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Développement de méthodes de production et d'analyse de vecteurs recombinants dérivés de l'adéno-associated virusBlouin, Véronique Moullier, Philippe. January 2007 (has links)
Thèse de doctorat : Médecine. Virologie : Nantes : 2007. / Bibliogr.
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Molecular insights into a putative potyvirus RNA encapsidation pathway and potyvirus particles as enzyme nano-carriers / Aperçus moléculaires d'une voie potentielle d'encapsidation de l'ARN de potyvirus, et des particules de potyvirus comme nano-porteurs d'enzymesBesong, Jane 14 June 2016 (has links)
La présente étude avait pour but d'identifier de nouvelles stratégies pour la présentation sélective d'enzymes à la surface de nanoparticules virales dans le but d’une application potentielle dans la technologie des biocapteurs ou des puces à protéines. Les potyvirus ont été choisis comme nanosupports modèles. Les Potyvirus, le genre le plus large de la famille des Potyviridae, la seconde plus grande famille de virus de plante, sont responsables de très graves pertes dans les cultures. Ils forment des capsides flexibles en forme de bâtonnet entourant une seule molécule d'ARN positif simple brin. Les événements moléculaires conduisant à la sélection et à l'encapsidation spécifiques de l'ARN potyviral sont inconnus. Afin de mieux exploiter le potentiel de ces virus comme nanosupports, la première étape de ce travail a porté sur l’étude, in vivo, du processus d'encapsidation de l'ARN de particules de potyvirus. Des études précédentes ont montré que la protéine d'enveloppe (CP) du virus de la pomme de terre A (PVA) interfère avec la traduction de l'ARN viral lorsqu'elle est fournie en excès en trans suggérant que cela pourrait se produire pour initier l’encapsidation de l’ARN viral. Dans cette étude, nous avons montré que cette inhibition est médiée par des interactions CP-CP co-traductionnelles se produisant entre deux populations de CP, produites en trans et en cis et permettant très probablement le recrutement spécifique de l'ARN potyviral pour son encapsidation. En accord avec les études d'assemblage in vitro publiées précédemment nous proposons un mécanisme selon lequel l’encapsidation de l'ARN viral est initiée par des interactions CP-CP co-traductionnelles. Dans la deuxième partie de ce travail, différentes approches ont été testées afin d’organiser des enzymes sur les plateformes virales dans le but d’optimiser la canalisation des intermédiaires réactionnels. Parmi les trois stratégies testées seule celle utilisant un peptide qui se liant aux anticorps, le peptide z33 de la protéine A de Staphylococcus aureus a été couronnée de succès. Une couverture de 87 % des sites sur les particules de potyvirus avec l'enzyme a été obtenue. Cette stratégie a été utilisée pour piéger deux enzymes, la 4-coumarate: coenzyme A ligase (4Cl2) et stilbène synthase (STS), catalysant des étapes consécutives dans la voie de synthèse de resvératrol à partir de lysats cellulaires solubles d’E. coli clarifiés, à la surface de particules de potyvirus immobilisées sur les parois d'un tube en polypropylène. Cette stratégie rassemble les approches ascendante et descendante pour construire des nanomatériaux à base de virus et offre un moyen efficace et économique pour co-immobiliser et purifier des enzymes / The present study intended to identify new strategies for the selective presentation of biocatalysts on the surface of viral nanoparticles with potential application in biosensor technology or protein chips. Potyviruses were chosen as model nanoscaffolds for biocatalysts. Potyviruses are the largest genus in the family Potyviridae and cause significant plant damage. They form flexible rod-shaped capsids surrounding a single stranded positive sense RNA molecule. The molecular events leading to the specific selection and encapsidation of potyviral RNA are unknown. To better exploit the potential of these viruses as nanocarriers, the first step in this study was to look into their in vivo RNA encapsidation process. Earlier studies showed that Potato virus A (PVA) coat protein (CP) interferes with viral RNA translation when provided in excess in trans and it was suggested this could occur to initiate viral RNA encapsidation. In this follow up study, we used the agroinfiltration approach for the transient expression of full length, truncated or mutated viral RNAs with wild type CP (CPwt) and showed that this inhibition is mediated by co-translational CPCP interactions occurring between two CP populations, produced in trans and in cis. Because CP inhibited translation of the entire viral genome and virus particles were formed later than during normal infection, it was assumed that the CP acted during this inhibition process to specifically recruit viral RNA for encapsidation. In line with previously published in vitro assembly studies, we propose a mechanism through which viral RNA encapsidation is initiated through co-translational CP-CP interactions. The second part of this work entailed the investigation of novel approaches for organizing biocatalysts on virus platforms. The aim was to control the display of enzymes on virus surfaces while maximizing channelling of reaction intermediates. Three strategies were tested but only one involving an antibody binding peptide, the z33 peptide from Staphylococcus aureus was successful. An 87 % occupancy of accessible sites on the potyvirus particles by the enzyme was achieved. The same strategy was used to graft potyvirus particles with two enzymes: 4- coumarate:coenzyme A ligase (4CL2) and stilbene synthase (STS), catalysing consecutive steps in resveratrol synthetic pathway or a protein chimera, generated by the genetic fusion of both enzymes. This was achieved by trapping either the monoenzymes or the protein chimera from clarified soluble E. coli cell lysates on to the surface of potyvirus particles preimmobilized in a polypropylene tube. Resveratrol was synthesized from both mono-enzymes and the protein chimera in solution and on potyvirus particles. This strategy brings together a bottom-up and top down approach for designing virus based nano-materials and offers a cost effective and efficient way to co-immobilize and purify enzymes.
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Caractérisation du rôle de la protéine cellulaire Staufen au niveau du cycle de réplication du virus d'immunodéficience type 1Clément, Jean-François January 2004 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Etude des mécanismes contrôlant la spécificité d'encapsidation des ARN dans le VIH-1 / Study of the mechanisms controlling packaging specificity of HIV-1 RNAsDidierlaurent, Ludovic 10 December 2010 (has links)
Le VIH-1 est un rétrovirus contenant deux copies de son génome ARN simple brin positif. Dans la cellule, son ARN est rétrotranscrit en ADN puis cet ADN est intégré dans le génome cellulaire. L'ADN viral est ensuite transcrit en ARN dont la moitié évite l'épissage. Dans le cytoplasme, cet ARN possède une double fonctionnalité : il sert d'ARNm pour la synthèse des protéines Gag et Gag-Pol et d'ARN génomique (ARNg) qui est encapsidé sous forme de dimère. Malgré sa faible abondance dans la cellule, l'ARNg est préférentiellement encapsidé. Cependant, il a été montré par nous et d'autres que d'autres ARN non-génomiques peuvent également être spécifiquement encapsidés, tels que des ARN viraux épissés et certains ARN cellulaires, bousculant ainsi le dogme d'une spécificité unique pour l'ARNg. Nous avons montré que le VIH-1 contrôlerait l'incorporation des ARN viraux, épissés et non épissés, par un mécanisme de compétition, impliquant des facteurs communs. En revanche, les ARN cellulaires 7SL et U6 semblent encapsidés par des mécanismes indépendants. Afin d'identifier les déterminants qui régissent la spécificité d'encapsidation, nous avons testé le rôle de la nucléocapside (NC) qui est fortement impliquée dans l'encapsidation. Nous montrons ici que de façon tou t à fait inattendue, des mutations de NC conduisent à l'encapsidation d'ADN et augmentent également l'encapsidation d'ARN viraux épissés. Nous avons ensuite cartographié les déterminants de la région 5' UTR de l'ARNg et déterminé que la tige-boucle polyA et la région PBS sont impliquées dans l'encapsidation des ARN viraux épissés. Ce travail apporte une meilleure compréhension de la spécificité d'encapsidation, primordiale pour la mise au point de thérapies géniques utilisant des vecteurs lentiviraux. / HIV-1 is a retrovirus containing two copies of its single stranded positive RNA genome. In the cell, its RNA is reverse transcribed into DNA and this DNA is integrated into the cellular genome. The viral DNA is then transcribed into RNA. One moiety of this RNA pool escapes splicing. Once in the cytoplasm, this RNA has a double function: it serves as mRNA for synthesis of Gag and Gag-Pol proteins and as genomic RNA (gRNA) that is packaged as a dimer. Despite its low abundance in the cell, the gRNA is preferentially encapsidated into virions. However, it has been shown by us and others that other non-genomic RNA can be specifically packaged, such as spliced viral RNA and some cellular RNA, thus shaking up the dogma of a unique specificity for the gRNA. We have shown that HIV-1 might control the incorporation of the spliced and unspliced RNA by a mechanism of competition, involving common factors. In contrast, cellular RNA 7SL and U6 seem encapsid ated through independent mechanisms. To identify the determinants that govern the specificity of encapsidation, we tested the role of the nucleocapsid (NC) which is strongly involved in the packaging. Here we show that unexpectedly, mutations of NC lead to the encapsidation of DNA and also increase the encapsidation of spliced viral RNA. We then mapped the determinants in the 5' UTR of the gRNA and determined that the polyA stem-loop and the PBS region are involved in the encapsidation of the spliced viral RNA. This work provides a better understanding of the specificity of encapsidation that is crucial for the development of gene therapy using lentiviral vectors.
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Étude du rôle de la protéine Staufen1 dans le cycle de réplication du virus d'immunodéficience humaine de type 1Chatel-Chaix, Laurent January 2006 (has links)
Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Příprava experimentálního systému pro studium životního cyklu myšího polyomaviru / Experimental system for the mouse polyomavirus life cycle studyPergner, Jiří January 2010 (has links)
Experimental system for the mouse polyomavirus life cycle study Abstract: Murine polyomavirus (MPyV) is the prototype of the Polyomaviridae family. This family includes also some important human pathogens (BKV, JCV, Merkel cell polyomavirus). Due to their specific properties viruses within this family may serve as versatile vectors for gene therapy or recombinant vaccine production. New methodological approaches may help to understand some yet unknown facts about MPyV life cycle. Clarification of some processes during murine polyomavirus life cycle may be also important to fully exploit polyomaviruses for therapeutic purposes. The aim of this diploma thesis was to preparare two innovative experimental systems that extend possibilities of studying the life cycle of MPyV. The first part of the diploma thesis focusses on construction of recombinant MPyV which expresses yellow fluorescent protein (EYFP) in the early stages of infection. Such virus can be very useful for studying the infection spreading by live- cell imaging and Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) and can be employed for co- localization studies of YFP-tagged LT antigen with certain cellular proteins. Second part of the diploma thesis describes preparation of a hybrid cell line prepared by fusion of mouse and monkey cells. This new cell...
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Cytomégalovirus humain, mutations de résistance et nouvelles cibles thérapeutiques / Resistance mutations of human cytomegalovirus and new antiviral targetsLigat, Gaëtan 01 December 2017 (has links)
Le cytomégalovirus humain (CMVH) est un pathogène opportuniste majeur en cas d’immunodépression et représente la principale cause d’infection congénitale d’origine virale. Bien qu’efficaces, l’utilisation des molécules conventionnelles est limitée par l’émergence de résistance et leur toxicité. Il devient alors nécessaire de développer de nouveaux traitements.L’étude des nouvelles mutations émergeant sous traitement antiviral demeure donc essentielle. L’introduction de ces nouvelles mutations, par mutagénèse « en passant », dans un chromosome bactérien artificiel contenant le génome viral nous permet, après transfection en cellules humaines, de tester la sensibilité de la souche recombinantes aux antiviraux.Différentes mutations de résistances ont ainsi été caractérisées. Afin de mettre en évidence de nouvelles cibles antivirales, des analyses bio-informatiques et la production de virus recombinants ont permis d’identifier de potentiels motifs fonctionnels essentiels à la réplication au sein du complexe terminase et hélicase-primase. Ainsi, nous avons montré quela sous-unité pUL56 du complexe terminase appartient à la famille des LAGLIDADG Homing Endonuclease. En effet, pUL56 contient un motif LATLNDIERFL et un motif de liaison à l’ADN. La technologie Alpha utilisant des protéines purifiées a permis de valider le caractère essentiel du fragment WMVVKYMGFF de pUL56 pour l’interaction avec pUL89. Enfin, nous avons mis en évidence les résidus impliqués dans la fixation de l’ATP au sein de l’hélicase et dans la stabilisation du zinc de la primase. Ainsi, la compréhension de la structure de ces protéines pourrait permettent de mieux appréhender leur fonctionnement au sein du processus de réplication du CMVH et le développement de nouvelles thérapies ciblant ces domaines. / Human cytomegalovirus (HCMV) is an important opportunistic pathogen for immunecompromised patients and is the leading cause of congenital viral infection. Although they are effective, using of conventional molecules is limited by the emergence of resistance and their toxicity. Then it becomes necessary to develop new treatments. Study of new mutationsemerging under antiviral treatment is therefore essential. Introduction of these new mutations, by « en passant » mutagenesis, into an artificial bacterial chromosome containing the viral genome allows us, after transfection into human cells, testing antivirals sensitivity of the recombinant. Different mutations of resistances have been characterized. In order tohighlight new antiviral targets, bioinformatics and recombinant viruses production allowed to identify potential functional patterns essential for viral replication within terminase and helicase-primase complex. Thus, we have shown that pUL56 subunit of the terminase complex belongs to the LAGLIDADG Homing Endonuclease family. Indeed, pUL56 contains aLATLNDIERFL motif and a DNA binding motif. Alpha technology using purified proteins allowed to validate the essential character of the WMVVKYMGFF fragment of pUL56 for the interaction with pUL89. Finally, we highlighted the residues involved in ATP binding within the helicase and in the stabilization of zinc within the primase. Thus, understanding of these proteins structure could allow us to better understand their role within the viral replication process and the development of new therapies targeting these domains.
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In planta produkce nanočástic specifické délky s použitím RNA a obalového proteinu Viru tabákové mozaiky (TMV) / In planta production of TMV (Tobacco mosaic virus) nanoparticles of specific lengthDlabalová, Lucie January 2013 (has links)
Tobacco mosaic virus (TMV) is one of the most investigated viruses and its attributes and structure are therefore well-known. In this work, we have chosen TMV as a biotemplate for the adjustable-length particles production in plants. The viral RNA and coat protein of TMV self-assemble into particles under physiological conditions. The particle length depends on the length of packaged RNA. The encapsidation signal that is necessary for preferential viral RNA packaging by coat protein disks is known and characterized since the 1980's. In this work, we have proposed a two-component system based on a Nicotiana bentamiana plants infection with packaging competent defective RNA (dRNA) and a helper virus RNA which provides all the components necessary for dRNA replication and packaging. The encapsidation signal in the helper virus sequence was removed to avoid formation of particles of incorrect length. Some of our helper viruses contained a coat protein with modified region of the particle's inner channel. This modification should allow specific binding of metal atoms within the core of the rod shaped particle. Several variants of dRNA and helper viruses were prepared to identify individual areas important for the replication, encapsidation and nanoparticle stability. We focused on the particle formation...
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Utilisation des propriétés d'assemblage de virus hétérologues pour l'étude du cycle viral du virus de l'hépatite C / Diverting the assembly properties of heterologous virus to study the life cyle of Hepatitis CCaval, Vincent 03 February 2012 (has links)
Si la découverte récente de la souche virale JFH1, capable de réaliser un cycle viral complet en culture cellulaire, a permis de mieux caractériser le déroulement de l’infection du virus de l’hépatite C VHC, de nombreux aspects de la biologie du virus demeurent méconnus. Parmi ceux-ci, les mécanismes gouvernant l’encapsidation de l’ARN génomique viral au sein des particules restent à élucider. Cette thèse décrit la mise point d’un système de mobilisation hétérologue permettant l’analyse de l’interaction de la protéine de capside Core avec l’ARN viral. Ce système nous a permis d’identifier les régions de la protéine impliquées dans la liaison au génome viral, tout en autorisant son transfert dans des cellules naïves. Cette approche de mobilisation dépendante de la Core est complétée d’une étude de recrutement hétérologue basée sur la reconnaissance de l’ARN du phage MS2 avec la protéine de manteau Coat. Cette stratégie novatrice permet le recrutement efficace des ARNs marqués tout en autorisant leur localisation cellulaire. / The advent of infectious molecular clones of Hepatitis C virus (HCV) has unlocked the understanding of HCV life cycle. However, packaging of the genomic RNA, which is crucial to generate infectious viral particles, remains poorly understood. To study packaging in vivo, we developed a novel heterologous system to evaluate the interactions of HCV Core capside with viral RNA. This system allowed us to pinpoint Core domains involved in RNA binding, and package and transfer HCV RNA into a lentiviral vector. Aside from this Core dependent recruitment, we engineered retoviral vectors to trans-package MS2-tagged RNAs using MS2 Coat protein interaction. This system allowed us to efficiently recruit MS2-tagged replicons into naive cells and offers the opportunity to visualize HCV RNAs in Huh7.5 cells.
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The effect of the accumulation of Hepatitus B virus e-antigen precursor on cell viabilityViana, Raquel Valongo 17 November 2006 (has links)
Student Number : 9906382M
MSc (Med) dissertation -
Faculty of Health Sciences / The G1862T mutation in the bulge of the RNA encapsidation signal, in the precore
region of hepatitis B virus, results in reduced expression of HBeAg and accumulation of
the HBeAg precursor in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi apparatus of the cell.
This accumulation can disturb the functioning of the ER and lead to the ER stress
response that can affect various cellular pathways, in turn affecting cell viability. The aim
of this study was to determine whether apoptosis or necrosis occurred when cultured
Huh7 cells were transfected with a plasmid expressing the G1862T mutation. Plasmid
constructs, with and without the G1862T mutation, were used to transfect cells. To
differentiate between necrosis and apoptosis cells were stained with propidium iodide or
YO-PRO-1®, respectively. These were analyzed quantitatively using flow cytometry and
qualitatively using confocal microscopy. Confocal microscopy, using monoclonal anti-
HBe and the Hoechst stain, was performed to ensure that apoptosis was present as a result
of the accumulation of the G1862T mutant HBeAg precursor. Caspase profiling was
carried out using a fluorogenic-based assay. When cells were transfected with wild-type
plasmid, necrosis predominated over apoptosis. Apoptosis predominated when the cells
were transfected with the G1862T mutant plasmid. The highest levels of apoptosis
occurred at 72 hours post-transfection. Confocal microscopy revealed the co-localization
of aggregates of mutant HBeAg precursor with apoptotic nuclei. Transfection with
G1862T mutant plasmids resulted in significant differences in the expression of caspase
3, 8, and 9 relative to the wild-type, at 48 and 72 hours post-transfection. The
accumulation of the G1862T mutant HBeAg precursor, in the ER/ Golgi compartment,
leads to apoptosis and affects the levels of caspase expression.
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