La pratique régulière d’une activité physique (AP) est un important message de santé publique tant pour ces bénéfices cardiovasculaires que cérébraux. Par ailleurs, la rééducation par le mouvement et notamment l’exercice sur tapis roulant est de plus en plus utilisée pour accélérer la récupération après un accident vasculaire cérébral (AVC). Il est admis que l’AP impacte positivement le fonctionnement cérébral via l’augmentation des taux de BDNF (brain-derived neurotrophic factor) dans le cerveau et que son bénéfice cardiovasculaire est à relier à une modification du phénotype endothélial. Dans un premier temps, nous avons mis au point le dosage par Western blotting du proBDNF et du BDNF mature (BDNFm) ainsi que les techniques immunohistochimiques permettant de localiser le BDNF à l’étage cellulaire. Dans un second temps, nous avons comparé l’effet d’une AP (tapis roulant, 30min/j, 18m/min, 7 jours consécutifs) sur le métabolisme et la localisation du BDNF chez des rats sains versus soumis à une ischémie cérébrale focale. Dans un dernier temps, nous nous sommes intéressés à l’expression du BDNF cardiovasculaire chez des rats normo- ou hypertendus, sédentaires ou soumis au modèle d’AP précédent. Les principaux résultats montrent que 1) l’AP augmente les taux de proBDNF et de BDNFm aussi bien dans le cerveau (neurones et cellules endothéliales) que dans le système cardiovasculaire (endothélium vasculaire et cardiaque), 2) l’ischémie cérébrale n’entrave pas les effets cérébraux de l’AP sur le BDNFm, 3) l’expression endothéliale (cœur, aorte, artère coronaire) du BDNF est moindre en cas d’hypertension, 4) la synthèse et la sécrétion de BDNF par des cellules endothéliales en culture augmentent lorsque les cellules sont soumises à des contraintes de cisaillement, 5) le BDNF exerce un effet vasodilatateur sur le modèle d’aorte isolée. En conclusion, notre travail montre qu’il est possible de sélectionner, chez des rats sains, des protocoles d’AP capables d’augmenter la neuroplasticité dépendante du BDNF chez des rats ischémiés. Il identifie également le BDNF d’origine endothéliale comme un marqueur potentiel de la fonction endothéliale et un acteur jusque-là ignoré des changements neuroplastiques induits par l’AP. / The regular practice of physical activity is an important message for public health as it has both cardiovascular and brain benefits. Furthermore, rehabilitation programs involving movement especially the treadmill exercise are being used increasingly to accelerate post stroke recovery. It is recognised that the physical activity has a positive impact on brain function through increased levels of BDNF (brain-derived neurotrophic factor) in the brain and that its cardiovascular benefit is connected to a change in endothelial phenotype. As a first step, we developped the dosage by Western blotting of proBDNF and mature BDNF (mBDNF) and the immunohistochemical techniques in order to localise BDNF in the cell floor. As a second step, we compared the effect of physical activity (treadmill exercise, 30min/d, 18m/min, 7 consecutive days) on the metabolism and localisation of BDNF in healthy rats versus rats subjected to focal cerebral ischemia. As a final step, we looked into the expression of cardiovascular BDNF in normotensive or hypertensive rats, sedentary or subjected to the same physical activity. The main results show that 1) physical activity increases the levels of proBDNF and mBDNF in both brain (neurons and endothelial cells) and cardiovascular system (heart and vascular endothelium), 2) cerebral ischemia does not change the cerebral effects of physical activity on mBDNF, 3) endothelial expression (heart, aorta, coronary artery) of BDNF is reduced in the presence of hypertension, 4) the synthesis and secretion of BDNF by endothelial cells in culture increase when the cells are subjected to shear stress, 5) BDNF has a vasodilatator effect on the isolated aorta model. In conclusion, our work shows that it is possible to select, in healthy rats, protocols of physical activity that are able to increase the BDNF-dependent neuroplasticity in ischemic rats. It also identifies endothelial BDNF as a potential marker of endothelial function as well as a potential contributor of physical activity-induced neuroplasticity.

Chez les vertébrés, les cellules souches hématopoïétiques adultes émergent chez l'embryon à partir de l'endothélium de l'Aorte Dorsale et par un changement de morphologie cellulaire appelé Transition Endothélio-Hématopoïétique (TEH). L'EHT a été observée pour la première fois in vivo en utilisant le poisson zèbre et est régulée par le facteur de transcription runx1.Au cours de ma thèse, grâce à l'utilisation d'embryons de poisson zèbre transgéniques, j'ai mis en place des méthodes d'imagerie qualitative et quantitative afin d'analyser le processus cellulaire de la TEH in vivo ainsi que la dynamique des cellules environnantes à la plus haute résolution spatiale et temporelle possible. Mes résultats montrent que la TEH prend place dans un vaisseau dont l'organisation cellulaire et jonctionnelle est ajustée pour résister le plus efficacement possible aux forces mécaniques induites par le flux sanguin. La TEH nécessite la contraction d'un anneau cortico-apical d'actomyosine et le maintien des jonctions antéro-postérieures jusqu'à la fin du processus. De plus, il subit une série de phases de contraction et de relaxation suggérant sa régulation par un mécanisme de type ratchet. Les résultats montrent également l'implication de la Myosine regulatory light chain 9 (Myl9b) dont l'expression est régulée positivement par runx1. De plus, l'activité de la Myl9b au cours de la TEH nécessite la phosphorylation par la PKC de son domaine Nter. Dans ce contexte, nous faisons l'hypothèse que la phosphorylation Nter de la Myl9b, est une régulation essentielle au mécanisme de contraction de l'anneau cortico-apical d'actomyosine et est probablement à la base du mécanisme de type ratchet . / In vertebrates, Hematopoietic Stem Cells emerge from the endothelium of the dorsal aorta in a process featuring striking cell shape changes and called the Endothelial to Hematopoietic Transition (EHT). This transition was observed for the first time in vivo in our laboratory, using the zebrafish as a model organism, and is regulated by the transcription factor runx1. During my PhD, using transgenic zebrafish embryos, I set up qualitative and quantitative imaging methodologies to dissect the EHT process and the dynamics of surrounding vascular cells at the highest possible spatio-temporal resolution. My results show that the EHT is a unique cellular process, that takes place in a vessel whose cellular and intercellular organisation are tuned to resist the hemodynamic forces induced by blood flow. It requires the contraction of an apico-cortical actomyosin belt and the maintenance of antero-posterior to release the cells into the sub-aortic space while preserving the vessel integrity. The apical belt undergoes series of contraction/relaxation phases suggesting that it is controlled by a ratchet-like mechanism. I also provide evidence supporting a role of the Myosin regulatory light chain 9 (Myl9b) whose expression is positively regulated by the transcription factor runx1. The activity of Myl9b in the EHT is requires its amino-terminal PKC phosphorylation site. We make the hypothesis that the phosphorylation of the amino-terminal of Myl9b, at a site that is conserved through vertebrate species, is key to the regulation of the contraction of the cortico-apical actomyosin belt and is most probably at the basis of its dynamic control according to a ratchet-like mechanism.

La radiothérapie thoracique peut induire le développement de pneumopathies aiguës et de fibroses. La dysfonction du système vasculaire participe au développement de lésions radiques. Dans l'intestin, un KO endothélial de PAI-1 protège les souris de la fibrose radique. Le premier objectif de ce projet est d'explorer le rôle de PAI-1 dans l'apparition de la fibrose radique pulmonaire. L'irradiation thoracique de souris à 17 Gy altère sévèrement le parenchyme pulmonaire et l'analyse histologique révèle que l'invalidation de PAI-1 aggrave les lésions à 2 et 13 semaines. Cette invalidation ne protège donc pas les animaux des dommages radiques pulmonaires. L'organisation en parallèle du poumon permet d'envisager une tolérance à de fortes doses par fraction sur des petits volumes. Des irradiations en conditions stéréotaxiques ont donc été réalisées chez la souris. Les analyses histologiques montrent une déstructuration alvéolaire et un fort infiltrat inflammatoire au niveau de la zone cible. Un œdème est observable dans l'ensemble du poumon ipsilatéral deux semaines après irradiation. Le poumon ipsilatéral est également affecté par des altérations de structure, tel un épaississement des septa alvéolaires. Ces bouleversements se traduisent également au niveau transcriptomique. A la vue de l'ensemble de ces altérations, un test à l'effort a été réalisé pour évaluer l'impact potentiel sur la fonction pulmonaire. Les résultats mettent en évidence une diminution des performances des animaux. Les analyses sont à approfondir mais elles démontrent l'importance de s'intéresser aux tissus sains situés hors du volume cible mais recevant des fractions variables de la dose délivrée. / Radiation-induced endothelial dysfunction is known to participate to the development of normal tissue damage. PAI- is implicated in the phenotypic changes of irradiated endothelial cells and KOendo mice are protected from radiation damage to the gut. Whole thorax of PAI-1 KOendo and floxed mice were exposed to 17 Gy. Histological analyzes showed that PAI-1 KOendo induces a worsening of injuries at 2 and 13 weeks. Consequently, contrary to the gut no protection from radiation-induced lung damage is observed in PAI-1 KOendo mice. Our second aim was to study the effects of a single high dose stereotactic irradiation on pulmonary tissues. Histological analyzes and scanner imaging show important injuries on the targeted volume. An ipsilateral edema can also be observed 2 weeks after irradiation. Ipsilateral lung is moreover importantly damaged. A thickening of alveolar septa is notably observable. A transcriptomic analysis show important similarities between tissues from the ipsilateral lung and the focal lesion. As really highly damages have been observed in both scanner and histological analyzes, we decided to perform forced physical activity test on treadmill. A drastic decrease of maximal distance traveled has been observed from two weeks. These experiments highlighted a deficiency in respiratory function and all of these results show the importance of non-targeted irradiated pulmonary volume in the development of radiation-induced fibrosis. Effect of an endothelium-specific deletion of HIF-1α has been investigated in this model of stereotactic irradiation. Only few differences have been observed between KOendo and control mice. Experiments are still ongoing.

Les cellules endothéliales cornéennes (CEC) jouent un rôle essentiel pour le maintien de la transparence de la cornée. Cependant, chez l’homme, elles sont incapables de proliférer en raison d’un arrêt de leur cycle cellulaire en phase G1, ce qui rend la couche endothéliale cornéenne particulièrement vulnérable. La délivrance de molécules thérapeutiques (gènes ou médicaments) représente une solution prometteuse pour maintenir la viabilité des CEC. Néanmoins, la difficulté majeure de cette technique repose sur le fait de traverser la membrane cellulaire, normalement imperméable aux molécules de grande taille. Plusieurs techniques de délivrance de molécules ont déjà été testées sur le tissu cornéen mais aucune d’entre elles ne donnent de résultats suffisamment probants pour être utilisée en applications cliniques. L’objectif de cette thèse est d’adapter et de développer une nouvelle technique de délivrance intracellulaire de molécules, basé sur une perforation cellulaire via un phénomène photoacoustique induite par l’activation de nanoparticules de carbone par laser femtoseconde, sur un modèle d’endothélium cornéen in vitro et ex vivo / Corneal endothelial cells (CEC) are essential for corneal transparency. However, on humans, they are unable of proliferation owing to its arrest of G1 phase of the cell cycle, making corneal endothelial monolayer particularly vulnerable. The gene and drug delivery represents a promising solution to maintain CEC viability. Unfortunately, the major difficulty of this technique is the transport across the cell membrane, normally impermeable to high-size molecules. Several techniques of molecules delivery have already been tested on corneal tissue but none of them gives results sufficiently convincing to be used in clinical applications. The aim of this thesis is to adapt and develop a new technique of intracellular molecules delivery, based on cell perforation via photoacoustic effect induced by the activation of carbon nanoparticles by femtosecond laser, on in vitro and ex vivo models of corneal endothelium

La pratique régulière d’une activité physique (AP) est un important message de santé publique. L’AP améliore non seulement la santé cardiovasculaire via l’augmentation de la production de NO (nitric oxide) par l’endothélium vasculaire mais aussi la santé cérébrale via l’augmentation des taux de BDNF (brain-derived neurotrophic factor) dans le cerveau. Comme la synthèse et la sécrétion de BDNF sont proportionnelles à l’activité neuronale, il est généralement admis que l’élévation des taux cérébraux de BDNF induite par l’AP est à relier à l’hyperactivité neuronale. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle l’élévation du flux sanguin dans les vaisseaux de la circulation cérébrale pendant la réalisation de l’AP contribue à augmenter les taux cérébraux de BDNF. Les expériences ont été menées chez des rats soumis ou non à l’AP (tapis roulant). Nos résultats montrent : 1) que l’augmentation des taux de BDNF induite par l’AP (tapis roulant, 18m/min, 30 min/j, 7j consécutifs) est moindre lorsque l’augmentation du flux sanguin pendant la réalisation de l’AP, est prévenue par un clampage mono- ou bi- carotidien, 2) que l’effet de l’AP sur les taux de BDNF dépend de l’intensité de l’AP ( tapis horizontal versus déclive descendant), 3) que la dysfonction endothéliale (modèle de rat spontanément hypertendu) et le traitement par un inhibiteur de NO synthase diminuent les effets de l’AP sur les taux cérébraux de BDNF et 4) qu’il existe une association positive entre les taux cérébraux de BDNF et la production de NO par l’endothélium vasculaire.L’ensemble de nos résultats suggère que l’augmentation des taux cérébraux de BDNF induite par l’AP met en jeu l’augmentation du flux sanguin dans les vaisseaux de la circulation cérébrale et, plus précisément, l’augmentation de la production endothéliale de NO qui en résulte. Ils fournissent de nouvelles données pour comprendre le lien existant entre fonction endothéliale et performances cognitives, soulevant l’idée selon laquelle les modalités d’AP pour améliorer la santé cérébrale doivent être différentes en cas de pathologies associées à une dysfonction endothéliale. / The regular practice of physical activity (PA) is an important public health message. PA not only improves cardiovascular health through the increase in NO (nitric oxide) production by the vascular endothelium but also through the increase levels in brain BDNF (brain-derived neurotrophic factor) levels. As the synthesis and secretion of BDNF are proportional to neuronal activity, it is generally accepted that PA-induced brain BDNF levels elevation is linked to neuronal hyperactivity. We tested the hypothesis that the increase in blood flow in cerebrovasculature during PA contributes to increase brain BDNF levels. The experiments were carried out in sedentary and trained rats (treadmill). Our results show that: 1) brain BDNF levels elevation induced by PA (treadmill, 18m /min, 30 min /day, 7 consecutive days) is lower when the normal rise of cerebral blood flow during the PA is prevented by occluding one or both common carotid arteries, 2) the effect of PA on brain BDNF levels is dependent on PA intensity (horizontal versus downhill), 3) the presence of endothelial dysfunction (spontaneously hypertensive rat model) as well as NO synthase inhibition decrease the effects of PA on brain BDNF levels and 4) there is a positive association between brain BDNF levels and vascular endothelium NO production .Collectively, our results suggest that increase in brain BDNF levels, induced by PA, involves increase in cerebrovasculature blood flow and more precisely elevation in endothelium NO production. They provide new data for understanding the relationship between endothelial function and cognitive performance, raising the idea that PA modalities to improve brain health might be different in pathologies diseases with endothelial dysfunction.

La radiothérapie constitue l’un des principaux traitements pour l’éradication des cancers. Cependant, elle présente un risque d’effets secondaires aux tissus sains environnant la tumeur. Dans ce processus, le système vasculaire et plus particulièrement l’endothélium jouent un rôle clé. Les cellules endothéliales activées favorisent le recrutement chronique des thrombocytes et des leucocytes, contribuant ainsi aux effets secondaires. D’autre part, dans les maladies inflammatoires, les glycanes exprimés à la surface des cellules endothéliales sont modifiés et influencent le recrutement des cellules immunitaires. Dans cette étude, nous avons évalué la modification des glycanes endothéliaux en réponse à une irradiation à forte dose, et étudié les effets fonctionnels de ces modifications sur le recrutement des leucocytes en utilisant un modèle de cellules endothéliales (HUVECs) in vitro. Nos résultats apportent les premières preuves d’une modification du glycome des cellules endothéliales en réponse à l’irradiation. Les N-glycanes hautement mannosylés, les O-glycanes et les motifs sialylées sont surexprimés. Parallèlement, le glycocalyx endothélial semble subir une dégradation. Nous avons évalué l’effet fonctionnel des modifications glycanique des cellules endothéliales irradiées sur l’adhésion d’une lignée de monocyte (THP-1). Nos résultats montrent que l’adhésion radio-induite est en partie due à la surexpression endothéliale des N-glycanes hautement mannosylés. Nous avons aussi évalué le glycome sur un modèle de souris irradiées et sur des pièces opératoires de patients traités par radiothérapies. Nos résultats de transcriptomiques sur la souris suggèrent l’existence de modifications glycaniques radio-induites in vivo. L’intégration de la composante glycanique permet de porter un regard nouveau sur le continuum d’évènement qui conduit aux lésions tissulaires radio-induites. A l’avenir, l’étude du glycome pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des effets secondaires de la radiothérapie. / Radiotherapy is one of the main treatments against cancers. However, it presents a risk of adverse effects for the normal tissues surrounding the tumors. The vascular network and especially the endothelium are considered as main targets to limit normal tissue damages and prevent side effects of radiotherapy. Activated endothelial cells are involved in the chronic recruitment of thrombocytes and leukocytes, resulting in tissue complications. On the other hand, in inflammatory diseases, the glycans expressed on the surface of endothelial cells are modified and lead to immune cells recruitment. We sought to evaluate changes in endothelial glycome in a context of exposure to high dose of radiation, and studied the functional consequences on the recruitment of leukocytes. In vitro, the characterization of the glycome was performed on a primary endothelial cell model (HUVEC). Our results provide the first evidences of an endothelial modification of the glycome after exposure to ionizing radiation. We report an overexpression of high mannose N-glycans, O-glycans and syalilated motifs. At the same time, endothelial glycocalyx appeared to be damaged by exposure to radiation. Next, we evaluated these radiation-induced modifications of endothelial glycans on monocyte adhesion. We show that the radiation induced adhesion was mediated by overexpression of high mannose N-glycans. We also investigated changes in glycome in an irradiated mouse model of enteropathy and in resections of patients treated with radiotherapy. In mice, a transcriptomic study suggests changes in glycans following radiation exposure. Collectively, these findings on glycome changes provide a new perspective of the continuum of events leading to normal tissue complications. In the future, the study of the glycome should open new therapeutics opportunities for better management of tissue damages induced by radiation.

Les lésions radiques aux tissus sains représentent un réel problème de santé publique, puisqu’elles constituent l’un des principaux facteurs limitants des traitements radiothérapeutiques. Les concepts qui entourent leur pathogenèse ont progressivement évolués vers une vision intégrée de la pathogénèse, qui implique l’ensemble des compartiments qui composent le tissu cible. Parmi eux, l’endothélium semble tenir une place centrale dans la séquence d’évènements interdépendants qui conduisent au développement des lésions radiques. Grâce à l’utilisation de nouveaux modèles murins transgéniques, ce travail de thèse fournit la démonstration directe d’un continuum endothélium-dépendant dans l’évolution des lésions intestinales radiques. En effet, la modification du phénotype endothélial grâce à la délétion ciblée du gène SERPINE1, choisi du fait de son rôle clé dans le développement de l’entérite radique, influence différents paramètres du développement de la pathologie. Ainsi, les souris PAI-1 KOendo présentent une meilleure survie, ainsi que des atteintes tissulaires précoces et tardives moins sévères, après irradiation localisée du grêle. En outre, ces animaux présentent une diminution du nombre de cellules intestinales apoptotiques dans les heures qui suivent l’irradiation, de la densité de l’infiltrat de macrophages une semaine après irradiation, ainsi qu’une polarisation différentielle de ces macrophages tout au long du processus physiopathologique. Dans une volonté de protéger les tissus sains des effets secondaires de la radiothérapie sans entraver le traitement anti-cancéreux, l’intérêt de PAI-1 comme cible thérapeutique laisse peu de place aux doutes. / Radiation-induced injury to healthy tissues is a real public health problem, since they are one of the most limiting factors that restrict efficiency of radiation therapy. Concepts surrounding the development of radiation-induced damage have gradually evolved into a contemporary and integrated view of the pathogenesis, involving all compartments of target tissue. Among them, endothelium seems to be central in the sequence of interrelated events that lead to the development of radiation-induced damage, although there are rare concrete elements that support this concept. By using new transgenic mouse models, this PhD project provides a direct demonstration of an endothelium-dependent continuum in evolution of radiation-induced intestinal damage. Indeed, changes in the endothelial phenotype through targeted deletion of the gene SERPINE1, chosen because of its key role in the development of radiation enteritis, influences various parameters of the development of the disease. Thus, lack of PAI-1 secretion by endothelial cells significantly improves survival of the animals, and limits severity of early and late tissue damage after a localized small bowel irradiation. Furthermore, these mice partially KO for PAI-1 showed a decrease in the number of apoptotic intestinal stem cells in the hours following irradiation, a decrease in the macrophages infiltrate density one week after irradiation, and a change in the polarization of macrophages throughout the pathophysiological process. In an effort to protect healthy tissues from radiation therapy side effects, without hindering the cancer treatment, PAI-1 seems to be an obvious therapeutic target.

La fibrose digestive est une complication secondaire tardive de la radiothérapie dans 5 à 10% des patients traités pour des tumeurs de la sphère abdomino-pelvienne. Elle est caractérisée par une accumulation de matrice extracellulaire synthétisée par les cellules mésenchymateuses. La transition endothélium-mésenchyme (EndoMT), est un processus au cours duquel les cellules endothéliales expriment des marqueurs mésenchymateux en réponse au stress. L'EndoMT a été identifiée comme une source de cellules mésenchymateuses participant à la fibrose chez des patients atteints de maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Cette étude s'est donc concentrée sur le rôle de l'EndoMT dans le développement de la fibrose intestinale radio-induite et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles.Nos résultats ont révélé pour la première fois l'existence de l'EndoMT au niveau de la paroi rectale chez l'homme après radiothérapie. L'utilisation de souris exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur endothélial Tie2, nous a permis de localiser les cellules mésenchymateuses possédant une origine endothéliale, confirmant l'existence de l'EndoMT radio-induite dans notre modèle préclinique de rectite radique. In vitro, nous avons confirmé le changement phénotypique des cellules endothéliales irradiées.Ce projet s'est ensuite concentré sur un acteur potentiel de l'EndoMT radio-induite, Hey2. La génération d'un modèle murin déficient pour Hey2 dans l'endothélium a révélé une diminution des dommages muqueux et de la fréquence l'EndoMT après irradiation. L'inhibition de Hey2 représente une nouvelle approche thérapeutique attrayante dans la réduction de la fibrose digestive radio-induite. / Fibrosis is identified as a chronic side effect occurring after radiotherapy for pelvic tumors in 5 to 10 % of patients. This pathological healing process is characterized by an accumulation of extracellular matrix synthesized by mesenchymal cells. Endothelial to mesenchymal transition (EndoMT), is a processes during which endothelial cells express mesenchymal markers in response to stress. EndoMT is identified as a source of mesenchymal cells taking part to fibrosis development in patients suffering from inflammatory bowel diseases. Then, this study focused on the potential participation of EndoMT in radiation-induced intestinal fibrosis and tried to identify new therapeutics targets. Interestingly, our results showed for the first time EndoMT in rectal tissues from patients who developed radiation proctitis following radiotherapy. We used an in vivo approach to follow the mesenchymal cells having an endothelial origin in a mouse model expressing the GFP under the control of an endothelial promoter, Tie2 (Tie2-GFP). Thereby, our results confirmed the existence of radiation-induced EndoMT in our preclinical model of radiation proctitis. In vitro characterization showed that irradiation induced a modulation of the endothelial phenotype through a mesenchymal profile, a hallmark of EndoMT. This project also focused on a potential molecular actor, Hey2. In this context, we generated a transgenic mouse model in which Hey2 gene expression is repressed specifically in the endothelial compartment and observed a decrease in radiation-induced mucosal damages and EndoMT frequency. Consequently, inhibiting Hey2 expression could represent a new interesting therapeutic strategy.

La greffe lamellaire postérieure, ou greffe endothéliale, consiste à remplacer l’endothélium défectueux d’une cornée par un endothélium sain prélevé sur un donneur décédé, en laissant en place l’épithélium et le stroma du patient. La découpe du greffon lamellaire endothéliale est l’une des étapes critiques de la greffe de cornée postérieure. Supérieur au microkeratome pour la réalisation de capots cornéens peu profonds, le laser femtoseconde montre cependant des résultats plutôt décevant concernant les découpes cornéennes profondes. L’objectif de cette thèse est d’étudier et d’optimiser les découpes lamellaires endothéliales cornéennes, réalisées au microkeratome et au laser femtoseconde. Ces optimisations passent par le développement d’un bioréacteur cornéen, ainsi que par l’amélioration des techniques d’estimation de la viabilité endothéliale cornéenne / Posterior lamellar graft, also named endothelial graft, consist in a replacement of a defective corneal endothelium by a healthy one take on a deceased donor. The epithelial and stromal layers of the patient stay untouched. A critical step of this technic is the preparation of the lamellar graft. Femtosecond lasers are better in comparison with microkeratome for low depth lamellar cut. However, femtosecond high depth corneal lamellar cuts show disappointing results. The aim of this thesis is to study and optimize corneal endothelial lamellar cuts, realized by microkeratome and femtosecond laser. Development of a corneal bioreactor and improve of corneal endothelial viability assessment are necessary for the realization of these objectives

En réponse à l'activation et/ou une apoptose, les cellules endothéliales (CE) libèrent dans le milieu environnant des microparticules endothéliales (MPE). Les microparticules sont des vésicules de petite taille résultant d'évènements membranaires liés à une perte de l'asymétrie des phospholipides. Peu de travaux concernent l'étude des mécanismes de génération des MPE et l'influence du territoire vasculaire sur la capacité de vésiculation des CE n'est pas connue. Nous avons montré que la thrombine induit la génération de MPE par un mécanisme complexe impliquant un lien entre coagulation et inflammation sur les CE macro et microvasculaires. A partir de l'étude du transcriptome, nous avons mis en évidence l'implication de TRAIL dans la génération des MPE procoagulantes par la thrombine. A l'état basal, les CE issues de différents territoires vasculaires présentent des capacités différentes de vésiculation, les CE microvasculaires présentant une plus grande capacité à libérer des MPE. L'étude du transcriptome a permis de déterminer des signatures moléculaires représentatives des territoires macro et microvasculaires. Nos travaux mettent en évidence une génération différentielle de MPE en fonction du calibre des vaisseaux et les signatures spécifiques pourraient permettre une meilleure caractérisation du territoire endothélial lésé. / In response to activation and/or apoptosis, endothelial cells (EC) release endothelial microparticles (EMP) in the extracellular space. Microparticles are small-sized vesicles resulting from membrane events leading to a loss of phospholipid asymmetry. Few works have documented the mechanisms underlying EMP generation and the influence of vascular bed on EMP release remains largely unknown. Our works showed that thrombin induced EMP generation through a complex mechanism involving a cross-talk between coagulation and inflammation in macro and microvascular EC. Using a global gene expression study, we have evidenced the involvement of TRAIL in the procoagulant EMP generation induced by thrombin. In a basal state, EC from various vascular beds showed different capacities of EMP release, with microvascular EC displaying the highest capacity. Gene expression study identified molecular signatures representative of EC from macro and microvascular beds. Our works highlight the role of the vascular beds in the capacity of EC to generate EMP according to the vessel caliber. The specific gene signatures could improve our knowledge the endothelial dysfunction and a better characterization of the damaged vascular beds.