Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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L’endothélium cornéen est responsable de la déturgescence, un processus de déshydratation nécessaire à la transparence de la cornée. La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est la principale cause de dysfonction endothéliale chez l’humain. C’est une maladie multifactorielle associée à (1) une plus grande apoptose dépendante du stress oxydatif des cellules endothéliales cornéennes, (2) un dépôt accru de protéine matricielle causant un épaississement de la membrane basale, et finalement (3) une perte de la capacité des cellules à assurer la déturgescence cornéenne. Actuellement, les modèles d’étude de la FECD montrent une capacité limitée à caractériser l’étiologie de la maladie, ce qui restreint notre capacité à développer des traitements pharmacologiques appropriés. Le seul traitement pour cette pathologie est la greffe de cornée. Afin d’étudier cette pathologie, mon laboratoire a développé des techniques de culture et de reconstruction par génie tissulaire d’endothélia FECD. Mes travaux ont utilisé ces modèles afin de comparer, par profilage génique, PCR quantitatif, immunofluorescence, résistance transendothéliale et essai de perméabilité, l’expression, la distribution et les capacités fonctionnelles des molécules impliquées dans la déturgescence et la sécrétion matricielle. Les résultats de mes études ont montré que les protéines associées à la fonction des cellules FECD (familles de transporteurs ioniques et de jonctions intercellulaires) n’avaient aucune différence d’expression suivant la mise en culture lorsque comparées à des équivalents non pathologiques. De plus, aucune différence fonctionnelle n’a été déterminée par résistance transendothéliale et essai de perméabilité. Toutefois, une plus grande quantité de fibronectine était déposée sous les cellules. Ce faisant, ces études suggèrent que la perte de fonction dans la FECD n’aurait pas un rôle primaire dans la pathologie et serait secondaire à un dépôt anormal de fibronectine. Des recherches antérieures du laboratoire avaient démontré une amélioration dans l’expression des marqueurs de fonctionnalité suite à des greffes in vivo. Le 3e objectif présenté dans cette thèse était de déterminer si les conditions environnementales in vivo (telle que la pression intraoculaire) étaient impliquées dans cette amélioration. Pour ce faire, nous avons utilisé un système de chambre antérieure artificielle permettant d’exercer une pression sur l’endothélium dans un circuit fermé. Cette étude a montré une plus grande expression de ZO-1 à la périphérie des cellules endothéliales, une protéine associée aux jonctions serrées, par la pression. Ce résultat met en perspective l’importance de l’environnement sur la fonctionnalité de l’endothélium cornéen. / The role of the corneal endothelium is to maintain the corneal transparency by a partial dehydration process named deturgescence. Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is the main cause of human endothelial dysfunction. It is a multifactorial disease associated with an increased oxidative-related cell death, a thickened basal lamina and a loss in the endothelial pump function resulting in a corneal opacification. Due to the lack of appropriate models, the exact cause of the pathology remains unknown, which restrains our ability to develop appropriate pharmacological treatments. As of now, the only cure is the transplantation of a healthy endothelium from a deceased donor. My laboratory has previoulsly developed in vitro cell and tissue models of FECD. My research projects used these models and analyzed, by gene profiling, quantitative PCR, immunofluorescence, trans-endothelial resistance and permeability assay, the expression, the distribution and the functional capacity of molecules engaged in deturgescence and extracellular matrix (ECM) deposition. Results show no difference between FECD and healthy cells for genes and proteins related to deturgescence (ion transporters and intercellular jonctions). However, an increased deposition of fibronectin was observed. These studies therefore suggest that the endothelial dysfunction would not be a primary aspect of the pathology and would rather be secondary to an aberrant deposition of fibronectin. A previous in vivo study showed an amelioration of the endothelial phenotype upon transplantation in an animal model. It suggested a beneficial effect from the environment, such as the intraocular pressure (IOP). The effect of pressure on the endothelium was investigated by placing tissue-engineered endothelia in an artificial anterior chamber that mimicked the natural IOP. Increased ZO-1, a protein associated with tight junctions, was observed at the cell periphery. This result suggest that the in vivo environment influences the functionality of the corneal endothelium.

La réaction inflammatoire est un mécanisme de défense de l’hôte, toutefois, dans certaines circonstances, il arrive que cette réaction se retourne contre l’organisme. Il est donc important de comprendre l’origine de ce problème afin d’y trouver des solutions. Une étape majeure de la réaction inflammatoire est la migration des leucocytes du sang vers la région affectée. De ces cellules, le neutrophile est le premier à se rendre au site inflammatoire. Outre son rôle de défense de première ligne, le neutrophile a également la capacité de libérer divers médiateurs qui lui permettent d’orchestrer la réponse immunitaire. Le neutrophile est un réservoir majeur de protéines S100A8, S100A9 et S100A12. Depuis une vingtaine d’années, ces protéines ne cessent d’être associées à diverses pathologies infectieuses ou inflammatoires. Elles sont en effet détectées à de fortes concentrations dans le sérum de patients atteints d’arthrites, de maladies inflammatoires de l’intestin, de tuberculose, etc. Elles sont au demeurant des marqueurs sensibles de l’activité de ces maladies. Des études indiquent que ces protéines sont sécrétées dans des conditions inflammatoires et qu’elles exercent dans le milieu extracellulaire des fonctions pro-inflammatoires. Plus particulièrement, elles sont associées à la migration des leucocytes. Toutefois, les mécanismes d’action précis de ces protéines restent à élucider. Dans ces travaux de thèse, nous nous sommes intéressés aux rôles des protéines S100 dans la migration transendothéliale et tissulaire des neutrophiles. Nous avons observé que l’ajout de la protéine S100A9, dans des modèles in vitro, favorise l’adhésion des neutrophiles d’une part à l’endothélium et d’autre part à la fibronectine par l’activation des intégrines β2 et favorise ainsi la migration de ces cellules au site inflammatoire. S100A9 joue donc un rôle d’amplificateur de la réponse inflammatoire. Ces travaux nous aident à mieux comprendre le rôle des protéines S100 dans l’inflammation et plus particulièrement dans la migration des neutrophiles. Ces protéines constituant des cibles thérapeutiques potentielles, il est donc important de détailler leurs rôles dans le contexte inflammatoire. / Inflammation is one of the body’s defence mechanisms. In some cases, this reaction can be detrimental to the host it is supposed to protect. It is thus important to understand the origin of such reactions in order to find solutions. A key step of inflammatory reactions is leukocyte migration from blood to the injured area. Among leukocytes, neutrophils are the first to reach the inflammatory site. In addition to their role as the body’s first line of defence, neutrophils also help orchestrate the immune response through the release of inflammatory mediators. The neutrophils are a major reservoir of S100A8, S100A9, and S100A12 proteins. In the past 20 years, these proteins have been increasingly associated with various infectious and inflammatory diseases as they were detected at high concentrations in the serum of patients suffering from arthritis, inflammatory bowel diseases and tuberculosis to name a few. Moreover, they were shown to be sensitive markers of these diseases’ activity. Some studies have indicated that these proteins are secreted in inflammatory conditions and that they have pro-inflammatory activities in the extracellular space. Specifically, they were associated with leukocyte migration. However, the precise mechanisms through which these proteins affect the inflammatory response remain to be elucidated. In this work, we investigated the roles of S100 proteins in neutrophil transendothelial and tissue migration. We observed that S100A9 protein increased neutrophil adhesion to the endothelium and fibronectin by activating β2 integrins which led to the stimulation of cell migration to the inflammatory site in in vitro models. This work provided insight on the roles of S100 proteins in inflammation and more specifically in neutrophil migration. As these proteins represent potential therapeutic targets, it remains important to further understand their roles in inflammatory conditions.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / L'hypertension artérielle (HTA) associée à l'insuffisance rénale chronique (IRC) est une cause importante de morbidité-mortalité chez les patients dialysés. La physiopathologie de cette HTA est encore imprécise et implique un ensemble de désordres hémodynamiques incluant une expansion volémique et un changement de l'activité du système nerveux autonome et du système rénine-angiotensine. La dysfonction endothéliale constitue un facteur majeur de maintien et de progression de cette HTA. La diminution de la relâche endothéliale du monoxyde d'azote (NO) apparaît comme l'un des déterminants les plus importants de cette dysfonction endothéliale. En plus d'avoir un puissant effet vasodilatateur, le NO inhibe la production d'endothéline-1 (ET-1), module le taux de filtration glomérulaire (GFR) et est impliqué dans le processus de stress oxydatif. Cette étude vise à déterminer l'effet de la surexpression de l'enzyme NO synthase endothéliale (eNOS) sur la progression de l'HTA et de l'IRC chez le rat urémique. Un adénovirus codant pour la eNOS est administré par voie intraveineuse à des rats en urémie induite par néphrectomie sub-totale 5/6. Le transfert du gène est observé uniquement dans l'endothélium des vaisseaux. Après quatre semaines de suivi, le traitement avec l'AdeNOS/GFP a freiné l'élévation de la pression artérielle systolique (PAS), préservé la fonction rénale et prévenu l'apparition des dommages tissulaires rénaux. Ces effets protecteurs sont associés à une augmentation de la concentration circulante et urinaire de nitrites et de nitrates (NO2-/NO3-) indiquant une augmentation de la relâche de NO. Ainsi, la surexpression de la eNOS entraîne une augmentation de la biodisponibilité du NO et atténue le développement de l'HTA chez le rat urémique en plus de ralentir la progression de l'IRC, probablement en prévenant la dysfonction endothéliale.

Les conditions d'extraction et de culture de cellules endothéliales cornéennes de porc adultes (CECP) ont été optimisées avec succès. La découverte la plus importante était que la co-culture des CECP avec des cellules murines irradiées 3T3, tout en offrant aux CECP une grosseur et une morphologie plus près de celles retrouvées in situ et permettant leur culture à partir d'un petit nombre de cellules extraites d'une cornée, diminuait en môme temps de moitié leur taux de prolifération. Les autres optimisations à être apportées comprennent (a) la méthode utilisée pour isoler les cellules de cornées fraîchement excisées, (b) le pourcentage de confluence avant trypsination, (c) la surface de culture recouverte par des CECP, (d) la densité initiale des cellules, (e) le milieu de culture de base, (f) le pourcentage de sérum dans le milieu de culture et (g) l'effet sur les CECP de différentes concentrations d'additifs variés. / The isolation and culture conditions of adult porcine corneal endothelial cells (PCEC) have been successfully optimized. The most important discovery was that the culture of PCEC in the presence of a feeder layer of irradiated murine 3T3 cells, while offering the PCEC a smaller cell size and a morphology closer to the one found in situ, as well as allowing their culture from a smaller initial cellular seeding density, decreased by half the number of actively proliferating cells in a given culture. Other optimizations included (a) the method used for the isolation of endothelial cells from freshly excised cornea, (b) the percentage of confluence before trypsinization, (c) the culture surface covered by the PCEC, (d) the initial cellular seeding density, (e) the basic cell culture medium, (f) the concentration of serum present in the culture medium and (g) the effect on PCEC of different concentrations of various additives.

La perte de l’intégrité et de la perméabilité sélective de la barrière endothéliale est un évènement précoce dans la séquence des lésions oxydatives responsables de l’athérosclérose, de l’hypertension et de l’épanchement de cellules cancéreuses durant la dissémination métastatique. Nous avons déjà démontré que la phosphorylation de la Ser283 de la tropomyosine-1 (Tm1) par la DAPK1, en aval de la voie ERK1/2, est nécessaire à la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales exposées aux stress oxydant. La perméabilité endothéliale et la migration transendothéliale de carcinomes du côlon ont été mesurées par des essais de perméabilité et de migration en chambre de Boyden. L’usage d’ARNi et des formes sauvages et mutantes de la Tm1 ont permis de démontrer que la phosphorylation de la Tm1 est un évènement clé nécessaire dans les mécanismes de protection contre la dysfonction endothéliale lorsque l’endothélium est soumis à un stress oxydant. / Loss of endothelial cell integrity and selective permeability barrier is an early event in the sequence of oxidant-mediated injury and may result in atherosclerosis, hypertension, and facilitation of transendothelial migration of cancer cells during metastasis. We already showed that phosphorylation of tropomyosin-1 (Tm1) at Ser283 by DAPK1, downstream of the ERK1/2 pathway, is necessary to stress fibers formation in endothelial cells in response to oxidative stress. Endothelial permeability and transendothelial migration of colon cancer cells were evaluated by Boyden chamber assays. Use of siRNA and wild-type and mutated forms of Tm1 provide evidence indicating that phosphorylation of Tm1 is a key event required inside protection mechanism against endothelial barrier dysfunction associated with oxidative stress injury.

Le syndrome de choc de dengue (DSS) est une complication potentiellement mortelle dela dengue, première arbovirose humaine et problème majeur de santé publiquemondial. Il survient chez une fraction des patients, et résulte d’une fuite plasmatiquemassive, non prédictible, dont la physiopathologie est mal connue. Le décryptage de laréponse de l’hôte est donc essentiel pour améliorer le pronostic et le traitement despatients. Ce travail de thèse a abordé les mécanismes de la fuite plasmatique du DSS dedeux façons : versant immunitaire et versant endothélial. D’une part, nous avons comparéen ex vivo les profils transcriptionnels sanguins de patients présentant différentes formescliniques de dengue, afin d’identifier des mécanismes contribuant à la survenue du DSS.Cette étude a révélé l’activation chez les patients en DSS, de signatures proinflammatoiresà l’interface entre immunité innée et métabolisme lipidique, représentantde nouveaux bio-marqueurs potentiels du DSS. D’autre part, les études in vitro desinteractions entre un virus de dengue et deux lignées de cellules endothélialesmicrovasculaires humaines (CEM), a révélé des différences d’intensité de réponseantivirale, ainsi que des différences dans l’expression de protéines impliquées dans laperméabilité, selon l’origine des territoires endothéliaux. Ces résultats suggèrent que levirus contribue directement au dysfonctionnement endothélial, au côté de mécanismesindirects médiés par des facteurs de l’hôte. Les deux types d’approches mises en oeuvreont ainsi établi de nouvelles données sur la physiopathologie du DSS, qui pourraient àterme trouver des applications dans la prise en charge des malades. / Dengue Shock Syndrome (DSS) is a life-threatening form of dengue infection, which is thefirst arboviral disease worldwide and a major public health problem. This severecomplication happens in a fraction of patients, and is the consequence of anunpredictable massive plasma leakage. The pathophysiology underlying DSS is stillunknown. Deciphering the host response to dengue infection is essential to improve boththe prognosis and the therapeutic management of dengue patients. This thesis workintended to study the mechanisms involved in DSS’ plasma leakage at both immunity (exvivo study) and endothelium (in vitro study) levels. First, in a ex vivo study, we comparedwhole blood cells’ transcriptional profiles of patients suffering from different clinicalpresentations of dengue disease, in order to identify mechanisms contributing to DSSoutcome. This study revealed the activation of pro-inflammatory signatures at theinterface of innate immunity and lipid metabolism, in DSS patients. Those signatures maybe new bio-markers of DSS. Second, in vitro studies of the consequences of a directinteraction between a dengue virus and human microvascular endothelial cells (MEC),revealed differences in antiviral response intensities and in the expression of proteinsinvolved in the endothelial permeability, depending on the endothelial origin of theMEC. Those results suggest that the virus directly contributes to the endotheliumdysfunction, together with indirect mechanisms triggered by soluble and cellular factors.Our investigations have produced new data on the pathophysiology of DSS that couldhave applications to the monitoring and treatment of the patients.

L'endothéline-1 (ET-1), un peptide de 21 acides aminés, est un puissant vasoconstricteur principalement sécrété par les cellules endothéliales (CEs). Dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLVs), plusieurs études ont rapporté que les effets de l'ET-1 sont relayés via l'activation du récepteur ET[indice inférieur A]. Par contre, il a récemment été démontré que, tout comme le récepteur ET[indice inférieur A], le récepteur ET[indice inférieur B] est aussi présent dans les CMLVs humaines et qu'il contribue à l'effet de l'ET-1 dans ce type cellulaire. Dans les cellules endothéliales vasculaires (CEVs), il a été rapporté que le récepteur ET[indice inférieur B] est le seul récepteur et que les actions de l'ET-1, dont l'excitation-sécrétion, sont relayées via l'activation du récepteur ET[indice inférieur B]. Cependant, toutes ces études ont été faites sur des CEVs d'origine animale et sur des CEs de la veine ombilicale humaine qui ne constituent pas un modèle représentatif des CEVs humaines adultes. Dans cette étude, nous avons voulu vérifier l'hypothèse que, non seulement le récepteur de l'ET-1 de type ET[indice inférieur B] est présent dans les CEVAhs, mais aussi le récepteur ET[indice inférieur A] et que l'activation de ces récepteurs par l'ET-1 module le niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur c] et [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur n]. En utilisant l'immunofluorescence indirecte combinée à la microscopie confocale et des études par immunobuvardage western, nous avons démontré la présence de l'ET-1 et du récepteur ET[indice inférieur B], mais aussi, pour la première fois, la présence du récepteur ET[indice inférieur A] dans les CEVAhs. De plus, la distribution de l'ET-1 et de ses récepteurs s'est avérée hétérogène dans les cellules avec une densité de fluorescence beaucoup plus élevée au niveau nucléaire. De plus, la densité du récepteur ET[indice inférieur A] au niveau cytosolique représente environ 25% de sa densité dans la cellule totale alors que celle d'ET[indice inférieur B] n'est que d'environ 5%. Dans la deuxième partie de notre étude, la mesure du calcium intracellulaire total par l'utilisation de la sonde ratiométrique, le Fura-2, combinée à l'imagerie en 2D, nous a permis de démontrer que l'ET-1 induit une augmentation concentration-dépendante du niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur i] total avec un EC[indice inférieur 50] de près de 10[indice supérieur -10] M. Nous avons aussi démontré, avec la sonde calcique Fluo-3 combinée à la microscopie confocale en 3D, que l'ET-1 induit une augmentation calcique intracellulaire aux niveaux cytosolique et nucléaire avec des valeurs de EC[indice inférieur 50] entre 10[indice supérieur -12] M et 10[indice supérieur -11] M. Ceci suggère que l'augmentation du [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur n] est en grande partie responsable de l'augmentation du [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur c]. Finalement, pour démontrer l'implication des récepteurs dans la modulation calcique, nous avons utilisé des antagonistes non peptidiques spécifiques à chacun des récepteurs soit A-192621 et ABT-627 pour les récepteurs ET[indice inférieur B] et ET[indice inférieur A] respectivement. Ces résultats suggèrent que, dans les CEVAhs, l'augmentation du niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur i] total induite par l'ET-1 est relayée via le récepteur ET[indice inférieur A] alors que le récepteur ET[indice inférieur B] pourrait agir comme un frein sur le récepteur ET[indice inférieur A], en d'autres termes, comme un antagoniste physiologique. En conclusion, nos résultats ont démontré que le récepteur ET[indice inférieur A] est bien présent au niveau des cellules endothéliales aortiques humaines et que ce récepteur peut jouer un rôle important dans l'excitation-sécrétion dépendant du calcium intracellulaire.

La prévention des maladies cardiovasculaires constitue actuellement une approche capitale dans la diminution de la mortalité au sein de nos pays industrialisés. Tous les facteurs de risques étant associés à une dysfonction endothéliale, nous nous sommes intéressés à deux classes de médicaments dont l’action bénéfique se situe, du moins en partie, au niveau de l’endothélium vasculaire : les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (IECA) et les inhibiteurs de l’hydroxy-3-méthyl-3-glutaryl-Coenzyme A (HMG-CoA) réductase (statines). Le présent travail contribue à l’étude in vitro des effets protecteurs vasculaires de l’administration chronique, chez le rat, de deux statines (la pravastatine et l’atorvastatine) vis-à-vis de la toxicité aiguë des LDL humaines oxydées et vis-à-vis de la tolérance à la nitroglycérine. Une comparaison est menée par rapport au ramipril dans ces deux modèles expérimentaux. Les effets de ces médicaments se manifestent au niveau vasculaire par une amélioration de la disponibilité du NO. Toutefois, dans nos modèles, des mécanismes singulièrement différents ont été identifiés entre les agents étudiés : alors que le ramipril engendre une augmentation de l’expression de la eNOS, enzyme synthétisant le NO, les statines permettent une meilleure disponibilité de ce radical par un mécanisme post-traductionnel. Outre cette action, elles semblent agir directement sur des enzymes oxydatives comme les NAD(P)H oxydases. Une action antioxydante des statines pourrait expliquer tous les effets observés, ce qui n’est pas le cas pour le ramipril. Vu que le stress oxydatif intervient dans tous les facteurs de risques cardiovasculaires, diverses perspectives cliniques sont envisagées afin d’améliorer l’approche thérapeutique de la maladie athéroscléreuse.