The purpose of this investigation was to characterize the activities of three enzymes, aromatase, estrone (E1) sulfotransferase and E] sulfatase, in the porcine placenta and endometrium on d 30, 60 and 90 of gestation. These enzymes play key roles in determining in utero concentrations of estrogens. Days 30, 60 and 90 were chosen because previous investigations had determined that these were times of substantial changes in in vitro estrogen production by the porcine placenta and endometrium. / Master of Science

Ziel dieser Studie war die Etablierung einer Kokultur aus equinen endometrialen Epithel- und Stromazellen. Nach der erfolgreichen Umsetzung des Kokulturmodells sollte im weiteren Versuchsablauf durch die Zugabe von 17β-Östradiol (E2) und/oder Progesteron (P4) zum Nährmedium der Einfluss der Hormone auf die Zellen untersucht werden. Neben einer lichtmikroskopischen Auswertung der zytomorphologischen Charakteristika beider Zellarten sollte die Expression der Steroidhormonrezeptoren Östrogenrezeptor α und Progesteronre-zeptor sowie der uterinen Proteine Uteroglobin und CalbindinD9k immunzytologisch überprüft werden. Für die Etablierung der Kokultur wurden Endometriumproben von lebenden (n = 5) sowie frischtoten (n = 4) Stuten gewonnen. Eine jeweils parallel entnommene Gewebeprobe von jedem Tier wurde in Formalin fixiert und diente als Referenzmaterial (in situ). Auf die Zelliso-lierung (mechanisch und enzymatisch) folgte die Separation von Epithel- und Stromazellen (EZ/SZ) mittels Filtration, Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz. An-schließend wurden die EZ auf die Außenseite von Millicell®-Membraneinsätzen aufgebracht. Nach zwei Tagen erfolgte das Einsäen der bis zu diesem Zeitpunkt separat kultivierten SZ auf die Innenseite der Membranen. Als Nährmedium diente ein Gemisch aus DMEM und Ham’s F-12, wobei diesem 2,5 % fötales Kälberserum sowie verschiedene Additive zugesetzt wurden. Ab Kulturtag 4 wurden dem Medium definierte Konzentrationen und Kombinationen von E2 und P4 zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei einem CO2-Partialdruck von 5 % in 37 °C warmer wasserdampfgesättigter Raumluft. Mit der polarisationsmikroskopisch er-fassbaren Ausbildung durchgehender Zellrasen („scheinbare Konfluenz“) wurden die Kokul-turen in Formalin fixiert und für die Lichtmikroskopie aufgearbeitet. Das Ausgangsgewebe zeigte mehrheitlich eine sekretorische Funktionsmorphologie (n = 6). Einzelne Endometrien befanden sich in einem Übergangsstadium von der Sekretions- zur Proliferationsphase (n = 1), bzw. vice versa (n = 1) oder wiesen eine irregulär proliferative Differenzierung (n = 1) auf. Im Rahmen der Kokultivierung bildeten die EZ innerhalb der Schnittebene vier und die SZ drei verschiedene morphologische Zelltypen aus. Dabei traten rundovale bis polygonale EZ (Typ 1) selten bis gelegentlich, spindelförmige EZ (Typ 2) gelegentlich bis häufig und iso-prismatische (Typ 3) sowie mehrschichtig wachsende EZ (Typ M) jeweils selten auf. Die SZ zeigten innerhalb der Schnittebene selten eine rundovale bis polygonale Zellform (Typ 1), sehr häufig eine spindelförmige Morphologie (Typ 2) und selten ein mehrschichtiges Wachstum (Typ M). Ein Zusammenhang zwischen der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung oder dem Hormonzusatz und der Häufigkeitsverteilung der Zell-typen sowie der Wachstumsgeschwindigkeit der kultivierten Zellen war nicht offensichtlich. Zytokeratin 19 wurde stets von EZ exprimiert, während es auf Seiten der SZ nur sporadisch in maximal 5 % der Zellen im Bereich mehrschichtig wachsender Zellrasen auftrat. Die Stero-idhormonrezeptoren konnten lediglich in einzelnen Kokulturen aus sekretorisch differenzier-tem Ausgangsgewebe detektiert werden. Uteroglobin wurde in vitro mit einer variablen Häufigkeit in den EZ-Typen exprimiert. Während ein übergreifender Zusammenhang zur hormonellen Supplementierung nicht abgeleitet werden konnte, wurde jedoch ersichtlich, dass im Bereich einschichtig wachsender EZ in Ansätzen aus sekretorisch differenzierten Endometrien unter niedrigen Hormondosen (Zusatz von entweder nur E2 oder nur P4) im Median häufiger Uteroglobin exprimiert wurde. Mit zunehmender Hormonkonzentration im Medium nahm der Anteil immunopositiver Zellen (Typen 1, 2 und 3) deutlich ab. Innerhalb der Stromazellpopulation wurde Uteroglobin selten und ausschließlich in Zellen aus sekretorisch differenziertem Ausgangsmaterial nachgewiesen. CalbindinD9k wurde in vitro vornehmlich intrazytoplasmatisch und sehr vereinzelt intranukleär exprimiert. Insgesamt konnte das Protein in vitro stets in wenigen Typ-1-EZ, sehr selten in Typ-2-EZ und in einer geringen bis mäßigen Anzahl von Typ-3- und Typ-M-EZ beobachtet werden. Innerhalb der Stromazellpo-pulation trat CalbindinD9k ausschließlich in einer geringen (Endometrien aus dem Östrus) bis mäßigen (Endometrien aus dem Interöstrus) Anzahl der Typ-2- und wenigen Typ-M-SZ auf. Insgesamt wurden keine deutlichen Einflüsse der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung und/oder der hormonellen Supplementierung in vitro auf die im-munzytologischen Charakteristika der kokultivierten Zellen ersichtlich. Abschließend betrachtet, konnte ein Kokultursystem equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen erfolgreich etabliert und charakterisiert werden. Es bietet dabei, trotz der z. T. fehlenden Kongruenz zu den Gegebenheiten in situ, Ansätze für potenzielle Folgearbeiten, insbesondere hinsichtlich der Erfassung interzellulärer Wechselwirkungen sowie bezüglich der Vermittlung und Wirkung hormoneller Einflüsse auf zellulärer Ebene. / The aim of the present study was the establishment of a coculture system of equine endome-trial epithelial and stromal cells. Subsequent to the successful development of the coculture model the culture medium should be supplemented with 17β-estradiol (E2) and/or progester-one (P4) in order to study the influence of the hormones on the cellular level. In addition to the examination of cytomorphological characteristics of both cell types via light microscopy, the expression of the steroid hormone receptors (estrogen receptor α and progesterone receptor) as well as of the uterine proteins Uteroglobin and CalbindinD9k was investigated. For the establishment of the coculture system endometrial samples were obtained from living (n = 5) as well as freshly deceased mares (n = 4). A simultaneously taken tissue specimen of each animal was fixed in formalin and served as in situ reference material. After an initial mechanical and enzymatical isolation the epithelial and stromal cells (EC/SC) were separat-ed via filtration, density gradient centrifugation and differential adhesion. Subsequently, the EC were applied to the outer surface of Millicell® inserts. The SC were cultivated separately for 2 days before they were seeded onto the inner surface of the same insert. The culture medium used was comprised of a DMEM and Ham‘s F-12 basis as well as 2.5 % foetal calf serum and different additives. Starting on day 4 of cultivation the standardised medium was supplemented with different concentrations and combinations of E2 and P4. Throughout the study the cultures were kept in a humidified atmosphere of 37°C and a 5 % partial pressure of carbon dioxide. Once the cocultures formed continuous cell layers, as determined via a polarisation microscope (“apparent confluency”), the membranes were fixed in formalin and routinely processed for light microscopical evaluation. The initial tissue samples predominantly showed a secretory functional morphology (n = 6), while single specimens were obtained during the transition from the secretory to the prolifera-tive phase (n = 1) or vice versa (n = 1). One endometrial sample exhibited an irregular proli-ferative differentiation. In the course of cocultivation the EC formed 4 and the SC 3 different cellular morphologies within the section plane. EC with a round-oval to polygonal cell form (type 1) were rarely to occasionally encountered, while spindle-shaped EC (type 2) were occasionally to frequently seen and EC with a cuboidal morphology (type 3) as well as such cells growing in stratified layers (type M) were only infrequently detected. The SC only rarely showed a round-oval to polygonal cell form (type 1) or areas of a stratified cell growth (type M), whereas spindle-shaped SC (type 2) were observed very often. A correlation of the endometrial functional morphology at the time of cell isolation or the hormonal supplementation and the frequency distribution of the cell types as well as the growth rate of the cultivated cells was not evident. The EC always expressed Cytokeratin 19, while on the side of the SC only up to 5 % of the cells in areas of stratified cell growth exhibited this filament. Solely in individual cocultures from secretory differentiated endometrial tissue the steroid hormone receptors could be de-tected. Uteroglobin was expressed in vitro in EC with a variable frequency. An overall corre-lation of the hormonal supplementation and the Uteroglobin expression could not be derived. However, under low hormone doses (only E2 or only P4 supplement) Uteroglobin was detect-ed in EC in areas of single-layered cell growth more often (median value). With an increase in hormone concentration the amount of immunopositive cells (types 1, 2 and 3) diminished noticeably. In SC the protein could only rarely be seen and exclusively in cells from endome-tria with a secretory functional morphology. In vitro CalbindinD9k was predominantly detected intracytoplasmatically, while single cells showed an additional intranuclear expression. Alto-gether, CalbindinD9k could always be observed in a few type-1-EC, rarely in type-2-EC and with a variable frequency in small to moderate numbers of type-3- and type-M-EC. In SC the protein was exclusively expressed in a small (endometrial samples form the oestrous phase) to moderate (endometrial tissue from the interoestrous phase) number of type-2-SC and a few type-M-SC. Generally, no distinct influence of the endometrial functional morphology at the time of tissue sampling and/or of the hormonal supplementation in vitro on the immuno-cytochemical characteristics of the cocultured cells could be observed. In summary, a coculture system of primary equine endometrial epithelial and stromal cells was successfully established and characterised. Despite of the partly absent congruence to the in situ conditions/prerequisites, the present study offers a basic approach and scaffold for further investigations, particularly regarding the ascertainment of intercellular dependencies or the mediation and effectiveness of hormonal influences on the cellular level.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Intrauterine Bälle („small uterine device“; IUDs) sind aus Glas, Plastik oder Metall und wer-den vaginal in den Uterus eingeführt. Bei Stuten werden IUDs im Turniersport zur Unterdrü-ckung der unerwünschten Verhaltensänderungen während der Rosse eingesetzt. Der Einsatz ist einfach, günstig und minimal invasiv. Der Effekt wird durch eine Verlängerung der primären lutealen Phase erzielt, wobei jedoch der exakte Ablauf des Wirkmechanismus bisher ungeklärt ist. Hypothesen wie eine Scheinträchtigkeit, ein Placeboeffekt bei den Besitzern und eine chronische Endometritis werden in der Literatur diskutiert. Für die Untersuchung wurden 30 Stuten in vier Gruppen (G) eingeteilt: G1: KB (künstlich besamt) und tragend (n=8); G2: KB, nicht-tragend (zyklisch; n=7); G3: IUD, verlängerte luteale Phase (n=7) IUD-P (IUD-Positiv); G4: IUD, reguläre luteale Phase (n=8) IUD-N (IUD-Negativ). Die Uterusbiospien wurden am Tag 15 post ovulationem entnommen. Das Ziel der Studie war, mittels immunhistologischer Untersuchungen die Expression des Enzyms Cyclooxygenase 2 (COX2), verschiedener uteriner Proteine (Uteroglobin, Uterofer-rin, Uterokalin), Hormonrezeptoren (Östrogen-, Progesteronrezeptor) und des Proliferations-markers Ki-67 Antigen in endometrialen Biopsien bei IUD-Stuten darzustellen sowie die erhobenen Befunde mit den Ergebnissen am equinen Endometrium künstlich besamter Stuten zu vergleichen. Weiter wurde in den Endometriumbioptaten das Auftreten von Entzündungszellen analysiert (neutrophile und eosinophile Granulozyten, Mastzellen, Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen). Die statistische Auswertung erfolgte mittels SPSS (SPSS Software-GmbH München). Hinsichtlich der Altersverteilung sind die Stuten der Gruppe 1 (KB/tragend) jünger als Tiere der Gruppe 2 (KB/nicht-tragend). Ein entsprechendes Ergebnis kann für die Stuten der Grup-pe 3 (IUD-P) im Vergleich zu den Tieren der Gruppe 4 (IUD-N) erhoben werden. Darüber hinaus sind Angiopathien bei den Pferden der Gruppe 1 bzw. 3 geringer ausgeprägt als bei den Stuten der Gruppe 2 bzw. 4. Immunhistologisch sind die endometrialen Drüsenzellen der Tiere aus Gruppe 1 durch eine maximale Uterokalin-(UK)-Expression gekennzeichnet, wohingegen Uteroferrin (UF) ledig-lich schwach exprimiert wird. Eine COX2-Expression kann bei diesen Stuten nicht beobachtet werden. Im Vergleich zu den graviden Pferden (Gruppe 1) zeigen künstlich besamte, nicht-tragende Stuten (Gruppe 2) zwar eine ausgeprägte UF- und COX2-Expression, UK wird dagegen lediglich gering exprimiert. Die KB-tragenden (Gruppe 1) und nicht-tragenden (Gruppe 2) Tiere sind somit durch eine ihrem Reproduktionszyklus entsprechende Expression der genannten Marker gekennzeichnet. Die IUD-Stuten (Gruppe 3 und 4) dagegen zeigen eine variable COX2, UF- und UK-Expression. Keine statistisch signifikanten Unterschiede sind zwischen allen Gruppen in der UG- und der Ki-67 Antigen-Expression nachweisbar. Stuten mit einer verlängerten lutealen Phase (Gruppe 1 und 3) und hohen Progesteronwerten im Serum besitzen eine geringere ER- und PR-Expression als die Versuchstiere mit einer regulären lutealen Phase (Gruppe 2 und 4) und einer Östrogendominanz. Die Auszählung der Entzündungszellen zeigt keine statistisch signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anzahl von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, Mastzellen, Plasmazellen sowie Lymphozyten zwischen den Gruppen. Im Stratum compactum ist die Zahl der Makrophagen in Gruppe 1 (tragend) signifikant höher als in Gruppe 2 (zyklisch), ebenfalls zeigt sich ein Anstieg dieser Zellen von der Gruppe 4 zu 3, allerdings ist diese Erhöhung nicht statistisch signifikant. Ein Placeboeffekt bei den Besitzern kann nahezu ausgeschlossen werden, da die Expression der Proteine (UF, UK) und COX2 in den IUD-Stuten, im Vergleich zu den KB-Stuten, signi-fikante Unterschiede aufweist. Da im eigenen Untersuchungsgut zwischen den tragenden Stuten (Gruppe 1) und den IUD-Stuten der Gruppe 3 (vlP)/“Scheinträchtigkeit“ ein signifikant unterschiedliches Expressionsverhalten hinsichtlich des Enzyms COX2 und des Proteins UF besteht, kann die Hypothese einer Scheinträchtigkeit ebenso als unwahrscheinlich eingestuft werden. Bei keiner der IUD-Stuten konnte eine chronische Endometritis nachgewiesen werden, somit ist auch diese Hypothese als Ursache des IUD-Effektes eher unwahrscheinlich. Die erhöhte Anzahl an Makrophagen in der Gruppe 3 könnte jedoch hinweisend auf einen lokalen Effekt der IUDs im Sinne einer Fremdkörperreaktion sein. Da hinsichtlich des Auftretens einer Endometritis zwischen resistenten und empfänglichen Tieren unterschieden wird, könnte somit die erhöhte Anzahl an Makrophagen in der Gruppe 3 möglicherweise als Hinweis auf „Endometritis empfängliche Stuten“ gewertet werden und dies eine Ursache für die variierende Wirksamkeit der Rosseunterdrückung mittels IUDs darstellen. Die eigenen Untersuchungen zeigen ferner, dass die IUD-Stuten mit verlängerter lutealer Phase (IUD-positive Wirkung, Gruppe 3) jünger sind im Vergleich zu den Tieren, die trotz IUD eine Luteolyse (IUD-negative Wirkung, Gruppe 4) aufweisen. Zudem weisen die IUD-P Tiere geringere An-giopathien auf. Möglicherweise sind zudem das Alter und die Perfusion des Uterus bedeutend für die Wirksamkeit der IUDs in Equiden. Abschließend kann somit der Wirkmechanismus der IUDs auch mittels der durchgeführten Untersuchungen nicht endgültig geklärt werden. Unter Berücksichtigung der erhobenen Be-funde sollten zukünftige Studien insbesondere Untersuchungen zu Entzündungsmediatoren, wie z.B. Zytokine, beinhalten.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VI 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Rosseunterdrückung bei Pferden 2 2.2 Sexualzyklus und Gravidität der Stute 3 2.2.1 Der Sexualzyklus der Stute 3 2.2.2 Die equine Gravidität 3 2.2.3 Endokrine Regulation des Sexualzyklus und der frühen Trächtigkeit 6 2.2.3.1 Luteolyse und maternale Trächtigkeitserkennung 7 2.2.4 Immunhistologische Untersuchungen des Endometriums im Zyklusverlauf und während der Gravidität 9 2.2.4.1 Östrogen- und Progesteronrezeptoren 9 2.2.4.2 Ki-67 Antigen 10 2.2.4.3 Cyclooxygenase 2 10 2.3 Sekretorische Aktivität des Uterus 11 2.3.1.1 Uterokalin 11 2.3.1.2 Uteroferrin 12 2.3.1.3 Uteroglobin 13 2.4 Pathologie des equinen Endometriums 14 2.4.1 Histopathologische Veränderungen 14 2.4.1.1 Endometrose 14 2.4.1.2 Endometritis 16 2.4.2 Zelluläre Infiltrationen 17 2.4.2.1 Neutrophile Granulozyten 17 2.4.2.2 Makrophagen 18 2.4.2.3 Lymphozyten und Plasmazellen 18 2.4.2.4 Mastzellen 19 2.4.2.5 Eosinophile Granulozyten 19 2.4.3 Endometriumbiopsie als diagnostisches Mittel 20 2.5 Rosseunterdrückung bei Pferden 22 2.5.1 Methoden zur Rosseunterdrückung 22 2.5.2 Intrauterine devices (IUDs) 23 2.5.2.1 Allgemeine Betrachtung 23 2.5.3 IUDs zur Rosseunterdrückung bei Pferden 24 2.6 Fazit aus der Literatur bezogen auf die initiale Fragestellung dieser Arbeit 30 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 31 3.1 Tiergut, Material und Probenherkunft 31 3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes 31 3.3 Methoden 32 3.3.1 Probenentnahme und Probenaufbereitung 32 3.3.2 Anfertigung und Färbung der Schnitte 34 3.3.3 Lichtmikroskopische Auswertung und Kategorisierung 34 3.4 Histologische Spezialfärbungen 36 3.4.1 Unna-Pappenheim-Färbung (Methylgrün-Pyronin-Färbung) zur Identifizierung von Plasmazellen 36 3.4.2 Panoptische Färbung nach Pappenheim (kombinierte May-Grünwald-Giemsa-Färbung) zur Identifizierung von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten sowie Mastzellen 36 3.5 Immunhistologische Methoden 37 3.5.1 Immunhistologische Kontrollen 37 3.5.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchung 37 3.6 Statistische Untersuchung 39 4 ERGEBNISSE 40 4.1 Anamnestische Untersuchungsbefunde 40 4.1.1 Zusammensetzung der Gruppen 40 4.1.2 Altersverteilung 41 4.2 Histopathologische Untersuchungsbefunde am Endometrium 41 4.2.1 Prävalenz der Endometritis im Untersuchungsgut 42 4.2.2 Prävalenz der Endometrose im Untersuchungsgut 43 4.2.3 Prävalenz der Angiosklerose im Untersuchungsgut 44 4.2.4 Kategorisierung 45 4.3 Immunhistologische Untersuchungen der Cyclooxygenase 2 46 4.3.1 Ergebnisse im Gruppenvergleich 47 4.4 Immunhistologische Untersuchungen zum Nachweis der endometrial synthetisierten Proteine 48 4.4.1 Uteroferrin (UF) 48 4.4.1.1 Uteroferrin-Expression im luminalen Epithel und den Zellen der Ausführungsgänge 49 4.4.1.2 Uteroferrin-Expression in den Drüsenzellen 49 4.4.1.3 Gesamtscore der Uteroferrin-Expression 50 4.4.1.4 Ergebnisse im Gruppenvergleich 51 4.4.1.5 Graduelle Abweichung des Ssc in der Endometrose 53 4.4.2 Uterokalin (UK) 53 4.4.2.1 Uterokalin-Expression im luminalen Epithel und den Zellen der Ausführungsgänge 53 4.4.2.2 Uterokalin-Expression in den Drüsenzellen 54 4.4.2.3 Gesamtscore der Uterokalin-Expression 55 4.4.2.4 Ergebnisse im Gruppenvergleich 55 4.4.2.5 Graduelle Abweichung des Ssc in der Endometrose 56 4.4.3 Uteroglobin (UG) 57 4.4.3.1 Uteroglobin-Expression in den basalen Drüsenzellen (bDr) 58 4.4.3.2 Ergebnisse im Gruppenvergleich 59 4.4.3.3 Graduelle Abweichung des Ssc in der Endometrose 60 4.4.4 Zusammenfassung Proteinexpression 61 4.5 Immunhistologische Ergebnisse zum Nachweis von Steroidhormonrezeptoren 62 4.5.1 Östrogenrezeptoren 62 4.5.1.1 Östrogenrezeptor-Expression im luminalen Epithel (LE) und den Ausführungsgängen (AS) 62 4.5.1.2 Östrogenrezeptor-Expression in den Drüsenzellen (DZ) 63 4.5.1.3 Östrogenrezeptor-Expression in den Stromazellen (SZ) 63 4.5.1.4 Ergebnisse im Gruppenvergleich 65 4.5.2 Progesteronrezeptoren 65 4.5.2.1 Progesteronrezeptor-Expression im luminalen Epithel (LE) und den Ausführungsgängen (AS) 66 4.5.2.2 Progesteronrezeptor-Expression in den Drüsenzellen (DZ) 66 4.5.2.3 Progesteronrezeptor-Expression in den Stromazellen (SZ) 66 4.5.2.4 Ergebnisse im Gruppenvergleich 67 4.6 Ki-67 Antigenexpression 67 4.7 Vergleichende histomorphologische und immunhistologische Untersuchung des Endometriums hinsichtlich des Auftretens von Entzündungszellen 68 4.7.1 T-Lymphozyten 68 4.7.1.2 Ergebnisse im Gruppenvergleich 69 4.7.2 B-Lymphozyten 70 4.7.2.1 Ergebnisse im Gruppenvergleich 71 4.7.3 Plasmazellen 72 4.7.3.1 Ergebnisse im Gruppenvergleich 73 4.7.4 Makrophagen 74 4.7.4.1 Ergebnisse im Gruppenvergleich 74 4.7.5 Neutrophile Granulozyten 76 4.7.5.1 Ergebnisse im Gruppenvergleich 77 4.7.6 Eosinophile Granulozyten 78 4.7.6.1 Ergebnisse im Gruppenvergleich 78 4.7.7 Mastzellen 79 4.7.7.1 Ergebnisse im Gruppenvergleich 80 4.7.8 Zusammenfassung der Ergebnisse hinsichtlich der Auszählung der Entzündungszellpopulationen 81 5 DISKUSSION 83 5.1 Ziel der Arbeit 83 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials und der Untersuchungsmethoden 83 5.3 Abschließende Betrachtung der Resultate 84 5.3.1 KB-Stuten 84 5.3.2 IUD-Stuten 86 6 ZUSAMMENFASSUNG 93 7 SUMMARY 95 8 LITERATURVERZEICHNIS 97 9 ANHANG 122 9.1 Charakterisierung des Tiergutes 122 9.2 Immunhistologie 123 9.2.1 Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen 123 9.2.2 Besondere Verfahren 124 9.2.3 Antigennachweis mittels monoklonaler AK nach der Peroxidase-anti-Peroxidase-Methode (PAP) 124 9.2.4 Antigennachweis mittels polyklonaler AK nach der Peroxidase-anti-Peroxidase-Methode (PAP) 124 9.2.5 Standard zur Nachbehandlung 125 9.2.6 Verwendete Antikörper und Seren 126 9.2.7 Lösungen und Puffer 127 10 DANKSAGUNG 129

Einleitung: Ein häufiger Befund in routinemäßig untersuchten Bioptaten equiner Endometrien sind degenerative Alterationen der Blutgefäße in Form von Angiosklerosen. Sie stellen die Ursache einer endometrialen Minderperfusion dar und bedingen Fruchtbarkeitsstörungen. Ziele der Untersuchungen: Der Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung equiner Endometriumproben mit graduell vari-ablen Angiosklerosen. Die Hypothese ist, dass degenerative Gefäßwandveränderungen die Ursache für einen hypoxischen Zustand darstellen. Anhand der Expression von so genannten Hypoxiemarkern sollte das Vorliegen eines potenziellen Sauerstoffmangels in Folge einer Minderperfusion durch degenerative Blutgefäßwandveränderungen überprüft und immunhis-tologisch dargestellt werden. Des Weiteren sollten Zusammenhänge zu anderen Einflussfak-toren wie zum Beispiel dem Zyklusstand, dem Vorliegen einer Trächtigkeit, dem Alter oder einer Endometrose untersucht werden. Tiere, Material und Methoden: Grundlage für diese Untersuchungen waren vor allem equine Endometriumbioptate aus der Routinediagnostik des Instituts für Veterinär-Pathologie. Anhand mittels Pikrosiriusrot gefärb-ter Bioptate wurden Gruppen ohne Alterationen von maximal 5-jährigen Maidenstuten (n = 10) sowie mit ausschließlich graduell variablen Angiosklerosen (jeweils n = 10 mit dezenter, geringgradiger, gering- bis mittelgradiger, mittelgradiger und mittel- bis hochgradiger sowie n = 8 mit hochgradiger Angiosklerose) gebildet. Des Weiteren wurden aus dem Sektionsgut des Instituts Endometriumproben von tragenden Stuten (n = 6), eine weitere Uterusprobe einer trächtig geschlachteten Stute, Bioptate mit gering- bzw. hochgradiger Endometrose in Kombi-nation mit gering- bzw. hochgradiger Angiosklerose (jeweils n = 6) und Bioptate, die an defi-nierten Zyklustagen (Östrus, früher bzw. später Diöstrus) entnommen wurden (jeweils n = 2) entsprechend graduiert. Alle Proben wurden nach erfolgreicher methodischer Etablierung der Antikörper gegen hypo-xia-inducible factor 1α (HIF-1α), Glucosetransporter 1 (GLUT1), vascular endothelial growth factor A (VEGF A) und vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGF-R2) hinsichtlich der Expression dieser Hypoxiemarker immunhistologisch untersucht. Für unterschiedliche Zellpopulationen (luminales Epithel und Zellen der Drüsenausführungsgänge, oberflächliche, mittlere und basale glanduläre Epithelzellen, Stromazellen) und die arteriellen und venösen Blutgefäße (jeweils getrennt nach Intima, Media und Adventitia) wurde markerweise der Im-munreaktive Score (IRS) aus jeweils 10 nebeneinander liegenden Gesichtsfeldern bei 400-facher Vergrößerung (Zellpopulationen) bzw. jeweils 5 Arterien, Arteriolen, Venen und Venulen bestimmt. Die statistische Untersuchung erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS 22 (SPSS Software-GmbH, München). Die Datenvisualisierung wurde mit GraphPad Prism 8 (Graphpad Software Inc., San Diego, Kalifornien, USA) durchgeführt. Ergebnisse: Eine Expression der Hypoxiemarker lässt sich in unterschiedlichen Zellpopulationen darstel-len. HIF-1α ist in nahezu allen Proben im luminalen Epithel, in den Drüsenepithelzellen und in Intima und Media von vor allem arteriellen Gefäßen nachweisbar. Ein nicht signifikanter Trend zu einem höheren IRS zeigt sich erst ab mittel- bis hochgradigen Angiosklerosen in den Drüsenepithelzellen. Demgegenüber lässt sich eine verminderte Expression in der Media von arteriellen Gefäßen erkennen, die für vier Angiosklerose-Gruppen auch statistisch signifikant ist. GLUT1 kann vor allem im Bereich des luminalen Epithels und der Zellen der Drüsenaus-führungsgänge sowie vereinzelt auch in Drüsenepithelzellen nachgewiesen werden. Die ins-gesamt graduell variable Expression sinkt tendenziell mit steigendem Angiosklerosegrad, al-lerdings nicht statistisch signifikant. VEGF A wird von nahezu allen untersuchten Zellpopulati-onen sowie Blutgefäßen und in nahezu allen Proben relativ konstant hoch exprimiert. Zu einer vermehrten Expression kommt es ab Vorliegen einer mittelgradigen Angiosklerose vor allem in den glandulären Epithelzellen, welche bei hochgradiger Angiosklerose auch als statistisch signifikant anzusehen ist. Eine VEGF-R2-Expression lässt sich ebenfalls vorrangig im glan-dulären und luminalen Epithel erkennen, wenngleich sie sich überwiegend geringgradig dar-stellt. Deutliche Unterschiede lassen sich hier in keiner untersuchten Zellpopulation erkennen. Im Zusammenhang mit einer Trächtigkeit zeigen sich Unterschiede in der Expression bei dreien der vier Marker im Bereich des luminalen Epithels und der Zellen der Drüsenausfüh-rungsgänge, also der Schicht, die an der Bildung der feto-maternalen Verbindung beteiligt ist. Im Vergleich zwischen normalen und endometrotischen Drüsen zeigen sich für alle Marker Unterschiede im Expressionsverhalten, die allerdings nicht statistisch signifikant sowie scheinbar unabhängig vom Angiosklerosegrad sind. Eine deutliche Zyklusabhängigkeit konnte nicht nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen: Mittels der durchgeführten Untersuchungen wird deutlich, dass insbesondere schwere Angi-osklerosen für immunhistologisch darstellbare hypoxische Zustände sorgen. Ferner zeigen die eigenen Untersuchungen, dass sich die endometrialen Zellpopulationen hinsichtlich der Ex-pression der untersuchten Marker unterscheiden. Dabei wird außerdem deutlich, dass es nicht zwangsläufig zu dem erwarteten Anstieg der Expression der Hypoxiemarker kommen muss. Aus diesem Grund sollte zur Beurteilung des Vorliegens einer Hypoxie eine Untersu-chung der Expression mehrerer derartiger Marker erfolgen. Ein gänzlicher Ausschluss von anderen Einflussfaktoren als Hypoxie auf die Expression der untersuchten Marker kann im verwendeten Studienaufbau nicht erfolgen. Zukünftige Untersuchungen sollten zum einen einen größeren Probenumfang (insbesondere bei der Untersuchung anderer Faktoren als Angiosklerose) aufweisen sowie zum anderen weitere Hypoxiemarker umfassen. Die unter-suchten Marker spielen wahrscheinlich eine Rolle bei besonderen physiologischen (z. B. Trächtigkeit) als auch pathologischen Prozessen (z. B. Endometrose) im equinen Endometri-um und stellen somit interessante pharmakologische Targets zur positiven Beeinflussung der Reproduktionsleistung oder für die Therapie der equinen Endometrose dar. / Introduction: Degenerative alterations of the blood vessels, especially angiosclerosis, are a common finding in equine endometrial biopsies. They are the cause of an insufficient endo-metrial blood supply and therefore result in fertility problems. Objectives: The subject of this thesis was the examination of equine endometrial specimens with variable degrees of angiosclerosis. The hypothesis is that degenerative changes of the vessel wall are the cause of a hypoxic environment. The presence of a potential lack of oxygen as a result of hypoperfusion because of degenerative changes in the blood vessels was assessed via im-munohistochemistry by examining the expression of so-called markers of hypoxia. In addi-tion, the possible relationship to other factors such as the stage of the estrous cycle, pregnan-cy, age or endometrosis was considered. Animals, material and methods: This study is based on equine endometrial biopsies submitted to the diagnostic service of the Institute of Veterinary Pathology. By the means of picrosirius red stain, biopsy groups without any alterations of maiden mares with a maximum age of 5 years (n = 10) as well as biopsies with solely gradually variable angiosclerosis (n = 10 with minimal, mild, mild to moderate, moderate and moderate to severe, as well as n = 8 with severe angiosclerosis, respecively) have been established. In addition, specimens of pregnant mares from necropsied (n = 6) and slaughtered (n = 1) horses, biopsies with mild and severe endometrosis in combination with mild and severe angiosclerosis (n = 6, respectively) and biopsies taken on certain days of the estrous cycle (estrous as well as early and late diestrous, n = 2, respectively) have been graduated likewise. After their successful methodical establishment, all specimens have been examined im-munohistochemically via antibodies against hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α), glucose transporter 1 (GLUT1), vascular endothelial growth factor A (VEGF A) and vascular endothe-lial growth factor receptor 2 (VEGF-R2) in regard to the expression of those markers for hy-poxia. The immunoreactive score (IRS) for each marker has been determined by examining 10 adjacent high-power fields (400-fold magnification) for the different endometrial cell popu-lations (luminal epithelium and cells of glandular ducts, superficial, mid and basal glandular epithelial cells, stromal cells), and 5 arteries, arterioles, veins, and venules, respectively, sepa-rated by intima, media and adventitia. The statistical analysis has been performed via data analysis software SPSS 22 (SPSS Software-GmbH, Munich). The visualisation of data has been done with GraphPad Prism 8 (Graphpad Software Inc., San Diego, California, USA). Results: Expression of the markers of hypoxia was demonstrated in different cell populations. HIF-1α could be detected in almost every specimen in the luminal and glandular epithelia as well as in the intima and media of blood vessels. A non significant trend towards increased IRS was observed in biopsies with at least moderate to severe angiosclerosis in the endometrial glands. In contrast, a diminished expression was identified in the media of arterial vessels, which was significant in four of the angiosclerosis groups. GLUT1 was detected in the luminal epithelium and the cells of glandular ducts as well as in some glandular epithelial cells. In total the ex-pression was variable, with a trend towards lower levels in cases with higher degrees of angi-osclerosis. VEGF A was constantly expressed on relatively high levels by all of the examined cell populations and blood vessels in almost all examined biopsies. There was a trend towards increased expression in cases with moderate angiosclerosis predominantly in the glandular epithelia, reaching statistical significance in endometrial biopsies which are severely altered by angiosclerosis. An expression of VEGF-R2 could be seen in glandular and luminal epitheli-al cells. Nevertheless, no distinct differences were evident. In endometrial specimens of pregnant mares, expressional differences could be identified for three out of the four examined markers, especially in the luminal epithelium and the cells of glandular ducts, which are involved in the development of the feto-maternal connection. The comparison of normal with endometrotic glands revealed a complex expression pattern of all four examined markers which seemed to be independent of the degree of angiosclerosis. A distinct difference in dependence of the phase of the estrous cycle could not be detected. Conclusions: The current study demonstrated that severe angiosclerosis is the cause of an immunohisto-chemically detectable hypoxic condition. Furthermore, this study showed systematic differ-ences in the expression of the examined markers for the different endometrial cell popula-tions. Notably, the employed markers of hypoxia did not always show the expected increase in parallel with increasing grades of angiosclerosis. For that reason, the expression of multiple markers of hypoxia should be assessed to demonstrate a lack of oxygen in tissue samples using immunohistochemistry. The used study design did not allow the complete exclusion of other factors influencing the expression of the examined markers. Therefore, future studies should contain a larger pool of specimens on the one hand (especially while examining other factors than angiosclerosis) and employ a panel of markers of hypoxia. The examined mark-ers seem to play an important role during physiological (e. g. pregnancy) as well as pathologi-cal processes (e. g. endometrosis) and by that might be rewarding pharmacological targets to positively influence reproduction or to possibly treat equine endometrosis.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die ausführliche histomorphologische Charakterisierung der endometrialen Funktionsmorphologie sowie die Darstellung der Ki-67 Antigen, Östrogen- und Progesteronrezeptor-Expression am Endometrium zyklischer und azyklischer Maultierstuten unter Einbeziehung klinischer und endokrinologischer Daten. Die Ergebnisse sollten mit den zu diesem Thema bereits vorliegenden Erkenntnissen bei der Pferdestute verglichen werden. Zu diesem Zweck wurden 97 Endometriumbioptate von sechs klinisch-gynäkologisch gesunden Maultierstuten im Alter von 13 bis 23 Jahren (immun-)histologisch ausgewertet. Die Bioptate waren zuvor in Abständen von zwei bis zehn Tagen und über einen Zeitraum von 4 Monaten (April bis August 2004), im Fall einer Stute von sieben Monaten (April bis November 2004) entnommen worden. Für jedes der Tiere lagen detaillierte Informationen über die klinisch-gynäkologischen Befunde und die Serumhormonkonzentrationen zu den entsprechenden Entnahmezeitpunkten vor (BARTMANN et al. 2008). Vorberichtlich zeigen zwei der Tiere im Untersuchungszeitraum ein unregelmäßiges Zyklusgeschehen mit ovariellen Funktionskörpern sowie variablen Serumöstradiol- und –progesteronkonzentrationen, bei vier Maultieren wird klinisch eine Azyklie mit inaktiven Ovarien sowie niedrigen, wenig schwankenden Serumhormonwerten dokumentiert. Bei den Tieren der zyklischen Gruppe (n=2) variiert die endometriale Funktionsmorphologie sehr stark. In nahezu allen untersuchten Endometriumbioptaten findet sich eine ausgeprägte endometriale Fehldifferenzierung. Diese kann anhand ihres Erscheinungsbildes nach den bei der Pferdestute bekannten histomorphologischen Kriterien (HÄFNER 1999, SCHOON et al. 1999b) eingeteilt werden. Sie tritt bei den untersuchten Maultieren als irreguläre glanduläre oder aber als irreguläre und ungleichmäßige glanduläre Differenzierung in Erscheinung und wird mit einem inaktiven, sekretorischen oder proliferativen Grundcharakter vorgefunden. Maultierstute 1 zeigt im Untersuchungszeitraum eine variable endometriale Proliferationsaktivität (Marker Ki-67 Antigen), bei Maultierstute 2 ist sie konstant schwach ausgeprägt. Es lässt sich kein charakteristisches, zyklusphasenabhängiges, positiv an die Steroidhormonrezeptorexpression gekoppeltes Expressionsmuster, wie es bei der Pferdestute bekannt ist, nachweisen. Die ER- und PR-Expression zeigt bei den zyklischen Maultierstuten ein sehr variables Bild (insbesondere Maultierstute 1), welches dem bei zyklierenden Pferdestuten während der physiologischen Decksaison nicht entspricht. Aufgrund der Diskrepanz zwischen klinischen Daten, Serumhormonkonzentrationen, endometrialer Funktionsmorphologie und Hormonrezeptorstatus bei den zyklischen Maultierstuten kann festgestellt werden, dass es bei den untersuchten Tieren nicht möglich ist, anhand der morphologisch-funktionellen Gegebenheiten am Endometrium auf den klinischen Zyklusstand zu schließen und vice versa. Die erhobenen Befunde sind in ihrer Gesamtheit am ehesten vergleichbar mit den Verhältnissen bei Pferdestuten in den Übergangszyklen zwischen Winteranöstrus und physiologischer Decksaison. Bei der Gruppe der azyklischen Maultiere (n=4) findet sich in allen untersuchten Endometriumbioptaten eine inaktive endometriale Funktionsmorphologie. Diese passt grundsätzlich zu dem klinischen Vorbericht der Azyklie mit inaktiven Ovarien und niedrigen, wenig schwankenden Serumöstradiol- und -progesteronkonzentrationen. In der Mehrzahl der Bioptate liegt eine Irregularität der glandulären Epithelien vor und in einigen Fällen treten hyperplastische und hypersekretorische Drüsenareale auf. Diese Befunde können, anlehnend an die Erkenntnisse bei der Pferdestute, als Kennzeichen einer endometrialen Fehldifferenzierung interpretiert werden (HÄFNER 1999, SCHOON et al. 1999b). Im Zusammenhang mit der schwachen endometrialen Proliferationsaktivität und der variablen ER- und PR-Expression lässt sich eine deutliche Ähnlichkeit zu den Befunden bei Pferdestuten im Winteranöstrus bzw. im Anöstrus während der physiologischen Decksaison finden (AUPPERLE et al. 2003, GOCKELN et al. 2006). Die möglichen Ursachen der endometrialen Fehldifferenzierung bei den Maultierstuten können im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen nicht abschließend geklärt werden. Es ist jedoch denkbar, dass, analog zur Pferdestute, eine ovariell oder zentral bedingte Dysregulation und/oder eine Störung auf der Effektor/Rezeptor-Ebene vorliegen können. Die Hauptursache für die Infertilität bei Maultierstuten besteht in den chromosomal bedingten Störungen im Ablauf der Meiose der Keimzellen (WODSEDALEK 1916). Aufgrund der eigenen Untersuchungsergebnisse kann jedoch angenommen werden, dass die diagnostizierte endometriale Fehldifferenzierung, die variable Steroidhormonrezeptor-Expression sowie das Vorliegen degenerativer endometrialer Alterationen, z.B. der Endometrose, in Anlehnung an die Erkenntnisse bei der Pferdestute, zusätzliche Faktoren darstellen könnten, die zur Unfruchtbarkeit der Maultiere beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit beruhen jedoch lediglich auf der Untersuchung von sechs Maultierstuten und sollten aus diesem Grund nicht unkritisch auf die Gesamtpopulation der Maultiere übertragen werden. Weitere Verlaufsuntersuchungen an einem größeren Tiergut in verschiedenen Altersgruppen inkl. Betrachtung der Hypophysenhormone FSH und LH könnten zur Aufklärung der Ursache sowie der Bedeutung der endometrialen Fehldifferenzierung für die Infertilität beim Maultier beitragen. / The aim of the present study was a detailed histomorphological characterization of the functional morphology and the evaluation of Ki-67 antigen, estrogen and progesterone receptor expression patterns in the endometrium of cyclic and non-cyclic mule mares, with respect to clinical and endocrinological data. The results were to be compared with corresponding observations in the endometrium of horse mares. For this purpose 97 endometrial biopsies from six clinically and gynaecologically healthy mule mares, aged between 13 and 23 years, were evaluated histologically and immunohistochemically. The biopsies were taken in intervals from two up to ten days over a period of four months (April to August 2004), in one mare over seven months (April to November 2004). Detailed information was given about clinical and gynaecological findings. The serum hormone concentrations for each day of biopsy sampling were determined (BARTMANN et al. 2008). According to the clinical record two of the animals show an erratic estrous cycle associated with the occurrence of corpora lutea and follicles on the ovaries during the whole period of investigation. Additionally, variable plasma estrogen and progesterone values are found. Four mules reveal acyclia including inactive ovaries and constant low serum hormone levels. In the animals of the cyclic group (n=2) the endometrial functional morphology varies to a great extend. In almost every investigated endometrial biopsy a marked endometrial maldifferentiation can be detected. It is classified according to common histomorphological criteria used for the endometrium of horse mares (HÄFNER 1999, SCHOON et al. 1999b). Endometrial maldifferentiation of the mules investigated occurs as irregular glandular or irregular and unequal differentiation and appeares in combination with a proliferative, secretory or inactive functional morphology. Mule 1 shows variable and mule 2 constant low endometrial Ki-67 expression patterns during the period of investigation. In contrast to horses, no characteristic, stage of cycle- or steroid hormone receptor expression-dependent proliferation activity can be observed with the mule mares of the present study. The expression of estrogen and progesterone receptors is highly variable in the animals of the cyclic group (especially in mule 1). These findings do not correspond to the ones in horse mares during the physiological breeding season. Due to the discrepancy between clinical data, serum hormone values, endometrial functional morphology and hormone receptor expression in the investigated mules, a conclusion from the clinical stage of cycle to morpho-functional conditions in the endometrium and vice versa seems to be impossible. The results of the present study are most likely comparable with findings in horse mares during the transitional period between winter anestrus and the physiological breeding season. The mules of the acyclic group (n=4) reveal an inactive endometrial functional morphology in all investigated endometrial biopsies. This finding basically corresponds to the clinical record of acyclia associated with inactive ovaries and rather constant serum estrogen and progesterone concentrations. In the case of these animals a majority of the investigated endometria show irregular glandular epithelia. In some areas hyperplastic and hypersecretory glands can be seen. According to observations in horse mares these findings can be interpreted as signs of endometrial maldifferentiation (HÄFNER 1999, SCHOON et al. 1999b). In connection with the weak proliferation activity and the variable ER- and PR-expression patterns seen in the acyclic mules, these results resemble findings in horses during winter anestrus or anestrus during the breeding season (AUPPERLE et al. 2003, GOCKELN et al. 2006). Within the present study the possible reasons for endometrial maldifferentiation in mules could not be finally evaluated. But it seems possible that, like in horse mares, an ovarian or central dysregulation and/or dysfunction regarding the level of receptors and effectors could play a certain role. Infertility in she-mules is mainly due to the chromosomal abnormalities during meiosis of germ cells (WODSEDALEK 1916). According to the findings in horse mares, the results of this investigation indicate that the diagnosed endometrial maldifferentiation, the variable expression of steroid hormone receptors and the presence of endometrial degenerative lesions (e.g. endometrosis) could be additional factors that possibly lead to sterility in mule mares, too. Due to the small number of individuals examined in this study, the results should not uncritically be applied to the whole population of mules. Further clinical, histological and immunohistochemical investigations, including the pituitary hormones FSH and LH as well as the use of a larger number of animals at different stages of age, could lead to a better understanding of the causes of endometrial maldifferentiation and its relevance for the infertility in mules.

In der Schweinezucht werden konventionell 1-3 x109 Spermien als Frischsamen in einem Volumen von 80-100 ml intrauterin versamt. Im Vergleich zur Rinderbesamung, bei der mitunter 2 x106 Spermien zu Trächtigkeiten führen, sind Ejakulate von Ebern ineffizient. Die einzige Möglichkeit geringe Spermienzahlen erfolgreich zu versamen besteht darin die Spermienablage nahe dem Ort der Befruchtung im distalen Isthmus des Eileiters durchzuführen. Die spezies-spezifische Bindung von Säugerspermien an diverse Oberflächenzellen des weiblichen Traktes, die der Kapazitation und Hyperaktivierung vorangehen, setzt die Erkennung von Kohlenhydraten durch lektin-ähnliche Proteine der Spermienplasmamembran voraus Daher wurde vermutet, dass eine mutmaßliche Bindung porziner Spermien an das Uterusepithel ebenfalls Protein-Kohlenhydrat vermittelt ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines Zellkulturmodells aus primären Uterusepithelien der Sau (Sus scrofa), um mögliche Gründe für die hohen Spermienzahlen in der Schweinbesamung zu untersuchen und zu identifizieren. Porzine uterine Epithelien wurden mittels Verdau mit Trypsin/EDTA (1x) gewonnen. Zellen wurden auf Collagen (rat tail, type I) auf Kollagen-beschichteten Deckgläschen aus Glas in 6-Well Kulturschalen ausgesät. Die Anheftung der Zellen an die Kollagen-Matrix wurde nach 12-36 Stunden beobachtet. Erste Kolonien bildeten sich nach fünf bis sieben Tagen und Konfluenz wurde nach zehn bis fünfzehn Tagen erreicht. Der Nachweis der Zellart erfolgte mittels Immunfluoreszenz-Färbung mit einem Epithelien-spezifischen Antikörper (anti-Cytokeratin-19). Eberspermien banden innerhalb weniger Minuten an die UEC und verblieben währenddessen motil. Eine verringerte Spermienbindung wurde sowohl auf Aortenendothelien als auch fötalen Fibroblasten des Schweins beobachtet. Dies weist auf das Vorhandensein spermienspezifischer Liganden auf den UEC hin. Spermien, wie auch UEC wiesen hohe Bindungsintensitäten für Lektine die an Glc-NAc, (WGA) sowie Gal-NAc (sWGA) binden. Die Sättigung von Sialinsäure führte zu einer stark verminderten Spermienbindung auf den UEC. Bei einer Sättigung von Glc-NAC wurde kein Unterschied beobachtet. Dies kennzeichnet Sialinsäure als den vermutlich wichtigsten Kohlenhydratrest in der Spermien-Epithelzellbindung.

Esta investigação experimental teve como finalidade de avaliar os efeitos do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a regeneração do miométrio e do endométrio de ratas submetidas à uterotomia. Foram utilizadas neste experimento 20 ratas adultas da raça Wistar, submetidas a uma uterotomia mediante incisão longitudinal de 1,5 cm total de uma das paredes do corno uterino. As ratas foram divididas em 2 grupos de 10 animais cada, sendo que um grupo foi submetido à estimulação ultra-sônica por 10 dias durante 15 minutos diários e outro grupo, chamado controle, foi submetido à estimulação fictícia pelo mesmo tempo e período. Seis horas antes do sacrifício, os animais receberam via intramuscular 0,10 mg de colchicina para cada 100 g de peso corporal com a finalidade de bloquear as mitoses em metáfase. A avaliação dos tecidos baseou-se na análise comparativa entre a contagem de células em mitose do endométrio e do miométrio de animais estimulados com o de animais controle. Os achados morfológicos foram analisados estatisticamente e são sugestivos de que o U.S.P. estimula a regeneração do miométrio bem como do endométrio de ratas. / This experimental investigation had the purpose to evaluate the low-intensity pulsed ultrasound effects under the regeneration of the myometrium and the endometrium of the rats that were submitted to uterotomia. It was used, in this experiment, twenty adult rats of the Wistar race, submitted to uterotomia beyond the longitudinal incision of total 1, 5 cm of one of the uterine horn walls. The rats were divided in two groups of ten animals each, the first group went trough fifteen daily minutes ultra-sound stimulation during ten days, and the second group, called control, went through fictional stimulation by the same time and period of the first group. Six hours before the sacrifice, the animals received, by intra muscular, 0, 10 mg of colchicine for each 100 g of body weight, with the intention to block the mitosis in metaphase. The evaluation of the tissue was based on the comparative analysis between the mitosis cell count of the stimulated animals\' endometric tissue and the control animals\' one. The morphologic findings were statistically analyzed.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, 1. die Einflüsse von Alter bzw. Parität auf Prävalenz und Entwicklung endometrialer Alterationen beim Rind zu untersuchen, 2. einen repräsentativen Überblick über die mittels Endometriumbiopsie erfassbaren Erkrankungen bei klinisch gesunden Kühen zu schaffen 3. die Entwicklung der histopathologischen Befunde nach einer weiteren Trächtigkeit zu dokumentieren. Grundlage dieser Arbeit sind sechs Endometriumbioptate von klinisch (inklusive rektaler Untersuchung) gesunden Färsen (Gruppe A), 165 Bioptate von klinisch gesunden Kühen (Gruppe B) sowie Bioptat-Paare (Gruppe C) von 46 Tieren, die im Abstand einer Trächtigkeit entnommen wurden. Die Proben der Gruppe A dienten als Kontrollgruppe, wobei die Gefäße als Grundlage für die Normalstruktur vor der ersten Trächtigkeit herangezogen wurden. Innerhalb der Endometriumbioptate der Färsen (Gruppe A) waren keine pathologischen Veränderungen (Endometritis, Endometrose, Angiosklerose) und keine Lymphfollikel nachweisbar. Bezüglich der Endometritis-Prävalenz, die bei 23,6 % lag, ließ sich in Gruppe B keine Abhängigkeit von der Parität oder dem Entnahmezeitpunkt nachweisen. Eine Endometrose trat überwiegend bei Erstkalbinnen (24,4 %) und Tieren mit fünf Abkalbungen (41,6 %) auf. Eine Korrelation mit dem Alter lag nicht vor. Auffällig war die signifikant höhere Endometrose-Prävalenz innerhalb der ersten acht Wochen p.p. (20,1 %), im Vergleich zu später entnommenen Proben (3,2 %). Für das Auftreten von Lymphfollikel, die im Mittel bei 53,3 % der Kühe auftraten, konnten keine Korrelationen mit der Parität oder dem Zeitpunkt der Bioptatentnahme ermittelt werden. Auch scheint weder das Vorliegen einer Endometritis die Entwicklung von Lymphfollikeln zu begünstigen, noch schützen Lymphfollikel im Endometrium vor einer Entzündung des Uterus. Mit steigender Parität war eine Zunahme der Angiosklerose-Prävalenz zu verzeichnen, allerdings konnte keine statistisch signifikante Korrelation zum Grad der Gefäßveränderungen (anhand der H.E.-Färbung) nachgewiesen werden. Innerhalb der Karunkel lagen signifikant höhergradige Veränderungen vor als in interkarunkulären Gefäßen. Da das Alter der Tiere eng mit der Anzahl der Abkalbungen korreliert, war eine gesonderte Betrachtung der altersassoziierten Einflüsse anhand des untersuchten Materials nicht möglich. Mittels der durchgeführten Untersuchungen ließ sich kein negativer Einfluss der vorwiegend geringgradigen histopathologischen Veränderungen im Endometrium (Endometritis, Endometrose, Angiosklerose, Lymphfollikel) auf die Fertilität (Erstbesamungserfolg, Rastzeit, Güstzeit, Gesamtträchtigkeitsrate) nachweisen. Innerhalb der Gruppe C konnte nach einer weiteren Trächtigkeit ein signifikanter Anstieg der Endometrose-Prävalenz von 7,0 % auf 25,6 % nachgewiesen werden, während der Anteil der Tiere mit einer Endometritis bzw. Angioskerose nahezu unverändert blieb. Bei einigen Tieren wurde allerdings in der ersten Probe, jedoch nicht im Folgebioptat, eine Endometrose diagnostiziert. Bei einer Kuh lag dabei sogar zuerst eine mittelgradige periglanduläre Fibrose vor, die im zweiten Bioptat nicht mehr nachweisbar war. Im Hinblick auf die Entwicklung vaskulärer Alterationen konnte nach einer weiteren Trächtigkeit eine signifikante Zunahme der Faserzubildungen (Pikrosiriusrot-Färbung) in der Tunica media interkarunkulärer arterieller Gefäße und karunkulärer Arterien sowie in der Tunica adventitia von interkarunkulären Arteriolen nachgewiesen werden. Weiterhin wurden im Zweitbioptat anhand der Pikrosiriusrot-Färbung signifikant höhergradigere Veränderungen (Gesamtschädigung) der karunkulären Arterien und Arteriolen diagnostiziert. Für alle übrigen Gefäßtypen lag zwar eine Zunahme der Gesamtschädigung im zweiten Bioptat vor, diese war jedoch nicht statistisch signifikant. Zu beiden Untersuchungszeitpunkten konnten innerhalb des untersuchten Materials vor allem Elastosen und Elastofibrosen nachgewiesen werden. Dabei lagen bezüglich der Art der zugebildeten Fasern keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Proben vor. Insgesamt konnten anhand des untersuchten Materials von klinisch gesunden Kühen zahlreiche pathologische Befunde im Endometrium diagnostiziert werden. Allerdings ist die Interpretation der Befunde bislang schwierig, da keine Einflüsse auf die Fertilität nachweisbar waren. Jedoch lagen besonders im Hinblick auf die Endometritis und Endometrose meist nur geringgradige Veränderungen vor, so dass sich diese vermutlich nicht negativ auf die Fruchtbarkeit auswirken. Weiterhin ist anhand der vorliegenden Ergebnisse fraglich, ob eine Endometrose beim Rind als irreversible Erkrankung angesehen werden muss. Hierzu sind weitere Studien erforderlich.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die morphologische und funktionelle Charakterisierung endometrialer Epithel- (EEZ) und Stromazellen (ESZ) des Pferdes bei separater Primärkultur auf permeablen Kunststoffoberflächen mit Hilfe (immun-)zytologischer, zytochemischer und transmissionselektronenmikroskopischer Untersuchungen, ein-schließlich einer vergleichenden Betrachtung der immunhistologischen und histochemischen Eigenschaften der Epithel- und Stromazellen in situ. Mögliche Zusammenhänge zwischen der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung und den Zelleigenschaften in vitro sollten überprüft werden. Zur Zellgewinnung dienten transzervikal entnommene Endometriumbioptate (n = 14) sowie vollständige Uteri euthanasierter Stuten (n = 6). Parallel entnommene Gewebeproben wurden fixiert und als In-situ-Vergleichsmaterial verwendet. Nach einer mechanischen und enzymatischen Gewebedissoziation erfolgte die Trennung von Epithel- und Stromazellen mittels Filtration, Dichtegradientenzentrifugation sowie Differenzialadhärenz. Ein Teil der aufgereinigten Zellen wurde Formalin-fixiert und für (immun-)zytologische und zytochemische Untersuchungen, insbesondere hinsichtlich des Separationserfolges, aufbereitet. Die Kultivierung der übrigen Zellen beider Zellarten fand separat voneinander auf unbeschichteten Membraneinsätzen (Millicell® PET) in einem Gemisch aus DMEM und Ham’s F-12 unter Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum (ESZ bis ca. 60 % Konfluenz) bzw. unter Zusatz von 2,5 % fötalem Kälberserum sowie verschiedener Additive (ESZ ab ca. 60 % Konfluenz sowie EEZ) bei 37 °C in wasserdampfgesättigter, mit 5 % CO2 angereicherter Raumluft statt. Konfluente Kulturen wurden in Formalin bzw. Glutaraldehyd fixiert und für die Lichtmikroskopie respektive Transmissionselektronenmikroskopie aufgearbeitet. Zum Zeitpunkt der Zellisolierung befanden sich die Endometrien überwiegend in der Phase der physiologischen Inaktivität (n = 5) oder der regulären zyklischen sekretorischen (n = 8) bzw. proliferativen (n = 3) Aktivität. In jeweils einer der Gewebeproben war eine irreguläre sekretorische, eine irreguläre proliferative bzw. eine im Übergang zwischen Sekretion und Proliferation anzusiedelnde Funktionsmorphologie festzustellen. In einem weiteren Fall wurden die Zellen aus einem graviden Uterus isoliert. Die Separation von ESZ während des Winteranöstrus verlief mit unzureichendem Erfolg, die Kulturen zeigten eine starke Kontamination mit epithelialen Zellen. Die morphologischen, immunzytologischen und zytochemischen Eigenschaften der beiden separierten Zellpopulationen unmittelbar vor Beginn der Kultivierung ermöglichten keine eindeutige Unterscheidung zwischen Epithel- und Stromazellen. Bei den aus sekretorisch differenzierten Endometrien isolierten ESZ war die Zeitdauer bis zum Erreichen der Konfluenz tendenziell länger als bei Verwendung proliferativ differenzierter Endometrien, während bei den EEZ diesbezüglich keine deutlichen Unterschiede erkennbar waren. Zum Zeitpunkt der Konfluenz konnten anhand der lichtmikroskopischen Morphologie 4 verschiedene EEZ- und 3 verschiedene ESZ-Typen nachgewiesen werden. Ultrastrukturell war eine Unterscheidung der EEZ von den ESZ möglich, innerhalb dieser beiden Zellpopulationen besaßen die lichtmikroskopisch verschiedenen Zelltypen jedoch jeweils vergleichbare Eigenschaften. Ein Zusammenhang zwischen der In-vitro-Morphologie und dem Zyklusstand zum Zeitpunkt der Zellisolierung war nicht zu erkennen. Unabhängig von der lichtmikroskopischen Morphologie wiesen die EEZ in der Regel laterale Zellverbindungen in Form von tight junctions auf, was auf einen polarisierten Phänotyp schließen lässt. Der Nachweis von Proteoglykanen mittels Alzianblau-Färbung verlief in allen kultivierten Zellen mit negativem Ergebnis. Mit Hilfe der PAS-Reaktion waren in der Mehrzahl der EEZ sowie in zahlreichen ESZ in vitro Polysaccharide/Glykoproteine nachweisbar. Die kultivierten EEZ exprimierten stets Zytokeratin 19 und in keinem Falle Desmin; in einem Teil der Zellen konnten die Zytokeratine 8 und 18, Vimentin sowie α-Glattmuskel-Aktin nachgewiesen werden. Demgegenüber enthielten die ESZ keines der untersuchten Zytokeratine, zum Teil trat in diesen Zellen jedoch eine Expression von Vimentin, Desmin und α-Glattmuskel-Aktin auf. Insgesamt war ein eindeutiger Nachweis des zellulären Ursprungs equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen in vitro ausschließlich anhand der Zytokeratin-19-Expression möglich. Die Eigenschaften der kultivierten EEZ wichen bei der Zellisolierung aus physiologisch inaktiven Endometrien hinsichtlich der PAS-Reaktion sowie des Nachweises von Zytokeratin 8 und Vimentin von denen der aus den aktiven Endometrien gewonnenen Zellen ab. Darüber hinaus wurden keine deutlichen Einflüsse der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung auf die zytochemischen und immunzytologischen Charakteristika der kultivierten Zellen offensichtlich. Auf der Grundlage dieser Arbeit können weiterführende Untersuchungen im Zellkulturmodell des equinen Endometriums erfolgen, insbesondere hinsichtlich von Veränderungen der Zelleigenschaften bei Einwirken definierter Milieufaktoren.