantes de mtDNA NZB em comparação com os blastocistos que receberam citoplasma não fotossensibilizado. Concluiu-se que o embrião de camundongo é capaz de destruir mitocôndrias disfuncionais durante o desenvolvimento à blastocisto. Novos estudos deverão fornecer evidências adicionais e esclarecer os mecanismos moleculares que fundamentam esses achados. / Pathologies caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) represent an important group of genetic diseases in humans. Nonetheless, due to our limited understanding of the molecular mechanisms of mitochondrial inheritance there are no efficient methods to predict or intervene in the inheritance of these diseases. Recent studies indicate that mutations in mtDNA are selectively eliminated in the germline. This project investigated the ability of the embryo to target and eliminate dysfunctional mitochondria during early development. To test that, mouse zygotes were treated with chloromethyl-X-rosamina (MitoTracker Red CMXRos) and photosensitized for 0, 2.5, 5, 10, 20 and 60 s. There was a decrease in the rate of blastocyst development and a developmental arrest when the photosensitization was performed for a period equal to or greater than 20 s. Photosensitization also resulted in mitochondrial dysfunction, as indicated by a decreased of mitochondrial membrane potential. However, cytoplasmic transfer from NZB/BINJ (NZB) zygotes photosensitized for 20 s resulted in no effect on development of C57BL/6 (B6) embryos. The amount of NZB mtDNA introduced also did not differ between B6 zygotes, regardless of whether they received or not photosensitized cytoplasm (30.6% ± 1.73 vs. 30.8 ± 1.73%). On the other hand, the amount of NZB mtDNA was lower (P = 0.008) in the blastocysts receiving photosensitized cytoplasm (31.4% ± 24.7% ± 1.43 vs. 1.43). Since the total amount of mtDNA was not different between the groups, these results suggest that dysfunctional mitochondria introduced by cytoplasmic transfer were destroyed. Analysis of autophagosomes indicated, however, that the NZB mitochondria were not eliminated by mitophagy. Different than expected, culture in the presence of rapamycin reversed the effect caused by introduction of photosensitized cytoplasm, resulting in similar levels of NZB mtDNA compared to blastocysts receiving cytoplasm not photosensitized. It was concluded that the mouse embryo may destroy dysfunctional mitochondria during development into blastocysts. Further studies should provide additional evidence and elucidate the molecular mechanisms underlying these findings.

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Carlos Roberto Teixeira / Banca: Lílian Rigatto Martins / Banca: Nei Moreira / Resumo: O acetato de deslorelina promove uma contracepção de longa duração segura e eficaz, porém a reversibilidade espontânea é progressiva e assincrônica. O objetivo geral foi avaliar os efeitos do acetato de deslorelina sobre a produção in vivo e in vitro de embriões de gatas domésticas. Para tanto foram realizados 2 experimentos. Experimento 1: Objetivou-se avaliar a taxa de produção de embriões in vitro em gatas tratadas com acetato de deslorelina. Foram utilizadas 21 fêmeas (Tratado n=11 e Controle n=10). Onze gatas receberam um implante de deslorelina (4,7mg/animal) e o tratamento durou 6 meses. Após o tratamento, todas as fêmeas (Tratado e Controle) foram submetidas à OSH para que seus ovários fossem incluídos em rotinas de produção de embriões in vitro (PIV). A taxa de recuperação de COC foi submetida ao teste t de Student. As taxas de clivagem e blastocisto foram expressas em porcentagem e submetidas ao teste exato de Fisher. Todas as análises foram realizadas no programa GraphPad v5.0, P<0.05. Uma gata apresentou galactorréia e foi retirada do grupo experimental. Foram obtidos 184 COC grau I, a taxa de clivagem foi em média de 55,97% (total de 103 mórulas) e de blastocisto de 33,99% (total de 33 blastocistos) no grupo Controle. Já no grupo Tratado foram obtidos 83 COC grau I e a taxa de clivagem foi em média 60,24% (total de 50 mórulas) e de blastocisto foi de 36% (total de 18 blastocistos). Só houve diferença estatística entre os grupos na taxa de recuperação de COC grau I. A taxa de recuperação de COC foi menor em gatas tratadas, porém a PIV apresentou taxas similares à de fêmeas não tratadas. Devem-se considerar as variações individuais no grupo tratado. Experimento 2: Objetivou-se avaliar a produção de embriões in vivo, a taxa de concepção, bem como a presença de receptores de estrógeno e progesterona no útero, e receptores de LH e FSH em ovários de gatas submetidas ao tratamento com... / Abstract: Deslorelin acetate promotes a long, safe and efficient contraception; however reversibility is consider progressive and asynchronous. We aim to evaluate the effects of deslorelin acetate on in vitro and in vivo embryo production in domestic cats. For that 2 experiments were performed. Experiment 1: The objective was to investigate the effect of contraceptive treatment with deslorelin acetate in in vitro embryo production and oocyte recovery in domestic queens. Twenty one queens (Treated n=11 and Control n=10) and one tom were used. Eleven queens were treated with deslorelin acetate (4.7mg/animal) during 6 months. Thereafter all females (treated and control) were spayed and the ovaries were included in in vitro embryo production routines (PIV). Rate of COC recovery was submitted to t test. Cleavage and blastocyst rate were expressed in percentage and submitted to Fisher's exact test. All analyses were performed in GraphPad Pisma v5.0 program, P < 0.05. One female developed galactorrhoea and was removed from experimental group. In Control group we recovered 18.4±3.21 of COC I, cleavage rate was 55.97% and blastocyst rate was 33.99%.In Treated group we recovered 8.3±1.15 of COC I, cleavage rate was 60.24% and blastocyst rate was 36%. Statistical difference was only observed in COC recovery, were treated cats had fewer than control group. Although we didn't found differences on embryo production, individual variation must be considered. Experiment 2: We aimed to evaluate in vivo embryo production, trough pregnancies, and also identify estrogen (ER-α) and progesterone (PgR) receptors in uterus and FSH (FSH-R) and LH (LH-R) receptors in ovaries from queen treated with deslorelin acetate. We used 25 queens and one tom, 15 queens were treated with deslorelin acetate (4.7mg/animal) for 3 months. After that, all implants were removed and estrous and ovulation was induced. After 24hs five queens were maintained with one tom and mating was ... / Doutor