A encefalopatia hepática é uma disfunção cerebral causada por insuficiência hepática que se manifesta através de um amplo espectro de anormalidades neurológicas e psiquiátricas, variando de alterações subclínicas à coma. Sua base fisiopatológica é complexa, envolvendo principalmente o aumento de amônia, glutamato, glutamina, estresse oxidativo e alteração no metabolismo cerebral. O nucleosídeo guanosina apresenta propriedades neuroprotetoras frente à excitotoxicidade glutamatérgica, estresse oxidativo e convulsão, tendo um potencial papel neuroprotetor em encefalopatia hepática e hiperamonemia. Nesta tese, apresentamos dois modelos experimentais. No primeiro, induzimos encefalopatia através da administração de acetato de amônia por via intraperitoneal em ratos. O grupo tratamento recebeu guanosina 20 minutos antes de receber acetato de amônia. Analisamos alterações hepáticas e sistêmicas, letalidade, análises neurológicas (normal, pré-coma, coma e morte) e eletroencefalográficas, níveis liquóricos de glutamato, glutamina, alanina e amônia, marcadores de estresse oxidativo no sistema nervoso central, captação de glutamato cortical, e atividade e imunoconteúdo cortical da enzima glutamina sintetase. A guanosina drasticamente reduziu a taxa de letalidade (50%) e duração de coma (30%). Outros desfechos foram melhora no traçado eletroencefalográfico, normalização de níveis liquóricos de glutamato, normalização na captação de glutamato e manutenção dos níveis normais de estresse oxidativo no sistema nervoso central. No segundo modelo, induzimos encefalopatia hepática em ratos através de hepatectomia subtotal (92%). Tivemos como objetivos aprofundar o conhecimento nos mecanismos da encefalopatia hepática e consequentes alterações no metabolismo cerebral. Avaliamos letalidade cirúrgica, alterações hepáticas e sistêmicas, atividade comportamental em teste de campo aberto, análise eletroencefalográfica, níveis liquóricos de aminoácidos, imunoconteúdo de transportadores glutamatérgicos, marcadores de estresse oxidativo, atividade das enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e oxidação de glutamato, além de glutamina e glicose no sistema nervoso central. A cirurgia de hepatectomia subtotal provocou profundas alterações na análise eletroencefalográficas e no perfil comportamental dos animais, que apresentaram diminuição da locomoção. Também, houve alterações no metabolismo cerebral e em marcadores de estresse oxidativo compatíveis com aumento de proteólise cerebral (aumento de glutamina, glutamato e aminoácidos de cadeia ramificada), aumento de glicólise, aumento na oxidação cerebral de glutamato e diminuição na oxidação de glicose e lactato. Com dois modelos complementares, correlacionamos alterações neuroquímicas, metabólicas, eletroencefalográficas e comportamentais, aprofundando-nos na fisiopatologia da EH. Esta tese traz novas evidências para a utilização do nucleosídeo guanosina em tratamento de hiperamonemia e encefalopatia hepática. / Hepatic encephalopathy is a brain dysfunction caused by liver failure that manifests itself through a broad spectrum of neurological and psychiatric abnormalities, ranging from subclinical symptoms to coma. Its pathophysiological basis is complex, involving mainly the increase of ammonia, glutamate, glutamine, oxidative stress and alteration in cerebral metabolism. The nucleoside guanosine has neuroprotective properties against glutamatergic excitotoxicity, oxidative stress and convulsion, and has a potential neuroprotective role in hepatic encephalopathy and hyperammonemia. In this thesis, we present two experimental models. In the first, we induced encephalopathy through the administration of ammonia acetate intraperitoneally in rats. The treatment group received guanosine 20 minutes before receiving ammonia acetate. We analyzed hepatic and systemic changes, lethality, neurological scale (normal, pre-coma, coma and death) and electroencephalographic analyzes, cerebrospinal fluid level of glutamate, glutamine, alanine and ammonia, oxidative stress markers in the central nervous system, cortical glutamate uptake and, finally, activity and immunocontent of the enzyme glutamine synthetase. Guanosine dramatically reduced lethality rate (50%) and coma duration (30%). Other outcomes were: improvement in electroencephalographic tracing, normalization of glutamate levels, normalization of glutamate uptake and maintenance of normal levels of oxidative stress in the central nervous system. In the second model, we induced hepatic encephalopathy in rats through subtotal hepatectomy (92%). We aimed to better understand the mechanisms of hepatic encephalopathy and consequent alterations in cerebral metabolism. We evaluated surgical lethality, hepatic and systemic alterations, behavioralal activity in the open field test, electroencephalographic analysis, cerebrospinal fluid levels, immunocontent of glutamatergic transporters, oxidative stress markers, activity of tricarboxylic acid cycle enzymes and glutamate, glucose and lactate oxidation. Subtotal hepatectomy surgery caused profound alterations in the electroencephalographic analysis and in the behavioral profile of the animals, which showed a decrease in locomotion. Also, there were alterations in cerebral metabolism and markers of oxidative stress compatible with increased cerebral proteolysis (increase of glutamine, glutamate and branched-chain amino acids), increased glycolysis, increased cerebral oxidation of glutamate, and decreased glucose and lactate oxidation . With two complementary models, we correlate neurochemical, metabolic, electroencephalographic and behavioral changes, beeter comprehensing the physiopathology of hepatic encephalopathy. This thesis brings new evidence for the use of the nucleoside guanosine in the treatment of hyperammonemia and hepatic encephalopathy.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE) pertenece a un grupo de enfermedades neurodegenerativas denominadas Espongiformes Transmisibles (EET), dentro de las cuales se destacan además la Enfermedad de Creutzfeld Jakob (CJD) con su nueva variante (NV-CJD) en los humanos y el Scrapie en animales. Estas patologías se caracterizan por ser mortales, tener un largo período de incubación y presentar signos neurológicos progresivos. En el análisis histopatológico del sistema nervioso central (SNC) de los afectados predomina una vacuolización de la sustancia gris. El agente etiológico de estas patologías se denomina "prión" (partícula infecciosa de naturaleza proteica) y consiste en una isoforma infectiva (PrPsc) de una proteína celular normal (PrPc) que, además de poseer una gran resistencia a la proteinasa K, adquiere la capacidad de transformar la isoforma normal en patológica. La BSE ha adquirido gran importancia en el último tiempo debido a sus graves consecuencias económicas y por su posible transmisión al hombre, dando origen a la nueva variante de la Enfermedad de Creutzfeld Jakob (nv-CJD) a través del consumo de productos cárneos infectados. A pesar de que nuestro país es considerado libre de BSE y con bajo riesgo de introducción de esta enfermedad, es muy importante contar con métodos de diagnóstico específicos, rápidos, reconocidos y utilizados internacionalmente. En este estudio se logró purificar la proteína priónica celular (PrPc), a partir de cerebros de bovino y se caractrizó mediante electroinmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal específico 6H4. Además se caracterizó una proteína priónica recombinante (PrPrec). Por otra parte, se realizó una inmunodetección de proteínas priónicas mediante la utilización de un "kit" de inmunoensay enzimático (ELISA), aprobado por la Comisión Europea en 1999 como método de diagnóstico para BSE. Mediante este ensayo se analizaron 45 muestras de óbex de bovinos, mayores de 30 meses de edad, provenientes de mataderos de la Región Metropolitana. En un estudio inicial se obtuvieron 2 muestras sospechosas, lo cual se pudo deber a errores de operación. Posteriormente estas muestras fueron analizadas nuevamente, resultando finalmente el 100% de las muestras en estudio negativas. A través de este estudio se logró implementar en forma pionera en nuestro país este método diagnóstico para BSE, utilizado y reconocido ampliamente a nivel internacional, aportando así un nuevo método a las medidas epidemiológicas nacionales destinadas a mantener a nuestro país libre de BSE / FINANCIAMIENTO: CENTRO DE BIOLOGIA Y BIOTECNOLOGIA (CBB) DEL INSTITUTO MILENIO DE ESTUDIOS AVANZADOS DE LA UNIVERSIDAD DE CHILE SERVICIO AGRICOLA Y GANADERO (SAG

Memoria para optar al Título Profesional de Médico / Existe un grupo de patologías neurodegenerativas letales que afectan a los humanos y a los animales denominadas encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). En los humanos, destaca la enfermedad de Creutzfeldt Jacob (CJD), y la aparición en los últimos años de una nueva variante (nvCJD) que es causada por el agente de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Dentro de las EET animales, destaca el scrapie de ovinos y caprinos, y la BSE, que además de afectar al ganado bovino, es transmisible a los humanos. La teoría más aceptada sobre el agente etiológico de estas enfermedades es la teoría del prión, que corresponde a una proteína priónica patológica (PrPsc) resistente a proteasas, que se origina por un cambio conformacional de una proteína priónica celular del huésped (PrPc). La encefalopatía espongiforme bovina (BSE) ha causado impacto mundial por el daño que ha provocado en la salud animal y en la economía, y por su relevancia en la salud pública al ser una enfermedad zoonótica. Durante años, el método de diagnóstico de rutina para la BSE fue el examen histopatológico del SNC de los bovinos sospechosos. Sin embargo, la epidemia desencadenada en Europa, principalmente en el Reino Unido, aumentó la necesidad de implementar métodos diagnósticos más rápidos y certeros. Esto originó el desarrollo de pruebas rápidas de diagnóstico, basadas en técnicas de inmunodetección del agente patológico (PrPsc) como es la inmunotransferencia o western blot. El presente trabajo se orientó por una parte, a la purificación, caracterización y detección inmunológica de proteínas priónicas en óbex de bovinos, mediante la utilización de la inmunotransferencia. Para obtener la PrPc, se utilizó un método de purificación de proteínas priónicas, y en el caso de la PrPsc se utilizó una proteína priónica recombinante (PrPrec); además, se evaluó la respuesta de ambas proteínas frente a la actividad enzimática de la proteinasa K. Para la posterior caracterización y detección inmunológica de estas proteínas, se realizó una electroinmunotransferencia. Por otra parte, para evaluar un método rápido de diagnóstico que detecte el agente de la BSE, se utilizaron 84 muestras de óbex de bovinos provenientes de mataderos de la Región Metropolitana, las que se analizaron individualmente por Western Blot mediante un kit comercial (Prionics Check-Western), aceptado y utilizado internacionalmente para el monitoreo y diagnóstico de esta enfermedad. Los resultados del presente estudio muestran la caracterización y detección inmunológica de la PrPc y la PrPrec mediante la inmunotransferencia. Además, se demuestra la sensibilidad a la digestión de ambas proteínas con la proteinasa K, lo que las diferencia de la PrPsc, que es una proteína proteasa resistente. En cuanto a los resultados obtenidos con el kit (Prionics Check-Western), de las 84 muestras analizadas 60 arrojaron un resultado negativo a BSE, ya que no se detectó inmunológicamente la PrPsc. El resto de las muestras (24) fueron analizadas nuevamente por dar resultados inconclusos, al aparecer bandas en el rango de peso molecular de la PrPsc. Sin embargo, finalmente el total de las muestras (84) arrojaron resultados negativos a BSE, lo que indica que las muestras inconclusas eran falsas positivas originadas por una deficiente digestión enzimática de la PrPc. La importancia de esta memoria de título radica en el hecho de ser pionera en la caracterización e inmunodetección de las proteínas priónicas de bovinos utilizando la inmunotransferencia, y en lograr la utilización e implementación en nuestro país de un método de diagnóstico rápido para BSE basado en un kit comercial, que es utilizado y aceptado internacionalmente para la detección del agente etiológico de esta patología

Pela grande produção de equinos no Brasil, perdas econômicas causadas por mortalidade ou perdas reprodutivas neste plantel simbolizam grandes prejuízos, tanto na produção para o mercado interno quanto para a exportação. Necessário se faz o acompanhamento de enfermidades que afetam o sistema nervoso desta espécie. Agentes virais e bacterianos causando problemas neurológicos e reprodutivos, nesta espécie, são amplamente estudados no Brasil. Pouco se conhece sobre o papel dos protozoários da família Sarcocystidae em determinar sinais clínicos neurológicos e reprodutivos. O objetivo deste estudo é identificar protozoários formadores de cistos, com potencial para causar doença neurológica e reprodutiva, em amostras de tecido encefálico de equinos com diagnóstico clínico de encefalopatias e de fetos abortados. Foram analisadas 165 amostras de SNC e 21 amostras de feto abortado de equinos, enviados ao Instituto Biológico para realização de exames laboratoriais. As amostras foram submetidas à nested PCR-ITS1 com primers direcionados às regiões conservadas do lócus ribossômico de protozoários da família Sarcocystidae. Após confirmação do resultado, os produtos de amplificação foram sequenciados para a determinação das sequências ITS1, discriminatórias entre as diversas espécies de protozoários da família Sarcocystidae. Das 15 amostras positivas (duas de feto abortado e 13 de SNC de equino com sintomatologia neurológica) em 14 o protozoário envolvido foi Toxoplasma gondii e em uma delas Sarcocystis neurona. Para Neospora spp não foi encontrada nenhuma amostra positiva. Nas amostras de SNC também foi realizado o exame histopatológico para análise das alterações histopatológicas. Todos os materiais positivos para S. neurona ou T. gondii apresentaram algum tipo de alteração (infiltrado inflamatório meníngeo/neurópilo), congestão/edema, hemorragia, necrose, malácia, indicando a ação de patógeno neurotrópico. A frequência de amostras positivas pela nested PCR-ITS1, para a presença de protozoários foi 7,9% (13/165) e de abortamento por protozário (T. gondii) foi de 9,5% (2/21). Sarcocystis neurona foi encontrado em apenas uma amostra de SNC. Pelos resultados é possível inferir que a ocorrência de mieloencefalite e abortamentos causados pelos protozoários Sarcocistideos em equinos pode revelar-se maior do que se considera atualmente, caso o estudo do SNC nesta espécie seja executado rotineiramente para a conclusão de casos clínicos. / Regarding the importance of equine husbandry in Brazil, economic losses due to mortality or reproductive failures within these herds could mean significant problems for national and international trade market. Therefore, it is necessary to research for diseases affecting the central nervous system (CNS). In Brazil, a broad amount of studies has been made concerning viral and bacterial neurvous and/or reproductive diseases. Although, little is stablished about the rule of protozoan from Sarcocystidae family leading to that kind of symptomatology. This study aimed to identify cystic protozoa which are potentially pathogenic for reproductive and neural tracts using samples from equine encephalic tissue of animals diagnosed with clinical encephalopathy and aborted fetuses. 165 samples of equine CNS and 21 aborted fetuses of this same species were analyzed in the Instituto Biológico facilities. They were submitted to nested PCR-ITS1 using primer to conserved regions from ribosomal locus of Sarcocystidae family protozoa. After confirmatory results, amplified samples were submitted to sequencing for determination of ITS-1 sequences, which are discriminatory concerning the several species of protozoan from Sarcocystidae family. Among the 15 positive identified samples (2 from aborted fetuses and 13 from adult equine CNS), in 14 were detected Toxoplasma gondii as the protozoa involved with the symptoms and in one of them Sarcocystis neurona was detected. None was found positive for Neospora spp. All samples collected were examined using histopathological techniques looking for disease findings. Positive samples for S. neurona or T. gondii showed varied types of alteration (neutrophilic/meningeal inflammatory infiltrate), congestion/edema, hemorrhage, necrosis and malacia, indicating that they were affected by a neurotropic pathogen. The frequency of parasitic equine encephalitis using nested PCR-ITS1 was 7,9% (13/165) and abortion by protozoa (T. gondii was 9,5% (2/21). The incidence of these diseases may be higher than registered nowadays if equine CNS could be analyzed during clinical diagnosis routine for case conclusion.

A encefalopatia hepática (EH) é um conjunto de manifestações neuropsiquiátricas associada a um quadro de insuficiência hepática. Essas manifestações são atribuídas sobretudo à elevação nos níveis de amônia no Sistema Nervoso Central (SNC), causando distúrbios na homeostase dos neurotransmissores, edema cerebral, neuroinflamação e aumento do estresse oxidativo. A perda de função do fígado pode acontecer de forma aguda ou insidiosa, acarretando diferentes respostas no SNC relacionadas à elevação aguda ou crônica da amônia. Um dos neurotransmissores envolvidos na fisiopatologia desta síndrome é o glutamato, o principal neurotransmissor excitatório do SNC. A excitotoxicidade glutamatérgica está presente em ambas as apresentações da encefalopatia hepática. A Guanosina, um nucleosídeo derivado da guanina, é conhecida por apresentar uma função neuroprotetora no sistema nervoso central, agindo como um antagonista do sistema glutamatérgico através do aumento da captação de glutamato, além de possuir efeitos tróficos e antioxidantes em células neurais. Desta forma, nesta tese, avaliaram-se um modelo de EH crônica (ligação do ducto biliar de ratos); e um de hiperamonemia aguda (administração intra peritoenal de amônia em ratos). No quadro de EH crônica, o tratamento com Guanosina resultou em uma melhora no teste comportamental Y maze, diminuição do glutamato no líquor e redução dos marcadores de estresse oxidativo. Já no modelo de hiperamonemia aguda, quadro muto semelhante à EH aguda, a Guanosina diminuiu o tempo em coma, normalizou as alterações do eletroencefalograma, aumentou a captação de glutamato, normalizou os níveis de glutamato e amônia no líquor, atenuou o estresse oxidativo e diminuiu a mortalidade. Para o nosso conhecimento, os resultados dessa tese são a primeira descrição do efeito neuroprotetor da Guanosina na EH, com importante contribuição para o estudo da doença. Além disso, surge como potencial alternativa terapêutica a ser estudada para quadros de insuficiência hepática grave em que muitas vezes somente o transplante hepático pode evitar uma deterioração neurológica irreversível. / Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric syndrome associated with liver disease. Increasing of ammonia in the Central Nervous System (CNS) is the main implicated mechanism, resulting in cerebral edema, neurotransmitters disturbance, neuroinflamation and oxidative stress damage. Hepatic insufficiency may be developed suddenly or subtle, resulting in acute or chronic hyperammonemia. Glutamate, the main excitatory neurotransmitter in the CNS plays a major role in the physiopathology of this syndrome. Glutamatergic excitotoxicity is described in both presentations: acute and chronic encephalopathy. As Guanosine plays an important neuroprotective role in the CNS, exerting glutamatergic system antagonism, antioxidant activity and trophic effects on neural cells, in this study, we evaluated the neuroprotective effects of Guanosine on an animal model of hepatic encephalopathy. Initially, we demonstrated that Guanosine was neuroprotective against chronic hepatic encephalopathy (rats were submitted to bile duct ligation) once it has improved a behavioral test performance (Ymaze) and normalized cerebrospinal fluid (CSF) glutamate and brain oxidative stress parameters. Additionally, it was also investigated the Guanosine effects on acute hyperammonemia (rats were injected with ammonium acetate). The treatment was able to decrease oxidative stress damage, reduce glutamate and ammonia levels on CSF, increase glutamate uptake and improve neurological status in rats with severe acute hyperammonemia. Besides, Guanosine prevents death against acute hyperammonemia. Token altogether, we argue that Guanosine neuroprotective effect is related to its ability to antagonizing glutamatergic excitotoxicity by increasing glutamate uptake. Overall, to our knowledge, this is the first study presenting the neuroprotective effects of Guanosine on hepatic encephalopathy. Furthermore it could eventually be developed as a drug useful for helping severe hepatic encephalopathy, which, in many cases, liver transplant is the only alternative.

Pela grande produção de equinos no Brasil, perdas econômicas causadas por mortalidade ou perdas reprodutivas neste plantel simbolizam grandes prejuízos, tanto na produção para o mercado interno quanto para a exportação. Necessário se faz o acompanhamento de enfermidades que afetam o sistema nervoso desta espécie. Agentes virais e bacterianos causando problemas neurológicos e reprodutivos, nesta espécie, são amplamente estudados no Brasil. Pouco se conhece sobre o papel dos protozoários da família Sarcocystidae em determinar sinais clínicos neurológicos e reprodutivos. O objetivo deste estudo é identificar protozoários formadores de cistos, com potencial para causar doença neurológica e reprodutiva, em amostras de tecido encefálico de equinos com diagnóstico clínico de encefalopatias e de fetos abortados. Foram analisadas 165 amostras de SNC e 21 amostras de feto abortado de equinos, enviados ao Instituto Biológico para realização de exames laboratoriais. As amostras foram submetidas à nested PCR-ITS1 com primers direcionados às regiões conservadas do lócus ribossômico de protozoários da família Sarcocystidae. Após confirmação do resultado, os produtos de amplificação foram sequenciados para a determinação das sequências ITS1, discriminatórias entre as diversas espécies de protozoários da família Sarcocystidae. Das 15 amostras positivas (duas de feto abortado e 13 de SNC de equino com sintomatologia neurológica) em 14 o protozoário envolvido foi Toxoplasma gondii e em uma delas Sarcocystis neurona. Para Neospora spp não foi encontrada nenhuma amostra positiva. Nas amostras de SNC também foi realizado o exame histopatológico para análise das alterações histopatológicas. Todos os materiais positivos para S. neurona ou T. gondii apresentaram algum tipo de alteração (infiltrado inflamatório meníngeo/neurópilo), congestão/edema, hemorragia, necrose, malácia, indicando a ação de patógeno neurotrópico. A frequência de amostras positivas pela nested PCR-ITS1, para a presença de protozoários foi 7,9% (13/165) e de abortamento por protozário (T. gondii) foi de 9,5% (2/21). Sarcocystis neurona foi encontrado em apenas uma amostra de SNC. Pelos resultados é possível inferir que a ocorrência de mieloencefalite e abortamentos causados pelos protozoários Sarcocistideos em equinos pode revelar-se maior do que se considera atualmente, caso o estudo do SNC nesta espécie seja executado rotineiramente para a conclusão de casos clínicos. / Regarding the importance of equine husbandry in Brazil, economic losses due to mortality or reproductive failures within these herds could mean significant problems for national and international trade market. Therefore, it is necessary to research for diseases affecting the central nervous system (CNS). In Brazil, a broad amount of studies has been made concerning viral and bacterial neurvous and/or reproductive diseases. Although, little is stablished about the rule of protozoan from Sarcocystidae family leading to that kind of symptomatology. This study aimed to identify cystic protozoa which are potentially pathogenic for reproductive and neural tracts using samples from equine encephalic tissue of animals diagnosed with clinical encephalopathy and aborted fetuses. 165 samples of equine CNS and 21 aborted fetuses of this same species were analyzed in the Instituto Biológico facilities. They were submitted to nested PCR-ITS1 using primer to conserved regions from ribosomal locus of Sarcocystidae family protozoa. After confirmatory results, amplified samples were submitted to sequencing for determination of ITS-1 sequences, which are discriminatory concerning the several species of protozoan from Sarcocystidae family. Among the 15 positive identified samples (2 from aborted fetuses and 13 from adult equine CNS), in 14 were detected Toxoplasma gondii as the protozoa involved with the symptoms and in one of them Sarcocystis neurona was detected. None was found positive for Neospora spp. All samples collected were examined using histopathological techniques looking for disease findings. Positive samples for S. neurona or T. gondii showed varied types of alteration (neutrophilic/meningeal inflammatory infiltrate), congestion/edema, hemorrhage, necrosis and malacia, indicating that they were affected by a neurotropic pathogen. The frequency of parasitic equine encephalitis using nested PCR-ITS1 was 7,9% (13/165) and abortion by protozoa (T. gondii was 9,5% (2/21). The incidence of these diseases may be higher than registered nowadays if equine CNS could be analyzed during clinical diagnosis routine for case conclusion.

A encefalopatia hepática (EH) é um conjunto de manifestações neuropsiquiátricas associada a um quadro de insuficiência hepática. Essas manifestações são atribuídas sobretudo à elevação nos níveis de amônia no Sistema Nervoso Central (SNC), causando distúrbios na homeostase dos neurotransmissores, edema cerebral, neuroinflamação e aumento do estresse oxidativo. A perda de função do fígado pode acontecer de forma aguda ou insidiosa, acarretando diferentes respostas no SNC relacionadas à elevação aguda ou crônica da amônia. Um dos neurotransmissores envolvidos na fisiopatologia desta síndrome é o glutamato, o principal neurotransmissor excitatório do SNC. A excitotoxicidade glutamatérgica está presente em ambas as apresentações da encefalopatia hepática. A Guanosina, um nucleosídeo derivado da guanina, é conhecida por apresentar uma função neuroprotetora no sistema nervoso central, agindo como um antagonista do sistema glutamatérgico através do aumento da captação de glutamato, além de possuir efeitos tróficos e antioxidantes em células neurais. Desta forma, nesta tese, avaliaram-se um modelo de EH crônica (ligação do ducto biliar de ratos); e um de hiperamonemia aguda (administração intra peritoenal de amônia em ratos). No quadro de EH crônica, o tratamento com Guanosina resultou em uma melhora no teste comportamental Y maze, diminuição do glutamato no líquor e redução dos marcadores de estresse oxidativo. Já no modelo de hiperamonemia aguda, quadro muto semelhante à EH aguda, a Guanosina diminuiu o tempo em coma, normalizou as alterações do eletroencefalograma, aumentou a captação de glutamato, normalizou os níveis de glutamato e amônia no líquor, atenuou o estresse oxidativo e diminuiu a mortalidade. Para o nosso conhecimento, os resultados dessa tese são a primeira descrição do efeito neuroprotetor da Guanosina na EH, com importante contribuição para o estudo da doença. Além disso, surge como potencial alternativa terapêutica a ser estudada para quadros de insuficiência hepática grave em que muitas vezes somente o transplante hepático pode evitar uma deterioração neurológica irreversível. / Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric syndrome associated with liver disease. Increasing of ammonia in the Central Nervous System (CNS) is the main implicated mechanism, resulting in cerebral edema, neurotransmitters disturbance, neuroinflamation and oxidative stress damage. Hepatic insufficiency may be developed suddenly or subtle, resulting in acute or chronic hyperammonemia. Glutamate, the main excitatory neurotransmitter in the CNS plays a major role in the physiopathology of this syndrome. Glutamatergic excitotoxicity is described in both presentations: acute and chronic encephalopathy. As Guanosine plays an important neuroprotective role in the CNS, exerting glutamatergic system antagonism, antioxidant activity and trophic effects on neural cells, in this study, we evaluated the neuroprotective effects of Guanosine on an animal model of hepatic encephalopathy. Initially, we demonstrated that Guanosine was neuroprotective against chronic hepatic encephalopathy (rats were submitted to bile duct ligation) once it has improved a behavioral test performance (Ymaze) and normalized cerebrospinal fluid (CSF) glutamate and brain oxidative stress parameters. Additionally, it was also investigated the Guanosine effects on acute hyperammonemia (rats were injected with ammonium acetate). The treatment was able to decrease oxidative stress damage, reduce glutamate and ammonia levels on CSF, increase glutamate uptake and improve neurological status in rats with severe acute hyperammonemia. Besides, Guanosine prevents death against acute hyperammonemia. Token altogether, we argue that Guanosine neuroprotective effect is related to its ability to antagonizing glutamatergic excitotoxicity by increasing glutamate uptake. Overall, to our knowledge, this is the first study presenting the neuroprotective effects of Guanosine on hepatic encephalopathy. Furthermore it could eventually be developed as a drug useful for helping severe hepatic encephalopathy, which, in many cases, liver transplant is the only alternative.

As plantas tóxicas continuam entre as principais causas de morte em bovinos no Brasil. Elas apresentam efeito relativamente específico sobre os tecidos e/ou sistemas. Várias plantas tóxicas do Brasil causam dano hepático, de forma aguda ou crônica, muitas vezes acompanhado de encefalopatia hepática, cuja patogenia ainda não havia sido elucidada nos casos de hepatopatia tóxica aguda em bovinos. O presente estudo teve como objetivo caracterizar microscopicamente as alterações encefálicas relacionadas a hepatopatias tóxicas em bovinos e resultou em três artigos. O primeiro deles descreve alterações encefálicas histológicas em bovinos com intoxicação espontânea por Cestrum intermedium e suas características na avaliação imuno-histoquímica (IHQ), com emprego dos anticorpos anti-proteína S100 e anti-proteína glial fibrilar ácida. No segundo artigo são caracterizadas as alterações encefálicas de 22 bovinos intoxicados natural ou experimentalmente por cinco espécies de planta de ação hepatotóxica aguda ou pela ingestão de P. flavipes, com avaliação de telencéfalo, tronco encefálico e cerebelo pelas técnicas de hematoxilina e eosina (HE), histoquímicas de ácido periódico de Shiff (PAS) e lectinas e pelas provas de IHQ usando os anticorpos anti-S100, anti-GFAP e anti-vimentina. Neste artigo são evidenciadas alterações relevantes em astrócitos, tanto da substância branca quanto da cinzenta e se demonstra serem os mesmos o principal alvo de lesão na hepatopatia tóxica aguda em bovinos, evidenciado pela IHQ. As técnicas histoquímicas citadas não apresentaram resultados promissores, por isso não são apresentadas no Artigo 2. No terceiro artigo é realizada avaliação comparativa de encéfalos de bovinos intoxicados por Senecio sp. com uso das mesmas técnicas e que demonstrou não haver alterações significativas em astrócitos e estruturas vasculares encefálicas, reiterando a patogenia anteriormente proposta, de que a degeneração esponjosa, alteração histológica encefálica amplamente descrita nessa intoxicação, é caracterizada por edema intramielínico. / Toxic plants remain among the major causes of death in cattle in Brazil. They have relatively specific effects on animal tissues or systems. Several Brazilian poisonous plants cause acute or chronic liver damage, often accompanied by hepatic encephalopathy, the pathogenesis of which was not yet elucidated in cases of acute toxic liver disease in cattle. This study resulted in three articles. The first describes histological findings in brains of cattle poisoned by Cestrum intermedium and their immunohistochemical characteristics using the anti-protein S100 and anti-glial fibrillary acidic protein markers. The second article characterizes changes in the brain from 22 cattle natural or experimentally poisoned by five plant species with acute hepatotoxic effects or by the ingestion of P. flavipes larvae. Hematoxylin and eosin stained slides of cerebrum, brainstem and cerebellum were evaluated, as well histochemical preparations stained with periodic acid Schiff or lectins and immunohistochemical evaluation employing anti-S100, anti-GFAP and anti-vimentin markers. These histochemical techniques did not show promising results, so these are not shown in the second article. Relevant changes were observed in astrocytes from white and gray matter, presenting these cells as the main target of injury in acute toxic liver disease in cattle. The third paper presents a comparative evaluation of the brains of ten cattle poisoned by Senecio sp. using the same techniques. There were no significant changes in astrocytes and brain vascular structures, backing up the pathogenesis previously proposed; that the histological brain changes identified as spongy degeneration, largely described in this poisoning, are characterized by intramyelinic edema.

Dissertação (mestrado profissional) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Cuidados Intensivos e Paliativos, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-01-24T03:11:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343726.pdf: 1604281 bytes, checksum: 5fcb6d0e0f0e62e1ced40d6580a93858 (MD5) Previous issue date: 2016 / Introdução: A encefalopatia hepática (EH) é uma das complicações mais comuns da cirrose, porém o significado clínico e prognóstico da progressão do estado mental em cirróticos hospitalizados ainda é desconhecido. Objetivos: investigar o significado prognóstico da avaliação seriada da EH em pacientes hospitalizados por descompensação aguda (DA) da cirrose. Métodos: Os pacientes (n = 293) foram submetidos a avaliações seriadas da EH durante a internação (primeiro e terceiro dia) e classificados da seguinte forma: 1) evolução favorável: EH ausente na admissão e no terceiro dia ou qualquer melhora da EH; 2) evolução desfavorável: aparecimento da EH no terceiro dia ou EH presente na admissão e estável/pior no terceiro dia. Resultados: Evolução desfavorável da EH foi observada em 31% da amostra e foi associada na análise de regressão logística à antecedente de EH (OR 1.919, IC 95% 1,116-3,299, P = 0,018), Child-Pugh C (OR 1.851, IC 95% 1,044 - 3,157, P= 0,035) e insuficiência hepática crônica agudizada (IHCA) (OR 2.982, IC 95% 1,646 - 5,404, P < 0,001). Evolução desfavorável da EH (OR 2.318, IC 95% 1,237 - 4,342, P = 0,009) e MELD (OR 1.203, IC 95% 1,141 - 1,269, P < 0,001) foram associados de forma independente à mortalidade em 90 dias. A probabilidade de sobrevida de Kaplan-Meier em 90 dias foi de 91% nos pacientes com MELD < 18 e progressão favorável da EH contra apenas 31% naqueles com MELD = 18 e progressão desfavorável da EH. Progressão desfavorável da EH também foi associada à menor sobrevida entre pacientes com ou sem IHCA. Piora da escala de coma de Glasgow no terceiro dia foi observada em 11% da amostra e também foi associada com elevada mortalidade (69% vs. 27%, P < 0,001). Conclusão: Em cirróticos hospitalizados por DA, evolução desfavorável da EH durante a internação foi associada à elevada mortalidade no curto prazo e pode auxiliar no avaliação do prognóstico.<br> / Abstract : Background & Aims: Hepatic encephalopathy (HE) is a frequent complication of cirrhosis, but the clinical and prognostic significance of the progression of mental status in hospitalized cirrhotics is unknown. We aimed at investigate the prognostic significance of serial evaluation of hepatic encephalopathy in patients hospitalized for acute decompensation (AD) of cirrhosis. Methods: Patients (n = 293) were evaluated for HE (West-Haven criteria) at admission and third day and classified in two groups: 1) Favorable progression: HE absent at admission and at third day or any improvement at third day; 2) Unfavorable progression: Development of HE or HE present at admission and stable/worse at third day. Results: Unfavorable progression of HE was observed in 31% of patients and was independently associated with previous HE (OR 1.919, 95% CI 1.116-3.299, P = 0,018), Child-Pugh C (OR 1.851, 95% CI 1.044 ? 3.157, P= 0,035) and acute-on-chronic liver failure (ACLF) (OR 2.982, 95% CI 1.646 ? 5.404, P < 0,001). MELD score (OR 1.203, 95% CI 1.141 ? 1.269, P < 0,001) and unfavorable progression of HE (OR 2.318, 95% CI 1.237 ? 4.342, P = 0,009) were independently associated with 90-day mortality. The Kaplan-Meier survival probability at 90-day was 91% in patients with MELD < 18 and favorable progression of HE and only 31% in subjects with both MELD = 18 and unfavorable progression of HE. Unfavorable progression of HE was also related to lower survival in patients with or without ACLF. Worsening of GCS at third day was observed in only 11% of the sample and was related with significantly high mortality (69% vs. 27%, P < 0.001). Conclusion: Among cirrhotics hospitalized for AD, unfavorable progression of HE was associated with high short-term mortality and therefore can be used for prognostication and to individualize clinical care.

Orientador: Luiz Eduardo Gomes Garcia Betting / Resumo: O padrão eletroencefalográfico mais comum em pacientes críticos é o distúrbio da atividade de base. Ondas trifásicas (OTs) constituem um padrão periódico classicamente relacionado às encefalopatias metabólicas. A maioria dos pacientes com OTs tem alteração do nível de consciência, e acredita-se que este padrão represente disfunção tálamo-cortical. Entretanto, o significado exato e o mecanismo das OTs permanecem desconhecidos. O objetivo principal deste estudo foi avaliar a origem das OTs utilizando o eletroencefalograma quantitativo (EEGq) e a tomografia computadorizada de crânio (TCC). 28 pacientes foram investigados. A análise dos focos das OTs foi realizada nas descargas promediadas para cada um dos indivíduos. Os mapas dos focos foram extraídos desta avaliação. As TCs foram submetidas à normalização e segmentação automática da substância cinzenta. Finalmente, uma análise de correlação voxel-a-voxel de todo o grupo foi realizada entre os mapas dos focos das OTs e as imagens da substância cinzenta. A análise do foco mostrou envolvimento principalmente do cíngulo anterior. A análise de correlação revelou áreas de correlação moderada positiva (giro do cíngulo posterior; r = 0,5) e negativa (caudado; r = -0,51) entre os métodos. / Abstract: The most frequent electroencephalographic pattern in critically ill patients is diffuse background slowing. Triphasic waves (TW) is a periodic pattern classically described in metabolic encephalopathic patients. Most patients with TW have altered level of consciousness, and this pattern is believed to represent thalamus-cortical dysfunction. However, the exact meaning and mechanism of TWs remains unknown. The main objective of this study was to evaluate the source of TWs using quantitative electroencephalogram (qEEG) and tomography (CT). 28 patients were investigated. Source analysis was performed in the averaged TWs for each individual. Source maps were extracted from this evaluation. CTs were submitted to normalization and automatic segmentation of gray matter. Finally, voxel-wise correlation analysis for the whole group was conducted between qEEG source maps and gray matter images. Source analysis showed involvement mainly of the anterior cingulate cortex. Correlation analysis disclosed moderate positive (posterior cingulate; r = 0.5) and negative (caudate; r = -0.51) correlations between the methods. / Mestre