Enterokokken gehören zu den bedeutendsten nosokomialen Keimen. Die Verbreitung von Multiresistenzen bei diesen Keimen stellt das deutsche Gesundheitssystem aufgrund von wenigen verbleibenden Therapieoptionen von Infektionen vor große Probleme. Die KRINKO des Robert-Koch-Instituts empfiehlt als mögliche Präventionsmaßnahme ein regelmäßiges Screening auf Enterokokken mit Vancomycin- bzw. Linezolid-Resistenzen. Ziel dieser Arbeit war es, ein kulturelles Screeningverfahren für Linezolid-resistente Enterokokken (LRE) zu entwickeln und dieses anschließend im Routinescreening des Universitätsklinikums Würzburg zu etablieren. Es wurde ein Verfahren entwickelt, welches sich aus einem Anreicherungsschritt mit 3 mg/l Linezolid versetzter selektiver Enterococcosel-Bouillon und einer anschließenden Subkultivierung auf Linezolid-Enterococcosel-Agar mit 4 mg/l Linezolid zusammensetzt. In einer Simulation von klinischen Bedingungen zeigte sich eine gute Sensitivität und Spezifität. Das entwickelte Screeningverfahren wurde mit einem geringen Sensitivitätsverlust und ohne zusätzliche Belastung für die Patienten in das bestehende Routinescreening für Vancomycin-resistente Enterokokken des Universitätsklinikums Würzburg eingegliedert. Die nachgewiesen LRE zeigten unterschiedliche Resistenzmechanismen, wobei bei dem Großteil der Isolate Resistenzgene nachgewiesen werden konnten. Des Weiteren zeigte sich ein breit gestreuter genetischer Hintergrund. Viele der Isolate gehörten genetischen Gruppen an, welche bisher kaum in hospitalisierten Patienten nachgewiesen wurden. Durch die labortechnische Weiterentwicklung von Screeningverfahren für LRE können diese möglicherweise bald routinemäßig in vielen Kliniken etabliert werden. / Enterococci are one of the most important nosocomial pathogens. The spread of multiresistance in these pathogens poses a major problem for the German healthcare system due to the few remaining treatment options for infections. The Robert Koch Institute's KRINKO recommends regular screening for enterococci with vancomycin or linezolid resistance as a possible preventive measure. The aim of this work was to develop a cultural screening method for linezolid-resistant enterococci (LRE) and to establish it in routine screening at the University Hospital of Würzburg. A procedure was developed consisting of an enrichment step with 3 mg/l linezolid-added selective enterococcosel broth and a subsequent subcultivation on linezolid-enterococcosel agar with 4 mg/l linezolid. A simulation of clinical conditions showed good sensitivity and specificity. The developed screening method was integrated into the existing routine screening for vancomycin-resistant enterococci at the University Hospital of Würzburg with little loss of sensitivity and no additional burden for patients. The detected LRE showed different resistance mechanisms, with resistance genes being detected in the majority of isolates. In addition, a broad genetic background was found. Many of the isolates belonged to genetic groups that have rarely been detected in hospitalized patients. With further development of laboratory screening methods for LRE, it may soon be possible to establish them routinely in many hospitals.

À ce jour, aucun produit de désinfection endodontique possédant toutes les caractéristiques idéales n’a été développé. Ainsi, malgré les différentes stratégies de décontamination utilisées en clinique, certaines bactéries organisées sous forme de biofilm peuvent survivre et contribuer à la persistance de l'infection. De plus, certaines solutions actuellement disponibles démontrent un potentiel cytotoxique considérable si elles entrent en contact avec les tissus périapicaux. Le but de ce projet était d'étudier de nouvelles substances, dont la nisine, l'huile essentielle de cannelle et trois polyphénols dérivés de la réglisse (licochalcone A, licoricidine etglabridine) pour leurs propriétés antimicrobiennes envers Enterococcus faecalis ainsi que leur biocompatibilité avec les cellules humaines. Des essaisde dilutions en microplaque ont été réalisés pour déterminer les propriétés antibactériennes des composés et leurs effets sur la formation de biofilm. L'interaction synergique entre les composés a été évaluée en utilisant la technique en damier. La viabilité du biofilm a été mesurée par un test de bioluminescence alors que la biocompatibilité et la prolifération cellulaire ont été déterminées avec un test colorimétrique mesurant la respiration cellulaire. L'huile de cannelle s'est avérée être la substance démontrant les meilleures propriétés antibactériennes envers E. faecalis. Tous les composés à l’étude ont entraîné une diminution de la formation de biofilm proportionnellement à la réduction de la croissance bactérienne. Des effets antibactériens synergiques entre la nisine et les autres produits ont également été observés contre E. faecalis. Enfin, aux concentrations efficaces contre E. faecalis, lesproduits ont démontré peu ou pasde cytotoxicité vis-à-vis trois lignées cellulaires d’origine buccale, à l’exception de l’huile essentielle de cannelle. Cette étude a permis d’apporter des évidences que la nisine, l'huile de cannelle et certains polyphénols dérivés de la réglisse, plus spécifiquement lorsqu'ils sont utilisés en association, peuvent représenter des molécules prometteuses pour la désinfection des canaux radiculaires. / To date, no endodontic irrigating solution possessing all ideal characteristics has been developed. Thus, despite different existing decontamination strategies, some bacterial cells organized as biofilm can survive and contribute to the persistence of the infection. In addition, some currently available solutions demonstrate a considerable cytotoxic potential if forced into periapical tissues. The purpose of this study was to investigate new molecules, including nisin, cinnamon oil and polyphenols derived from licorice (licochalcone A, licoricidin and glabridin) for their antimicrobial properties against Enterococcus faecalis and their biocompatibility with human cells. Microplate dilution assays were performed to determine the antibacterial properties of the compounds and their effects on biofilm formation. The synergistic interaction between the compounds was evaluated using the checkerboard technique. The biofilm viabilitywas measured by a bioluminescence assay while biocompatibility and cell proliferation were determined with a colorimetric test measuring cellular respiration. Cinnamon oil has been shown to be the most effective antimicrobial agent against E.faecalis. All compounds tested in the study caused a decrease of biofilm formation proportionalto the reduction in bacterial growth. Synergistic antibacterial effects between nisin and other products have also been observed against E. faecalis. Tested products demonstrated weak or no cytotoxicity towards three oral cell lines. This study provides evidence that nisin, cinnamon oil and licorice-derived polyphenols, more specifically when used in association, may represent promising molecules for root canal disinfection.

Multiresistenta bakterier så som meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), bakterier som producerar extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) och vancomycinresistenta enterokocker (VRE) är ett problem sedan årtionden tillbaka och som ökar för varje år. Idag på mikrobiologen, Unilabs Skövde, isoleras bakteriestammar från selektiva medier för just MRSA, ESBL och VRE på blodagar innan resistensbestämningarna utförs. Syftet med studien var därför att undersöka möjligheten att göra diskdiffusionstest direkt från de selektiva medierna och således kunna svara ut resultaten tidigare. Utvärdering av detta gjordes genom att undersöka om storleken på antibiotikazonerna för sammanlagt 64 isolat påverkades av att bakterierna som användes vuxit på ett selektivt agarmedium i förhållande till om de vuxit på blodagar. Resultatet visade vad som ansågs vara en normal variation på maximalt ±2 mm för alla parvisa zoner utom en på 3 mm. Av alla zoner som undersöktes för MRSA, ESBL och VRE var majoriteten identiska i antal millimeter, 62 %, 89 % och 98 % respektive. Baserat på det goda resultatet ansågs materialet vara tillräckligt stort för att göra bedömningen att metoden är utförbar. Med tanke på de positiva effekterna av att göra resistensbestämningar direkt från de selektiva agarmedierna görs rekommendationen till mikrobiologen, Unilabs Skövde, att övergå till denna metod. / Multiresistant bacteria such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) producing bacteria and vancomycin-resistant enterococci (VRE) have been a problem for decades with an increasing rate. Today, at mikrobiologen, Unilabs Skövde, bacterial strains are isolated from selective media for MRSA, ESBL and VRE onto blood agar before the susceptibility testing. The aim of the study was to examine the possibility of disk diffusion susceptibility testing directly from the selective media and thus be able to reply the findings earlier. The zones of inhibition were examined for a total of 64 isolates after disk diffusion testing from both the selective and blood agar plates in order to evaluate if the zone sizes were affected. The results showed what was considered a normal variation of ±2 mm for all pairwise zones except for a difference in 3 mm. The majority of all zones tested for MRSA, ESBL and VRE had equally large zones, 62%, 89% and 98% respectively. Based on the good results, the material was considered enough to make the conclusion that the method is feasible. Considering the positive effects of making susceptibility testing directly from selective agar, a change to this method is recommended to mikrobiologen, Unilabs Skövde.

A ampliação do conhecimento sobre as formas de comunicação, controle e regulação existentes em bactérias traz luz aos avanços no combate das infecções hospitalares que são responsáveis por inúmeros prejuízos relacionados à saúde pública em todo planeta. DUMOULIN et al (2013), descreveram o regulador transcricional (RT) ElrR, que regula positivamente a transcrição do gene elrA, um fator de virulência de Enterococcus faecalis. ElrA apresenta grande similaridade com as internalinas de Listeria monocytogenes, que facilitam a invasão da bactéria ao hospedeiro. ElrR é considerada como pertencente à família Rgg-like de RT exclusivo de bactérias Gram positivas. Por vários motivos a família Rgg foi inserida à superfamília RNPP, gerando a superfamília RRNPP de RT. Os RRNPP fazem parte de um sistema de regulação por quorum sensing (QS), um sistema de comunicação célula-célula dependente de densidade celular, com função associada na ativação ou inibição da expressão de proteínas relacionadas, dentre outros, à virulência, formação de biofilme e esporulação. Para a melhor compreensão do mecanismo de como ocorre a ativação da transcrição do fator de virulência ElrA, este trabalho apresenta resultados de expressão heteróloga em E. coli e purificação das proteínas ElrR e ElrA, bem como resultados de experimentos biofísicos que caracterizam algumas propriedades estruturais e biológicas destas proteínas. Utilizando técnicas de cromatografia, espectroscopia de dicroísmo circular (CD), anisotropia de fluorescência, espalhamento dinâmico de luz (DLS), cristalografia de raios X e ressonância plasmônica de superfície (SPR), foi possível a obtenção da estrutura tridimensional de ElrR e de indícios da interação com uma região de 25bp do DNA. Realizou-se ainda, em colaboração com Dra. Pascale Serror, a tentativa de obtenção da molécula autoindutora (AI) de ElrR. São apresentados primeiros resultados da obtenção heteróloga de ElrA, sua purificação e cristalização, com importantes características que permitirão a continuação da investigação deste fator de virulência. ElrR é composta somente por alfa-hélices e apresenta-se dimérico em solução. Apesar da similaridade estrutural dos RRNPP, a identidade da sequência entre ElrR e os outros membros é extremamente baixa, o que motivou a resolução das fases cristalográficas experimentalmente. A estrutura de ElrR apresenta-se similar às homólogas, porém, com maior interface de interação entre os protômeros, que formam o dímero. O sítio de ligação do AI, em ElrR, apresenta-se mais amplo, com cavidade maior que as demais estruturas estudadas, conservando vários dos resíduos apresentados nos homólogos que realizam a estabilização do AI. Os altos fatores de temperatura dos cristais de ElrR, adicionado a anisotropia dos átomos, de uma das estruturas obtidas, apresenta a grande flexibilidade desse RT. Os indícios de interação entre ElrR e DNA aqui apresentados, obtidos por SPR e anisotropia de fluorescência, apresentam que ElrR liga especificamente ao fragmento proposto do DNA, ainda na ausência do AI. A não cristalização do complexo (ElrR-DNA), adicionada a alta flexibilidade apresentada na estrutura e a instabilidade observada na ligação ao DNA (por SPR) apontam para a obrigatoriedade da molécula de regulação (AI) para que o complexo ElrR-DNA seja estável. / The enhancing of the knowledge about communication, control and regulation in bacteria bring possibilities on the advance of hospital-acquired infections control responsible for various prejudices related to public health worldwide. DUMOULIN, et al (2013) described ElrR, a transcriptional regulator (TR), that positively regulates transcription of the elrA gene, which codifies a virulence factor of Enterococcus faecalis. ElrA shows high similarity with Listeria monocytogeneses internalins, which facilitates host invasion by these bacteria. ElrR are considered belonging to Rgg-like TR family exclusive of Gram positive bacteria. Several reasons include the Rgg family into the RNPP superfamily, generating the RRNPP superfamily of TR. The RRNPP are controlled by a quorum sensing (QS) regulation system, a cell-cell communication system based on cellular density that activates or inhibits the expression of proteins related with virulence, biofilm formation, sporulation, and others. For a better understanding of the transcription activation mechanism of ElrA, this work shows ElrR and ElrA heterologous expression in E. coli and purification of these proteins, as well as biophysics assays to characterize some structural and biological features of both proteins. Using chromatography, circular dichroism (CD), fluorescence anisotropy, dynamic light scattering (DLS), X-ray crystallography and surface plasmon resonance (SPR) technics, it was possible to obtain the tridimensional structure of ElrR, and evidences of ElrR-DNA complex formation, confirming DNA interaction site of ElrR with a 25 bp fragment. In collaboration with Dr. Pascale Serror, we attempted to achieve the ElrR auto-induction (AI) molecule. Also, results of the heterologous obtainment of ElrA are presented, as well as ElrA purification and crystallization, presenting important characteristics which will allow the further investigation of this virulence factor in near future. ElrR is composed by alpha-helices presenting dimeric fold in solution. Despite the similarity between the RRNPP members, the low identity of ElrR to the other members motivates the experimental crystallographic phases solution. ElrR structure is very similar to the homologous structures, presenting a higher interface between the protomers that compose the dimer. Its AI binding site is wider than the other structures studied, conserving several amino acid residues presented at the homologous proteins, that stabilizes the AI molecule. High temperature factors of the amino acid residues showed in all the obtained ElrR crystallographic structures plus the anisotropy of the atoms in one of those structures show the high flexibility of this TR. The evidence of the ElrR-DNA complex presented in this study, obtained by SPR and fluorescence anisotropy, indicates that ElrR binds at the proposed DNA site even in the absence of the AI molecule. The failure to obtain the ElrR-DNA complex crystals added to the high flexibility presented at some places of the structure and the observed instability at the formed complex (observed at SPR) suggest the mandatory need of the AI molecule to create a stable ElrR-DNA complex.

O preparo do canal radicular visa a remoção de bactérias que podem causar a patologia periapical, e os instrumentos endodônticos estão sendo constantemente aprimorados para tornar o tratamento do canal radicular mais fácil, rápido e seguro. Assim, novos instrumentos precisam ser avaliados quanto ao seu desempenho. O objetivo deste estudo foi avaliar a remoção bacteriana dos sistemas Wave One Gold e One Shape New Generation comparando-os com seus sistemas predecessores. Cinquenta e seis canais disto vestibulares de molares superiores esterilizados por oxido de etileno foram contaminados com Enterococcus faecalis por 21 dias, e então uma amostra bacteriana inicial foi coletada e paqueada em M-enterococcus agar para contagem bacteriana em unidades formadoras de colônias. Os espécimes foram aleatoriamente divididos em quatro grupos de acordo com a instrumentação (n=12): Wave One Gold Primary, One Shape New Generation 25/.06, Wave One Primary e One Shape 25/.06, e os outros 8 canais não contaminados foram o controle de assepsia. Todos os grupos utilizaram água destilada como irrigante. Nova coleta foi feita imediatamente após a instrumentação e aos 7 dias. A redução bacteriana foi calculada em porcentagem, e então feita análise intragrupo pelo teste de Wilcoxon e entre grupos por Kruskal Wallis e teste de Dunn, todos com significância de 5%. Todos os sistemas reduziram significativamente a carga bacteriana do canal radicular tanto na coleta imediata quanto aos 7 dias (p<0,05). Houve aumento do número de bactérias 7 dias após o preparo quando comparado com a coleta imediata (p<0,05). A análise entre grupos mostrou que Wave One Gold e One Shape New Generation promoveram maior redução bacteriana que os sistemas Wave One e One Shape (p<0,05), sem diferença significativa entre Wave One Gold e One Shape New Generation ou entre Wave One e One Shape (p>0,05). Conclui-se que Wave One Gold e One Shape New Generation promoveram maior remoção bacteriana do que seus sistemas predecessores. / The root canal preparation aims to remove the bacteria that can cause periapical pathologies, and endodontic instruments are constantly being improved to make root canal treatment easier, faster and safer. Thus, new instruments need to be evaluated for their performance. The aim of this study was to evaluate the bacterial removal promoted by Wave One Gold and One Shape New Generation systems in comparison to that of their predecessor systems. Forty-six distobuccal root canals of upper molars sterilized with ethylene oxide were infected with Enterococcus faecalis for 21 days, and then root canal initial bacterial sampling was collected and plated on M-enterococcus agar to bacterial count in colony forming unities. The specimens were randomly divided into four groups according to the instrumentation (n=12): Wave One Gold Primary, One Shape New Generation 25/.06, Wave One Primary and One Shape 25/.06, and the other 8 uncontaminated canals were used as asepsis control. All groups used distilled water as irrigant. New sampling was obtained immediately after instrumentation and at 7 days. The bacterial reduction was calculated in percentage, after that intra-group analysis was carried out by Wilcoxon test, and inter-group analysis by Kruskal-Wallis complemented by Dunn\'s test, all at 5% significance. All the systems significantly reduced the bacterial amount in the root canal in both immediate and at 7 days sampling (p<0.05). The bacterial amount increased at 7 days after preparation comparing to immediate sampling (p<0.05). The analysis between groups showed that Wave One Gold and One Shape New Generation promoted greater bacterial reduction than Wave One and One Shape systems (p<0.05). No significant difference was found between Wave One Gold and One Shape New Generation or between Wave One and One Shape (p>0.05). It can be concluded that Wave One Gold and One Shape New Generation promote greater bacterial removal than their predecessor systems.

O objetivo foi avaliar através da Microscopia Confocal de Varredura a Laser (MCVL) e cultura microbiológica (CM) a influência do veículo propilenoglicol e água destilada e agitação ultrassônica (U) na atividade antimicrobiana e penetrabilidade de pastas de hidróxido de cálcio (HC), em diferentes tempos de manutenção da medicação intra-canal. Para isso cento e noventa e três tubos de dentina bovina padronizados foram infectados com Enterococcus faecalis em caldo BHI (Brain Heart Infusion) utilizando um novo protocolo de contaminação com dois ciclos de centrifugação por 5 dias. Durante o período experimental os espécimes foram divididos em 8 grupos de acordo com o veículo da pasta de HC, água destilada (Ad) e propilenoglicol (prop), com o uso do ultrassom, e tempo experimental e de 7 e 15 dias: Grupo1- HC+pro+15d, Grupo 2 HC+prop+U+15d, Grupo3 HC+prop+7d, Grupo 4 HC+prop+U+7d Grupo5- HC+Ad+15d, Grupo 6 HC+Ad+U+15d, Grupo7 HC+Ad+7d, Grupo8 HC+Ad+U+7d . A agitação ultrassônica foi realizada durante 1 minuto nas direções vestíbulo-lingual e mésio-distal, com o auxílio de um inserto liso. As medicações permaneceram no interior dos espécimes durante cada período experimental. A MCVL analisou as bactérias viáveis (verde) e mortas (vermelho), com o auxílio do corante Live and Dead® nos tubos de dentina após o período de medicação. A contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFCs) foi realizada a partir da cultura microbiológica (CM). As raspas de dentina foram coletadas e diluídas para semeadura em placas de Petri com ágar BHI. Para a penetração foi utilizado o corante Rodamina B durante a manipulação das pastas de HC e as análises feitas por MCVL. O grupo 3 e 7 mostraram a maior viabilidade bacteriana nos tubos de dentina contaminados e os demais grupos as menores. A agitação ultrassônica (U) reduziu significativamente a viabilidade bacteriana, nos diferentes períodos. A pasta de HC + Prop+U 7 e 15 dias, mostraram-se mais eficazes, seguidas pela pasta HC+Ad+U+15. Concluiu-se que todas as pastas demonstraram ação antimicrobiana contra E. faecalis e com melhor desempenho quando potencializadas com ultrassom, mesmo em períodos de 7 dias, podendo ser de escolha clínica um curativo que permaneça menor tempo no interior do canal com a mesma efetividade, otimizando o tratamento endodôntico. / The purpose was to evaluate using Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and microbiological cultures (MC) of infected dentin the influence of veicol propylene glycol (prop) or distilled water (Ad) and ultrasonic agitation (U) on the antimicrobial potential and penetrability of calcium hydroxide (CH) pastes). one hundred ninetythree cylindrical dentin specimens were infected with Enterococcus faecalis in BHI broth using a new contamination protocol for 5 days with centrifugations. During the experimental period, the specimens were divided into 8 groups and dressed with the following during 7 or 15 days: Group1- HC+pro+15d, Group 2 HC+prop+U+15d, Group 3 HC+prop+7d, Group 4 HC+prop+U+7d Group 5- HC+Ad+15d, Group 6 HC+Ad+U+15d, Group 7 HC+Ad+7d, Group 8 HC+Ad+U+7d. The ultrasonic activation was made during 1 minute in both directions (buccal-lingual / mesio-distal), with the aid of a plain point insertion. The medications remained in the root canals for each experimental period. The CLSM analyzed the viable (green) and dead (red)bacteria in the infected dentinal tubules, with Live and Dead dye. The colony forming units (CFUs) count was made possible with the MC method. The dentinal wall debris were collected and diluted to be seeded on Petri BHI-agar plates. For the penetration test, the dye Rodamine B was added to CH pastes during the manipulation and analysed by CLSM. The groups 3 and 7 showed the greatest bacteria viability in the infected dentinal tubes and the other groups the lowest,. The pastes HC + Prop+U 7 and 15 days performed more efficacy, followed by HC+Ad+U+15d paste . We conclude that all the paste tested demostrated antimicrobial activity against E. faecalis from calcium hydroxide paste with propylene glycol and distilled water when leveraged with ultrasound, even in periods of seven days. Therefore, a dressing that remains less time inside the root canal with the same effectiveness can be the choice in clinical practice, optimizing the endodontic treatment.

Enterococcus são cocos gram-positivos que ocorrem isolados, aos pares (diplococos) ou em cadeias e pertencem à microbiota intestinal de uma grande variedade de hospedeiros, de mamíferos a insetos. Enterococcus foram originalmente considerados organismos de pouca importância clínica, mas têm se revelado importantes patógenos nosocomiais. O fato dos Enterococcus possuírem formas de resistência intrínseca e adquirida a vários antibióticos dificulta o tratamento de infecções causadas por eles. Enterococcus faecalis é geralmente a espécie predominante entre os enterococos isolados, sendo de 80% a 90% das amostras clínicas. O surgimento de Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE- do inglês vancomycin resistant enterococci) reduziu significativamente as opções de tratamento. O objetivo deste estudo foi identificar e comparar amostras de E. faecalis resistentes à vancomicina (VREfs) isolados em pacientes nos anos de 2009 e 2011, durante um programa de vigilância no Hospital Risoleta Tolentino Neves, em Belo Horizonte, MG. A identificação das espécies foi feita por multiplex-PCR com primers espécie-específicos e os E. faecalis foram selecionados para estudo. Foram realizadas a pesquisa da presença dos genes elrA, cylLL, esp e gelE, a determinação do genótipo responsável pela resistência e a caracterização do transposon que contém o gene de resistência, todos por meio de PCR. Foi também realizada a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de acordo com o CLSI (2013) para vancomicina, linezolida, tigeciclina e daptomicina e testes para resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Por fim, a tipagem das amostras foi feita através de eletroforese em campo pulsado (PFGE- do inglês Pulsed Field Gel Eletroforesis) e MLST (Multilocus sequence typing). Foi encontrado que 22,2% dos VRE isolados em 2009 e 61,7% dos isolados em 2011 pertencem à espécie E. faecalis e estes foram utilizados no estudo. Houve surgimento de resistência à tigeciclina nos isolados de 2011, sendo 10 isolados resistentes, logo após o início do uso deste antimicrobiano no hospital. Foi encontrado um isolado de 2011 com resistência intermediária à linezolida. Todos os isolados foram sensíveis à daptomicina e altamente resistentes à vancomicina, com CIM maior que 256 &mu;g/mL. Essa alta resistência à vancomicina é condizente com o genótipo Vana, encontrado em todas as amostras. O perfil de virulência prevalente nos VREfs em 2009 era elrA+gelE+, sendo dos pulsotipos A1 e A4 e ST103. Apenas um isolado de 2009, com pulsotipo A1 apresentou o perfil de virulência cyl+elrA+gelE+. Em 2011, o perfil de virulência prevalente foi cyl+esp+elrA+gelE+, sendo que os 12 isolados com esse perfil pertenciam aos pulsotipos B e C e ST6, que ocorreram somente em isolados de 2011. Onze amostras de 2011 apresentaram o perfil elrA+gelE+ e foram classificadas no pulsotipo A e seis amostras tem perfil cyl+elrA+gelE+ e são dos pulsotipos B e D. Resultados de PFGE mostram a inserção no hospital da linhagem ST6, um clone multirresistente amplamente disseminado em hospitais da Itália, Portugal, Espanha e Estados Unidos. Concluiu-se que houve mudanças no perfil de E. faecalis resistentes à vancomicina no hospital, ao longo dos dois anos, com aumento de resistência e linhagens mais virulentas, sendo estes motivos de preocupação. / Enterococci are Gram-positive cocci occurring isolated, in pairs (diplococci) or chains and belong to the intestinal tract of a wide variety of hosts, from mammalian to insect. Enterococcus organisms were originally considered of little clinical importance, but have proved important nosocomial pathogens. The fact that Enterococcus possess intrinsic and acquired resistance to multiple antibiotics complicates the treatment of infections caused by them. Enterococcus faecalis is usually the predominant species among enterococci isolates, with 80% to 90% of the clinical samples. The emergence of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) significantly reduced the treatment options. The aim of this study was to identify and compare samples of vancomycin- resistant E. faecalis (VREfs) in patients in the years 2009 and 2011, during a surveillance program in Hospital Risoleta Tolentino Neves, Belo Horizonte, MG. Species identification was done by multiplex-PCR with primers species-specific and E. faecalis were selected for this study. Tests were conducted for the presence of genes elrA, cylLL, esp and gelE, the determination of the genotype responsible for the resistance and characterization of transposon containing the resistance gene, all by PCR. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined according to the CLSI (2013) to vancomycin, linezolid, daptomycin and tigecycline and tests for resistance to high concentrations of aminoglycosides. Finally, the samples typing was performed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). It was found that 22.2 % of VRE isolates in 2009 and 61.7 % of isolates in 2011 belong to the species E. faecalis and these were used in the study. There was emergence of tigecycline resistance in 2011, with 10 resistant isolates, after the introduction of this drug in the hospital. One isolate from 2011 showed intermediate resistance to linezolid. All isolates were sensitive to daptomycin and highly vancomycin resistant, with MICs greater than 256 mg / mL. This high resistance to vancomycin is consistent with the vanA genotype found in all samples. The virulence profile prevalent in VREfs in 2009 was elrA+gelE+, belonging to the pulsotypes A1 and A4 and ST103. Only one isolate from 2009, presented pulsotype A1 and the virulence profile cyl+elrA+gelE+. In 2011, the prevalent virulence profile was cyl+esp+elrA+gelE+, and the 12 isolates with this profile belonged to pulsotypes B and C and ST6, which occurred only in 2011 isolates. Eleven isolates from 2011 have the profile elrA+gelE+ and were classified as pulsotype A, six isolates have profile cyl+elrA+gelE+ and are of pulsotypes B and D. PFGE results show the insertion of ST6 lineage in the hospital, a multiresistant clone widely disseminated in hospitals in Italy, Portugal, Spain and the United States. It was concluded that there were changes in the profile of E. faecalis resistant to vancomycin in the hospital over the two years, with increased resistance and more virulent strains, which are of concern.

Além do aspecto nutricional de suma importância, é notória a contribuição do leite humano para o processo de desenvolvimento da microbiota intestinal do recémnascido, um importante mecanismo de defesa do organismo contra doenças infecciosas. O papel do leite humano como fonte de bactérias probióticas, principais constituintes da microbiota intestinal, tem sido tópico de pesquisas recentes. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de determinar e comparar a composição da microbiota de oito amostras de leite humano e verificar o potencial de utilização desse produto como fonte de bactérias probióticas. Para tanto, utilizaram-se cinco meios de cultivos seletivos para contagem presuntiva de gêneros normalmente encontrados em leite humano: lactococos, enterococos, bifidobactérias e propionibactérias. A análise quantitativa da microbiota demonstrou tendência de diminuição da contagem em função do aumento do tempo de lactação. A análise qualitativa confirmou a presença de distintos gêneros de bactérias lácticas potencialmente probióticas com algumas variações entre as amostras de leite humano. Na segunda etapa 800 colônias isoladas a partir dos cinco meios de cultivos e caracterizadas como bactérias lácticas foram selecionadas quanto às suas propriedades probióticas (produção de bacteriocina, tolerância à acidez e a sais biliares, resistência à antibióticos, capacidade de adesão a chapas de aço inoxidável) e tecnológicas (capacidade de crescimento e sobrevivência em leite). Verificou-se que apenas 15 (1,9%) linhagens produziram bacteriocinas com atividade contra Listeria innocua L11 e Micrococcus luteus ATCC®4698, linhagens utilizadas como indicadoras, por meio do método de antagonismo simultâneo em poços, usando ágar MRS. Treze dessas linhagens também apresentaram atividade contra Bacillus cereus CTC 011, Listeria monocytogenes ATCC®7644, Lactococcus lactis subsp. lactis CTC 204 e Lactobacillus helveticus ATCC®15009. As duas linhagens remanescentes demonstraram atividade principalmente contra Listeria monocytogenes ATCC®7644. Nenhuma das quinze culturas produtoras de bacteriocinas apresentou atividade contra as bactérias Gram-negativas Escherichia coli ATCC® 2074 e Salmonella thyphimuirim ATCC® 2364. Por outro lado, Staphylococcus aureus ATCC® 1602 foi resistente as quinze bacteriocinas selecionadas neste trabalho. Seis linhagens de bactérias lácticas (BALs) foram selecionadas para avaliação das demais propriedades probióticas. Observou-se que uma dessas linhagens diferenciou-se por apresentar sobrevivência a pH 2,0 e a pH 3,0, enquanto as demais mostraram tolerância apenas a pH 3,0. Todas as linhagens selecionadas apresentaram a capacidade de tolerância a 0,3% de sais biliares, de se aderir à superfície de aço inoxidável e de resistência à clindamicina, eritromicina e gentamicina. Quanto às propriedades tecnológicas, todas as seis linhagens apresentaram capacidade de crescimento em leite e não produziram odor desagradável ou pós-acidificação do leite fermentado durante a estocagem a 4ºC por 28 dias. Notou-se, entretanto, diminuição, de, aproximadamente, 2,0 Log UFC.mL-1, na contagem de células viáveis ao final do período de estocagem. Finalmente, por meio da avaliação dos perfis de fermentação de carboidratos e de outras reações bioquímicas, duas das linhagens isoladas de leite humano foram identificadas como Enterococcus durans e quatro como Enterococcus avium. Os 12 resultados permitem concluir que o leite humano é fonte potencial de bactérias com potencial probiótico para aplicação industrial. / In addition to the nutritional aspect of paramount importance, it is clear the contribution of human milk for the development process of the intestinal tract of the newborn, an important mechanism of defense against infectious diseases. The role of human milk as a source of probiotic bacteria, major constituents of the intestinal microbiota, has been the topic of recent research. This work was carried out to determine and compare the composition of the microbiota of eight human milk samples and verify the potential use of this product as a source of probiotic bacteria. For this purpose, we used five selective culture media for counts of presumptive genera commonly found in human milk: lactococcal, enterococci, bifidobacteria and propionibactérias. The quantitative analysis of microbes showed a trend of decreasing counts as a function of time increased lactation. The qualitative analysis confirmed the presence of different kinds of potentially probiotic lactic acid bacteria with some variations between samples of human milk. In the second stage 800 colonies isolated from the five culture media and characterized as lactic acid bacteria were selected for their probiotic properties (bacteriocin production, tolerance to acid and bile salts, antibiotic resistance, adhesion to stainless steel plates) and technology (ability to grow and survive in milk). It was found that only 15 (1.9%) produced bacteriocin strains with activity against Listeria innocua L11 and Micrococcus luteus ATCC 4698®, strains used as an indicator, by the method of antagonism wells simultaneously, using MRS agar. Thirteen of these strains also showed activity against Bacillus cereus CTC 011, Listeria monocytogenes ATCC® 7644, Lactococcus lactis subsp. CTC 204 lactis and Lactobacillus helveticus ATCC 15009®. The two remaining strains showed activity mainly against Listeria monocytogenes ATCC 7644®. None of the fifteen cultures producing bacteriocins active against Gram-negative Escherichia coli ATCC 2074® and Salmonella thyphimuirim ATCC 2364®. Moreover, Staphylococcus aureus ATCC 1602® was resistant the fifteen bacteriocins selected in this work. Six strains of lactic acid bacteria (BALs) were selected for analysis of other probiotic properties. It was observed that one of these strains distinguished by presenting survival at pH 2.0 and pH 3.0 while the other showed only tolerance to pH 3.0. All strains were selected for the ability tolerance of 0.3% bile salts, of adhering to stainless steel surface and resistance to clindamycin, erythromycin and gentamycin. The technological properties, all six strains were capable of growth in milk and produced no unpleasant odor or post-acidification of the fermented milk during storage at 4°C for 28 days. It was noted, however, decreased from approximately 2,0 Log UFC.mL-1 in the viable cell count at the end of storage period. Finally, by evaluating the profiles of fermentation of carbohydrates and other biochemical reactions, two of the strains isolated from human milk have been identified as Enterococcus durans and Enterococcus avium as four. The results indicate that human milk is a potential source of probiotic bacteria with potential for industrial application.

A presença de microrganismos no interior do sistema de canais radiculares é a principal causa do fracasso na terapia endodôntica. A importância da sanificação durante o preparo do canal fica clara, portanto. Dentre os microrganismos isolados nos casos de insucesso o Enterococcus faecalis é comumente encontrado. O E. faecalis é um microrganismo resistente à terapia endodôntica, à medicação intracanal de hidróxido de cálcio e sua presença contribui para o insucesso em Endodontia. A radiação laser apresenta características antimicrobianas que podem auxiliar no tratamento endodôntico. Esse estudo tem por objetivo avaliar o grau de descontaminação provocado pelo uso do laser de diodo de alta potência na dentina radicular em profundidade, após preparo químico-cirúrgico in vitro. Foram utilizadas 30 raízes de dentes unirradiculares ? esterilizadas em autoclave - que depois de inoculadas por E. faecalis cepa ATCC 29212 durante 4 semanas, foram divididas em 3 grupos: grupo 1 instrumentação rotatória - K3 (Sybron Endo, Orange, CA, EUA) com hipoclorito de sódio 0,5 % e creme Endo PTC, irrigação final com EDTA-T 17 % e posterior irradiação com laser de diodo de alta potência com comprimento de onda 830 nm na potência de 3 W por 5 s com 4 repetições segundo Gutknecht; grupo 2 instrumentação, como grupo 1, sem irradiação e grupo 3 apenas irrigação com 20 mL de solução fisiológica estéril. Os espécimes foram divididos em três terços (cervical, médio e apical), tiveram suas paredes dentinárias desgastadas por brocas Batt e as raspas, bem como o cilindro externo restante de dentina foram imersos em 1 mL de água peptonada. Assim alíquotas foram semeadas em meio seletivo mEnterococcus, em triplicata para contagem de unidades formadoras de colônias. Os resultados foram tratados estatisticamente pelo teste Kruskal-Wallis com método de comparação Dunn e apresentaram as seguintes médias: Grupo 1 ? 0, Grupo 2 ? 2,77 X 102, Grupo 3 ? 171 X 102 u.f.c./mL; com diferenças estatísticas significantes entre os 3 grupos (p<0,05). Em porcentagens, a redução da microbiota provocada pelo Grupo 1 foi de 100% e do Grupo 2 de 98,39% ambas em relação ao Grupo 3 (controle). A irradiação do laser de diodo nos parâmetros e amostras testadas foi eficaz na redução da contaminação em profundidade da dentina radicular frente ao Enterococcus faecalis. / The main cause for failure in Endodontics is the presence of microorganisms in root canal system. Enterococcus faecalis is a resistant microorganism presents in failure endodontic treatment. Therefore the disinfection plays fundamental rule in endodontic therapy. The laser irradiation presents properties that may improve the treatment success rates, reducing the microbial contamination. The aim of this study is evaluate the disinfection degree in depth caused by diode laser irradiation after chemomechanical procedures in vitro. Thirty extracted dental roots were sterilized by autoclave, inoculated by strain of Enterococcus faecalis ATCC 29212 during 4 weeks, and then randomly divided in 3 groups. Group 1: 10 specimens were instrumented by rotary files K3 (Sybron Endo, Orange, CA, USA) with 0.5 % sodium hypochlorite and urea peroxide (Endo PTC cream, Oficinalis Farmácia de Manipulação, São Paulo, SP, Brazil). At the end irrigation by 17 % EDTA-T was performed. The specimens were irradiated intracanal by diode laser 830 nm wavelength 3 W during 5 seconds, four times. Group 2: same procedures of group 1 without laser irradiation. Group 3: irrigation by saline solution. The specimens were divided in three thirds (apical, middle and cervical). Samples of dentin were obtained with carbide burs from inner canal walls of each third. The samples were immersed in 1 mL of peptonic water, and then aliquots were sowed to count viable cells in mEnterococcus agar (Difco?, Becton Drive, NJ, USA). The groups showed the following means: Group 1 ? 0, Group 2 ? 2,77 X 102 and Group 3 ? 171 X 102 CFU/mL. The disinfection degree achieved was 100 % in group 1, 98,39 % in group 2 both compared with group 3. The Kruskal-Wallis statistical analysis with Dunn method of comparison shows better results in group with diode laser irradiation (p<0.05), followed by group 2 and 3. Irradiation by diode laser in that samples and parameters achieved disinfection improvement in root dentin depth.

Enterococcus são associados à microbiota intestinal de mamíferos e aves. Além dos primatas apresentarem estreita relação evolutiva com seres humanos, é pouco conhecido o impacto da resistência antimicrobiana associada às bactérias comensais, como os enterococos. O trabalho teve como objetivo identificar e caracterizar enterococos isolados de amostras fecais de macacos-prego (Sapajus nigritus) em relação a determinantes de resistência e virulência. As amostras foram coletadas de animais vivendo em cativeiro no Zoológico de Sapucaia do Sul (ZOO) e selvagens, nas cidades de São Sebastião do Caí (SSC) e Santa Cruz do Sul (SCS). As espécies isoladas foram identificadas utilizando a técnica de MALDI-TOF. Estas foram testadas frente a 12 antimicrobianos através do método disco difusão. Genes que conferem resistência à tetraciclina (tetM, tetL e tetS), fluoroquinolonas (gyrA), eritromicina (msrC e ermB) e virulência (agg, esp, cylA, ace e gelE) foram detectados por PCR. Foram identificados 296 isolados de Enterococcus sp. oriundos de 24 amostras fecais de macacos-prego. Destes, 137 eram oriundos de amostras de SSC, 86 de SCS e 73 do ZOO. A espécie mais encontrada foi E. faecalis (42,6 %), seguida de E. hirae (29,4 %) e E. faecium (15,5 %). Cento e noventa e nove amostras (67,2 %) apresentaram suscetibilidade reduzida a antimicrobianos. As amostras apresentaram menos suscetíveis para rifampicina (46,3 %), tetraciclina (26,0 %) e eritromicina (22,3 %). Entre os isolados, E. faecalis (69,0 %) apresentou as maiores frequências de suscetibilidade reduzida. Em relação ao local de coleta, 69,3 % dos isolados das amostras SSC apresentaram suscetibilidade reduzida a antimicrobianos, 69,7 % dos isolados das amostras SCS e 60,2 % dos isolados das amostras do ZOO, sendo atribuído perfil de múltipla resistência a 29 isolados de SSC, 6 isolados SCS e 8 de ZOO. As amostras ZOO apresentaram maiores índices para os genes de resistência msrC (81,8 %), gyrA (60,7 %) e tetL (44,4 %). Para o gene tetM os isolados de SCS apresentaram maior frequência (100 %). As amostras SSC e SCS apresentaram as maiores porcentagens para o gene gelE (100 %). Para esp (3,5 %), ace (93,0 %) e agg (10,5 %), as amostras SCS apresentaram as maiores porcentagens. As presenças de determinantes de resistência e virulência nas amostras foram atribuídas tanto à ação antropogênica encontrada no habitat dos macacos como através do próprio resistoma ambiental. Ainda, a proximidade dos animais com o ser humano demonstrou ser uma das principais fontes de disseminação de resistência bacteriana. / Enterococcus is associated with the intestinal microbiota of mammals and birds. In addition to primates having a close evolutionary relationship with humans, the impact of antimicrobial resistance associated with commensal bacteria, such as enterococci, is little known. The objective of this work was to identify and characterize isolates of enterococci from faecal samples of black capuchin monkey (Sapajus nigritus) in relation to determinants of resistance and virulence. The samples were collected from animals living in the Sapucaia do Sul Zoo (ZOO) and wild, in the cities São Sebastião do Caí (SSC) and Santa Cruz do Sul (SCS). The isolated species were identified using the MALDI-TOF technique. These were tested against 12 antimicrobials using the disc diffusion method. Genes that confer resistance to tetracycline (tetM, tetL and tetS), fluoroquinolones (gyrA), erythromycin (mrsC and ermB) and virulence (agg, esp, cylA, ace and gelE) were detected by PCR. It were identified 296 isolates of Enterococcus sp. from 24 faecal samples of S. nigritus. Of these, 137 were from SSC samples, 86 from SCS and 73 from ZOO. The most common species was E. faecalis (42.6 %), followed by E. hirae (29.4 %) and E. faecium (15.5 %). One hundred and ninety-nine samples (67.2%) presented reduced antimicrobial susceptibility. The samples were less susceptible to rifampicin (46.3%), tetracycline (26.0%) and erythromycin (22.0%). Among the isolates, E. faecalis (69.0%) had the highest frequencies of reduced susceptibility. Regarding the collection site, 69.3% of the SSC isolates presented reduced susceptibility to antimicrobials, 69.7% of the isolates from the SCS samples and 60.2% from the isolates from the ZOO samples, with a multiple resistance profile 29 SSC isolates, 6 SCS isolates and 8 ZOO isolates. The ZOO samples presented higher indices for the resistance genes msrC (81.8%), gyrA (60.7%) and tetL (44.4%). For the tetM gene the SCS isolates showed a higher frequency (100%). The SSC and SCS samples showed the highest percentages for the gelE gene (100%). For esp (3.5%), ace (93.0%) and agg (10.5%), the SCS samples presented the highest percentages. The presences of resistance and virulence determinants in the samples were attributed both to the anthropogenic action found in the monkey habitat and through the environmental resistance itself. Furthermore, the proximity of animals to humans has been shown to be one of the main sources of dissemination of bacterial resistance.