Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-17Bitstream added on 2014-06-13T19:20:40Z : No. of bitstreams: 1 arandagarcia_aj_dr_arafo.pdf: 276892 bytes, checksum: ce8d5151d3d18872dcf1b45140fe73e1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade antibacteriana de soluções irrigadoras e do sistema Endox Plus no preparo de canais radiculares. Capítulo 1 - Para comparar a efetividade antibacteriana da solução de hipoclorito de sódio (NaOCl), MTAD BioPure e do Sistema Endox Plus durante o preparo biomecânico, foram utilizadas 70 raízes de dentes humanos unirradiculados contaminadas com cepa de E. faecalis (ATCC 29212) e incubadas por 21 dias. Os espécimes foram divididos em cinco grupos: GI- Sistema Endox Plus, GII- NaOCl 2.5 % /MTAD, GIII- NaOCl 2,5% /EDTA, GIV- solução salina (controle positivo), GV- Controle negativo (sem instrumentação/irrigação). Foi realizada a análise microbiológica das amostras por meio de diluições seriadas e a contagem das UFCs. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente por ANOVA e Tukey post-hoc (p < 0,05). Todos os espécimes mostraram crescimento bacteriano após o período de contaminação com similar contagem de UFC/mL log, sem diferença estatística entre os grupos. Após os procedimentos houve uma redução da quantidade de bactérias em todos os grupos, exceto no controle negativo. Não houve diferenças estatísticas significantes entre os GI e GIV. Os grupos II e III não mostraram crescimento bacteriano, mostrando diferença estatística com os outros grupos. Na coleta final, houve um aumento na contagem bacteriana nos grupos I, II, III e IV, sem diferença significativa entre eles. Porém, houve diferença na proliferação bacteriana quando comparados com a coleta pós-preparo. O sistema Endox Plus demonstrou a menor efetividade antibacteriana quando comparado às soluções de NaOCl 2,5% /MTAD e NaOCl 2,5% /EDTA e, todos os procedimentos avaliados permitiram a proliferação bacteriana após 7 dias, mostrando a permanência... / The aim of this study is to evaluate the antimicrobial effectiveness of irrigating solutions and the Endox Plus system in the treatment of the root canals. Chapter I- In order to compare the antimicrobial effectiveness of sodium hypochlorite solution (NaOCl), MTAD Biopure and Endox Plus system during chemomechanical preparation, were used 70 single-rooted human teeth, which were contaminated with the strain of E. faecalis (ATCC 29212) and incubated for 21 days. The specimens were divided into five groups: GI- Endox Plus system, GII- NaOCl 2.5% /MTAD, GIII- NaOCl 2.5% /EDTA, GIV- saline solution (positive control), GV- negative control (without instrumentation/irrigation). Microbiological analysis of the samples consisted in evaluation of the CFUs. The data obtained were statistically analyzed by ANOVA tests and Tukey post-hoc (p<0.05). The specimens showed bacterial growth after the initial incubation period with similar counting of CFU/mL log, with no statistical difference among the groups. After the procedures there was a decrease of the amount of bacteria in all groups, except in the negative control. There were no statistically differences between the GI and GIV. The GII and GIII didn’t show bacterial growth, showing statistical differences with the other groups. In the final sample, bacterial counts increased in groups I, II, III, IV, with no statistically significant differences among the groups, but there was a difference when compared to the post-instrumentation sample. The Endox Plus system presented the lowest antibacterial effectiveness when compared to the solutions of NaOCl 2.5% /MTAD y NaOCl 2.5% /EDTA and all the evaluated procedures allowed the recovery of bacteria 7 days after treatment, demonstrating persistence of infection in the root canal system. Chapter II- The antibacterial... (Complete abstract click electronic access below)

O meio ambiente aquático vem recebendo grande carga de poluição fecal, sendo este um dos fatores que contribuem para sua degradação. O objetivo deste trabalho foi identificar bactérias do gênero Enterococcus em oito pontos ao longo da Lagoa dos Patos – RS, com diferentes níveis de degradação ambiental e verificar a resistência a antimicrobianos nestes isolados. Foi observado que nos pontos situados no Parque Itapuã e na praia do Cassino as contagens de Enterococcus sp. foram baixas. Os pontos situados em Tapes e São Lourenço do Sul apresentaram níveis elevados de contagens de Enterococcus sp no verão e na primavera e os pontos na região estuariana de Rio Grande apresentaram valores elevados no outono e inverno. Dentre os antimicrobianos testados a resistência a tetraciclina e a doxaciclina foram verificadas em todos os pontos de coleta, sendo que as maiores percentagens de isolados resistentes foram na região estuarina de Rio Grande. Os Enterococcus spp também apresentaram suscetibilidade diminuída para ampicilina, gentamicina (120μg/ml) e estreptomicina (300 μg/ml) e nenhuma para vancomicina. Entre os isolados resistentes a tetraciclina, as duas espécies mas frequentemente identificadas foram E. faecalis e E. faecium. O nível de resistência à tetraciclina, verificada através da Concentração Inibitória Mínima (CIM), variou de 16μg/ml a 256μg/ml nas duas espécies. Isolados de E. faecalis foram encontrados mais em Tapes e São Lourenço do Sul e E. faecium na região estuarina de Rio Grande, os últimos apresentaram os maiores níveis de resistência a tetraciclina e gentamicina. Os resultados do presente estudo indicam que a contaminação fecal pode estar relacionada ao descarte de dejetos humanos e de animais nestes locais. / The aquatic environment has been receiving a great amount of fecal pollution and this is one of the factors that contribute to its degradation. The aim of the present study was to identify Enterococcus sp in eight collection points with different levels of environmental degradation at Lagoa dos Patos/RS and to verify the antimicrobial resistance among these isolates. We verified low numbers of Enterococcus sp in Parque Itapuã e Praia do Cassino collection points. In Tapes and São Lourenço do Sul, higher counting of Enterococcus were observed during summer and spring seasons and at the estuarine area of Rio Grande, higher numbers were observed during autumn and winter. Among the antimicrobial drugs tested, the resistance to tetracycline and doxycycline was detected in all collection sites and the highest percentages of resistant isolates were in the estuarine area of Rio Grande. The Enterococcus spp have also presented diminished susceptibility to ampicillin, gentamicin (120μg/ml) and streptomycin (300 μg/ml) and none to vancomycin. Among the isolates resistant to tetracycline, E. faecalis e E. faecium were the most identified species. The resistance level to tetracycline, verified by MIC analysis, varied from 16μg/ml to 256μg/ml in both species. E. faecalis isolates were found mostly in Tapes and São Lourenço and E. faecium, in the estuarine area of Rio Grande and among these, the higher level of resistance to tetracycline and gentamycin was verified. The results from the present study indicate that the fecal contamination from this sampling points can be related to the discharge of human and animal waste.

Cofatores ferro-enxofre são grupos prostéticos inorgânicos ubíquos e evolutivamente ancestrais, cuja formação é dependente de complexas maquinarias protéicas. Três sistemas de formação distintos já foram determinados, denominados sistemas NIF, ISC e SUF. Apesar de bem descritos em diversos organismos, estas maquinarias são pouco caracterizadas no filo Firmicutes, o qual agrupa diversas bactérias patogênicas, e onde Enterococcus faecalis aparece como um representante clinicamente relevante. O objetivo deste estudo foi identificar a maquinaria biossintética de formação dos cofatores [Fe-S] de E. faecalis mediante análises de bioinformática, determinação das regiões promotoras do operon e de elementos cis-atuantes, padrão de expressão gênica, caracterização bioquímica dos elementos encontrados e comparação entre as maquinarias de associação do cofator [Fe-S] presente em Proteobacteria e Firmicutes através da capacidade de complementação deste sistema nos sistemas ISC e SUF de Azotobacter vinelandii e Escherichia coli, respectivamente. Metodologias de bioinformática permitiram identificar representantes da maquinaria SUF de formação dos cofatores [Fe-S], previamente identificado em Proteobacteria, apresentando os genes sufB, sufC, sufD e sufS e a presença de sufU, o único representante homólogo do sistema ISC, codificando possível proteína arcabouço, no lugar de sufA; da mesma forma, sufE e sufR não foram identificadas. A alta conservação deste sistema foi verificada em Firmicutes através de análises filogenéticas. Análise de sequências primária e estrutural de SufU verificaram um padrão estrutural similar à IscU. Modelagem molecular de SufU de E. faecalis apresentou dados de alta flexibilidade na região do sítio ativo, bem como a presença de região específica em Firmicutes, denominada região Gram-positiva (GPR), possivelmente envolvida em interações com outros fatores e/ou reguladores. SufU e o complexo SufSU são capazes de reconstituir cofactor [4Fe-4S], apresentando-se portanto como a proteína arcabouço do sistema. A enzima SufS purificada apresenta PLP ligado como cofator e atividade de cisteína desulfurase. Esta enzima apresenta um residuo catalítico essencial de cisteína na posição 365 , e necessita SufU como ativador, onde outro residuo de cisteína (128) atua como aceptor do enxofre durante a reação de transpersulfuração. SufC apresenta atividade ATPase, porém em nível reduzido em comparação ao homólogo de E. coli; SufD apresenta alta similaridade com homólogo de proteobactérias. Por outro lado, SufB não apresenta os resíduos de cisteína previamente descritos como importantes na formação dos cofatores [Fe-S] em outros organismos, assim sua função no sistema ainda deve ser determinada. Experimentos in vivo demonstraram a conservação específica de sistemas biossintéticos dos cofatores [Fe-S], onde o operon SUF de E. faecalis não foi capaz de complementar os sistemas ISC de Proteobacteria, porém complementou sistema SUF de E. coli, tornando viáveis mutantes de ambos os operons sufABCDSE e iscRSU-hscBA-fdx. / Iron-sulfur clusters are ubiquitous and evolutionary ancient inorganic prosthetic groups, which biosynthesis depends on complex protein machineries. Three distinct assembly systems involved in the maturation of cellular Fe-S proteins have been determined, designated the NIF, ISC and SUF systems. Although well described in several organisms, these machineries are poorly understood in the Firmicutes phylum, which groups several pathological bacteria, where Enterococcus faecalis rises as a clinical relevant representative. The aim of this study was to identify the E. faecalis [Fe-S] cluster biosynthetic machinery through bioinformatics analysis, determination of operon promoter regions and cis-acting elements, relative genetic expression pattern, biochemical characterization of putative elements, and comparison of Proteobacteria and Firmicutes machineries through the ability of complementing Azotobacter vinelandii and Escherichia coli ISC and SUF systems, respectively. Bioinformatics methods enabled us to identify representatives of the SUF machinery for [Fe-S] cluster biosynthesis, previously verified in Proteobacteria showing conserved sufB, sufC, sufD and sufS genes and the presence of sufU, the only ISC homolog representative, coding for putative scaffold protein, instead of sufA; neither sufE nor sufR are present. High conservancy of this system for Firmicutes bacteria was verified through phylogenetic analysis. Primary sequences and structural analysis of the SufU protein demonstrated its structural-like pattern to the scaffold protein IscU. E. faecalis SufU molecular modeling showed high flexibility over the active site regions, and demonstrated the existence of a specific region in Firmicutes, the Gram positive region (GPR), a possible candidate for interaction with other factors and/or regulators. SufU is able to reconstitute a [4Fe-4S] cluster, such as the complex SufSU, arising as the scaffold protein in the system. Purified SufS corresponds to a PLP containing enzyme with cysteine desulfurase activity. It encloses a catalytically essential cysteine residue at position 365, and requires SufU as activator, where another cysteine residue (128) works as a proximal sulfur acceptor site for transpersulfurization reaction. SufC presents ATPase activity, though in a reduced level, when compared to the Escherichia coli homolog; SufD also shares high similarity with proteobacterial SufD. On the other hand, SufB does not present cysteine residues previously described as important involved in the [Fe-S] cluster formation process of other organisms, therefor its function in the system still have to be determined. In vivo experiments enabled us to dfemonstrate the conservancy of specific [Fe-S] cluster biosynthetic systems, where E. faecalis SUF operon was not able to complement Proteobacteria ISC systems, but complemented E. coli SUF system, turning viable mutants of both sufABCDSE and iscRSU-hscBA-fdx operons.

Orientador: Samira Esteves Afonso Camargo / Banca: Luana Marotta Reis de Vasconcelos / Banca: Jonatas Rafael de Oliveira / Resumo: A matriz de hidrogel é um biomaterial de nanofibra peptídica tridimensional que induz o crescimento, migração e proliferação celular, assim favorecendo a regeneração tecidual. O objetivo deste trabalho foi avaliar a biocompatibilidade e a atividade antimicrobiana da matriz de hidrogel associado ao extrato romã e ao antimicrobiano ciprofloxacino. Para isso, foram realizadas análises microbiológicas sobre Enterococcus faecalis (ATCC 4083) em cultura planctônica, por meio d ensaio de microdiluição em caldo e em biofilme pelo teste de MTT. Para os ensaios da biocompatibilidade, foi utilizada cultura de macrófagos (RAW 264.7). A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio de MTT e a genotoxicidade foi realizado pelo teste de micronúcleo. A análise estatística foi realizada pelos testes ANOVA e Tukey, adotando o nível de significância 5%. Os resultados demonstraram que a matriz de hidrogel associado ao extrato de romã não apresentou atividade antimicrobiana para a cultura planctônica como para o biofilme de E. faecalis. Porém, não foi citotóxico e genotóxico para RAW 264.7. Por outro lado, o antimicrobiano ciprofloxacino apresentou atividade antimicrobiana sobre E. faecalis,além de ter apresentado efeitos citotóxico e genotóxico para os macrófagos. Com isso, foi possível concluir que o extrato de romã associado ou não a matriz de hidrogel apresenta ausência de citotóxico, genotóxico e efeito antimicrobiano / Abstract: The hydrogel matrix is a three-dimensional peptide nanofiber biomaterial that induces cell growth, migration and proliferation, thus favoring tissue regeneration. The objective of this work was to evaluate the biocompatibility and antimicrobial activity of the hydrogel matrix associated with the pomegranate extract and the antimicrobial ciprofloxacin. For this, microbiological analyzes on Enterococcus faecalis (ATCC 4083) were carried out in planktonic culture, by means of the microdilution test in broth and in biofilm by the MTT test. For the biocompatibility assays, macrophage culture (RAW 264.7) was used. Cytotoxicity was assessed by the MTT assay and genotoxicity was performed by the micronucleus test. Statistical analysis was performed by the ANOVA and Tukey tests, adopting the significance level 5%. The results showed that the hydrogel matrix associated with the pomegranate extract did not show antimicrobial activity for the planktonic culture as for the E. faecalis biofilm. However, it was not cytotoxic and genotoxic for RAW 264.7. On the other hand, the antimicrobial ciprofloxacin showed antimicrobial activity on E. faecalis, besides having cytotoxic and genotoxic effects for the macrophages. With this, it was possible to conclude that the pomegranate extract associated or not with the hydrogel matrix shows absence of cytotoxic, genotoxic and antimicrobial effect / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-29Bitstream added on 2014-06-13T19:11:09Z : No. of bitstreams: 1 farac_rv_me_arafo.pdf: 1835040 bytes, checksum: 8ce4adec47ea9b82faf6b5c365dad5d1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente estudo avaliou, ex vivo, atividade antimicrobiana do ozônio, associado ao veículo propilenoglicol e ao hidróxido de cálcio em canais radiculares contaminados com Enterococcus faecalis. Foram utilizados 50 dentes humanos unirradiculados, doados pelo Banco de Dentes da Faculdade de Odontologia de Araraquara. Após remoção das coroas dentárias, os canais radiculares foram instrumentados até uma lima endodôntica tipo kerr de número 50, e em seguida, os espécimes foram esterilizados, e os canais radiculares contaminados com E. faecalis e incubados a 37 ± 1°C por 21 dias. Os espécimes foram aleatoriamente divididos em cinco grupos experimentais, de acordo com a medicação utilizada: GI – Ozônio com propilenoglicol (n=11); GII - hidróxido de cálcio com paramonoclorofenolcanforado - PMCC (n=11), GIII – propilenoglicol com pó de hidróxido de cálcio ozonizado (n=11), GIV – grupo controle positivo – não foi colocada nenhuma medicação (n=11) e GV – grupo controle negativo – não foram contaminados (n=6). As coletas foram realizadas coletas após sete e quatorze dias e o crescimento microbiano verificado por meio da contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) de E. faecalis. Os resultados que foram submetidos ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn e também pelo teste nãoparamétrico de Friedman sendo ambos com um nível de significância de 0,05, mostraram que o propilenoglicol ozonizado e o hidróxido de cálcio com PMCC reduziram estatisticamente o número de bactérias quando comparados ao grupo controle positivo em 7 e 14 dias, não apresentando diferenças estatísticas entre eles; o hidróxido de cálcio ozonizado não reduziu estatisticamente o número de bactérias quando comparados ao grupo controle positivo em 7 e 14 dias e o propilenoglicol ozonizado e o hidróxido de cálcio PMCC não apresentaram diferença... / This study evaluated in vitro bactericidal effect of ozone associated with the vehicle propylene glycol and calcium hydroxide in root canals contaminated with Enterococcus faecalis. It used 50 single-rooted human teeth, donated by the teeth of the Faculty of Dentistry of Araraquara. After removal of dental crowns, root canals were instrumented to an endodontic kerr file number 50, and then the specimens were sterilized, and the root canals contaminated with Enterococcus faecalis and incubated at 37 ± 1 ° C for 21 days. The specimens were randomly divided into five experimental groups, according to the medication used: GI - ozone with propylene glycol (n = 11), group II - calcium hydroxide with paramonoclorofenolcanforado - PMCC (n = 11), GIII – propylene glycol added powder calcium hydroxide ozoized (n=11), GIV - positive control group - was not placed any medication (n = 11) and GV - negative control group - were not infected (n = 6). Microbiological samples were collected after seven and fourteen days and the microbial growth observed at the count of the number of colony forming units of E. faecalis. The results were analyzed using the nonparametric Kruskal-Wallis followed by Dunn's test and also by the non-parametric Friedman and both with a significance level of 0.05, showed that the propylene ozonized and calcium hydroxide with PMCC statistically reduced the number of bacteria when compared to positive control group at 7 and 14 days, calcium hydroxide ozonized not statistically reduced the number of bacteria when compared to positive control group at 7 and 14 days and propylene ozonized calcium hydroxide and CMCP showed no statistically significant differences in bacterial growth at 7 and 14 days.In a descending order of bactericidal action in the two study periods, is calcium hydroxide PMCC, followed by propylene ozonized and ozonized calcium hydroxide

Orientador: Idomeo Bonetti Filho / Coorientador: Juliane Maria Guerreiro Tanomaru / Banca: Renato de Toledo Leonardo / Banca: Milton Carlos Kuga / Banca: Evandro Watanabe / Banca: Manoel Eduardo de Lima Machado / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade antibacteriana de soluções irrigadoras e do sistema Endox Plus no preparo de canais radiculares. Capítulo 1 - Para comparar a efetividade antibacteriana da solução de hipoclorito de sódio (NaOCl), MTAD BioPure e do Sistema Endox Plus durante o preparo biomecânico, foram utilizadas 70 raízes de dentes humanos unirradiculados contaminadas com cepa de E. faecalis (ATCC 29212) e incubadas por 21 dias. Os espécimes foram divididos em cinco grupos: GI- Sistema Endox Plus, GII- NaOCl 2.5 % /MTAD, GIII- NaOCl 2,5% /EDTA, GIV- solução salina (controle positivo), GV- Controle negativo (sem instrumentação/irrigação). Foi realizada a análise microbiológica das amostras por meio de diluições seriadas e a contagem das UFCs. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente por ANOVA e Tukey post-hoc (p < 0,05). Todos os espécimes mostraram crescimento bacteriano após o período de contaminação com similar contagem de UFC/mL log, sem diferença estatística entre os grupos. Após os procedimentos houve uma redução da quantidade de bactérias em todos os grupos, exceto no controle negativo. Não houve diferenças estatísticas significantes entre os GI e GIV. Os grupos II e III não mostraram crescimento bacteriano, mostrando diferença estatística com os outros grupos. Na coleta final, houve um aumento na contagem bacteriana nos grupos I, II, III e IV, sem diferença significativa entre eles. Porém, houve diferença na proliferação bacteriana quando comparados com a coleta pós-preparo. O sistema Endox Plus demonstrou a menor efetividade antibacteriana quando comparado às soluções de NaOCl 2,5% /MTAD e NaOCl 2,5% /EDTA e, todos os procedimentos avaliados permitiram a proliferação bacteriana após 7 dias, mostrando a permanência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study is to evaluate the antimicrobial effectiveness of irrigating solutions and the Endox Plus system in the treatment of the root canals. Chapter I- In order to compare the antimicrobial effectiveness of sodium hypochlorite solution (NaOCl), MTAD Biopure and Endox Plus system during chemomechanical preparation, were used 70 single-rooted human teeth, which were contaminated with the strain of E. faecalis (ATCC 29212) and incubated for 21 days. The specimens were divided into five groups: GI- Endox Plus system, GII- NaOCl 2.5% /MTAD, GIII- NaOCl 2.5% /EDTA, GIV- saline solution (positive control), GV- negative control (without instrumentation/irrigation). Microbiological analysis of the samples consisted in evaluation of the CFUs. The data obtained were statistically analyzed by ANOVA tests and Tukey post-hoc (p<0.05). The specimens showed bacterial growth after the initial incubation period with similar counting of CFU/mL log, with no statistical difference among the groups. After the procedures there was a decrease of the amount of bacteria in all groups, except in the negative control. There were no statistically differences between the GI and GIV. The GII and GIII didn't show bacterial growth, showing statistical differences with the other groups. In the final sample, bacterial counts increased in groups I, II, III, IV, with no statistically significant differences among the groups, but there was a difference when compared to the post-instrumentation sample. The Endox Plus system presented the lowest antibacterial effectiveness when compared to the solutions of NaOCl 2.5% /MTAD y NaOCl 2.5% /EDTA and all the evaluated procedures allowed the recovery of bacteria 7 days after treatment, demonstrating persistence of infection in the root canal system. Chapter II- The antibacterial... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres humanos, compõem a microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinário. Nas últimas décadas, esses microrganismos se tornaram importantes agentes etiológicos de infecções hospitalares. Uma característica marcante desses microrganismos é a resistência intrínseca a vários antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções, além de alguns fatores que tem sido relacionado à virulência de enterococos. Este estudo investigou a presença de enterococos em amostras de infecção e colonização de pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, dietas hospitalares e manipuladores de alimentos. Foram analisadas 276 amostras de colonização, de quadros de infecção, dietas orais e manipuladores de alimento. Não foram recuperadas amostras dos profissionais de saúde. Todas as amostras foram submetidas a testes convencionais de caracterização do gênero e espécies. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram empregados pelo método de disco difusão, além da CIM para vancomicina e teicoplanina. A produção de biofilme e a expressão da gelatinase também foram avaliadas. Os genes de resistência a gentamicina, estreptomicina e vancomicina e os genes de virulência cylA, esp e fsr foram pesquisados pela técnica de PCR. O polimorfismo genético foi determinado por PFGE. A espécie E. faecalis foi a prevalente nas amostras isoladas de colonização e infecção (42,2% e 81,9%, respectivamente). E. casseliflavus (58,9%) foi a mais freqüente dentre as amostras das dietas hospitalares e E. faecium (46,7%) de manipuladores. Dentre as amostras de colonização as maiores taxas de resistência foram observadas para eritromicina (76,3%) e ciprofloxacina (53,9%). Dentre as amostras de infecção, >70% foram resistentes a eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina. Resistência a níveis elevados de gentamcina (HLR-GE) e estreptomicina (HLR-ST) foi detectada em 24,6% e 20,4% das amostras, respectivamente, e todas foram portadoras dos respectivos genes. A maioria das amostras de colonização (52,6%) e infecção (55,7%) foram multirresistentes. A taxa para resistência a níveis elevados de vancomicina foi de 5,2% e todas eram portadoras do gene vanA. Em relação a formação de biofilme, 70,2% foram produtoras, com uma maior freqüência dentre as de infecção. A expressão de gelatinase foi detectada em 28,9% e 44,3% das amostras de colonização e infecção, respectivamente. Nenhuma das amostras isoladas das dietas hospitalares e de manipuladores expressou gelatinase. Nas amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium (n=109) 16,5%, 51,4% e 48,6% apresentaram produtos de amplificação referentes aos genes cylA, esp e fsr, respectivamente. A análise do polimorfismo genético revelou uma extensa diversidade dentre as amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium, não acarretando um perfil eletroforético prevalente. Entretanto, foi observado um perfil único dentre as amostras de E. gallinarum resistentes a vancomicina (vanA). Este estudo mostrou que amostras de enterococos isoladas de diferentes fontes, não só de quadros infecciosos, podem representar um risco para a população, apontando para uma maior reflexão quanto ao papel desses microrganismos nas infecções humanas, particularmente no ambiente hospitalar. / Enterococci are widespread in the nature. In humans, as in the other animals, gastrointestinal tract, the oral cavity and the genitourinary tract. In recent decades, these microorganisms have emerged as one important of the most pathogen associated with nosocomial infections. They shows intrinsic resistance to several antimicrobial commonly used for treatment of the infections. Several potential virulence factors have been identified in enterococci, but none has been established as having a major contribution to virulence in humans, as well as some factors that has been linked to the virulence of enterococci. We analyzed 276 isolates obtained from colonization, infection, hospital diets and food handlers. The isolates were identified by conventional physiological tests for characterization at genus and species level. Antimicrobial susceptibilities were determined by the disk diffusion test method. CIM to vancomycin and teicoplanin were avayable by E-test. The biofilm production and the expression of gelatinase were also evaluated. The genes for resistance to gentamicin, vancomycin, streptomycin resistance genes as code as determinants virulence cylA, esp and fsr were investigated by PCR. The genetic polymorphism was determined by PFGE. E. faecalis was prevalent species recovered from colonization and infection (42.2% and 81.9%, respectively). E. casseliflavus (58.9%) was frequent species among the hospital diets samples. On the other hand, E. faecium (46.7%) was prevalent in food handlers. Among the colonization isolates the highest rates of resistance were observed to erythromycin (76.3%) and ciprofloxacin (53.9%). Although, >70% of infection isolates were resistant to erythromycin, tetracycline and ciprofloxacin. High level resistance to gentamicin (HLR-GE) and streptomycin (HLR-ST) were detected in 24.6% and 20.4% of the samples, respectively, and these isolates harboured the genes aac(6)-Ie-aph(2)-Ia and aph(2)-Ic. Most strains of colonization (52.6%) and infection (55.7%) were multidrug resistant. High level resistance to vancomycin were detected in 5.2% of isolates harbouring vanA gene. 70.2% of the isolates were biofilm producers, were greater frequency among of infection. The expression of gelatinase was detected in 28.9% and 44.3% of colonization and infection isolates, respectively. None of the isolates recovered from the hospital diets and food handlers expressed gelatinase. In E. faecalis and E. faecium strains (n = 109) 16.5%, 51.4% and 48.6% showed amplification products related cylA, esp and fsr genes, respectively. The analysis of genetic polymorphism showed a wide diversity among the isolates belonging to the E. faecalis and E. faecium species. None prevalent profile was observed. The E. gallinarum vanc1/vanA isolates showed identical PFGE profiles. This study showed that enterococci strains isolated from diferents sources, also represents a potential risk for population, particularly those in hospital environment.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Enterococcus tem emergindo como um dos mais importantes patógenos em infecções relacionadas à assistência à saúde no mundo. Estes microrganismos apresentam habilidade de adquirir genes de resistência a vários antimicrobianos, incluíndo à vancomicina, além de possuir diversos fatores associados à virulência, que contribuem sobremaneira para a sua permanência no hospedeiro, facilitando sua disseminação, particularmente, no ambiente hospitalar. Os objetivos deste estudo foram caracterizar, por testes fenotípicos e genotípicos, amostras de Enterococcus isoladas de quadros infecciosos em pacientes atendidos em quatro instituições de saúde localizadas na cidade do Natal, RN, no período de setembro de 2010 a junho de 2011. As espécies de Enterococcus foram caracterizadas por testes fisiológicos convencionais e por reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex, utilizando oligonucleotídeos específicos para caracterização do gênero e espécies. O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos foi avaliado por testes de difusão em ágar. Os valores de concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina, teicoplanina e linezolida foram determinados pelo emprego do teste E; e o genótipo de resistência à vancomicina foi analisado por PCR. Genes associados à virulência (asa1, cylA, esp, gelE e hyl) foram detectados por ensaios de PCR multiplex. O polimorfismo genético das amostras bacterianas foi avaliado por metodologia de eletroforese em campo pulsado (PFGE), com a utilização da enzima SmaI. Foram obtidas 117 amostras, a partir de quadros infecciosos em 116 pacientes. Os resultados revelaram que a espécie E. faecalis foi a prevalente (91,4%). Os testes de susceptibilidade revelaram que as taxas de resistência mais elevadas estiveram associadas à tetraciclina (58,2%) e a níveis elevados de estreptomicina (36,7%). A resistência à vancomicina foi detectada em uma amostra de E. faecium, portadora do genótipo vanA, correspondendo ao primeiro isolamento de amostra com essa característica de resistência no RN. Esta amostra foi isolada em um caso de co-infecção com E. faecalis sensível à vancomicina. Adicionalmente, susceptibilidade intermediária a linezolida foi identificada em três amostras de E. faecalis. Dentre os determinantes de virulência identificados, gelE foi o prevalente (83,8%). De acordo com as espécies E. faecalis o perfil mais detectado foi gelE + esp (31,6%), na espécie E. faecium foi o perfil esp (28,6%) e a única amostra de E. gallinarum apresentou dois determinantes de virulência (asa1 + cylA). O gene hyl não foi identificado em nenhuma das amostras. A análise do polimorfismo genético das amostras por PFGE evidenciou uma elevada policlonalidade. Diante das características de resistência e de virulência observadas e da sinalização da emergência de mecanismos de resistência importantes no Estado do RN, este estudo chama atenção para a necessidade de rastreamento, particularmente entre portadores sadios, e estabelecimento de políticas de controle da disseminação dessas amostras nas instituições de saúde, mesmo em regiões onde tais características ainda sejam pouco frequentes. / Enterococcus has emerged worldwide as one of the most important pathogens related to health care. They have ability to acquire resistance genes, including vancomycin, and have several virulence-associated factors, which contribute greatly to their permanence in the host, facilitating its dissemination, particularly in the hospital environment. The aim of this study was to characterize, by phenotypic and genotypic tests, strains of Enterococcus isolated from infections occurred in patients enrolled in four health-care institutions located in the city of Natal, in the period September 2010 to June 2011. Enterococcus species were characterized by conventional physiological tests and polymerase chain reaction (PCR) multiplex, using specific primers for the characterization at genus and species level. The antimicrobial susceptibility profiles were evaluated by agar diffusion testing. MIC values for vancomycin, teicoplanin and linezolid were determined by E-test, and the vancomycin resistance genotype was analyzed by PCR. Virulence (asa1, cylA, esp, gelE and hyl) were detected by multiplex PCR assays. The genetic polymorphism was evaluated by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) using the SmaI. 117 samples were obtained from 116 patients. The results revealed that the species E. faecalis was prevalent (91.4%). The susceptibility testing revealed that the highest resistance rates were associated with tetracycline (58.2%) and high-levels of streptomycin (36.7%). The resistance to vancomycin was detected in one isolate of E. faecium carrying the vanA genotype, corresponding to the first detection of this resistance trait in RN State. This sample was isolated from a case of co-infection with E. faecalis susceptible to vancomycin. Additionally, intermediate resistance to linezolid was found in three isolates of E. faecalis. Among the virulence encoding genes, gelE was the prevalent (83.8%). According to the species, the prevalent genotype among E. faecalis isolates was the concomitant presence of esp and gelE (31.6%). While in E. faecium isolates the presence of esp (28.6%) was prevalent. E. gallinarum isolate harbored both asa1 and cylA. The hyl gene was not detected. Analysis of genetic polymorphism of the strains by PFGE showed a high polyclonality. Given the characteristics of resistance and virulence observed in this study and the emergence of vancomycin-resistance, this study calls the attention to the need for screening, particularly among healthy carriers, and establishing policies to control the spread of these strains in health institutions, even in areas where such features are still uncommon.

A presença de bactérias resistentes a antimicrobianos vem sendo monitorada de forma cada vez mais frequente em produtos de origem animal, com o intuito de evitar a disseminação dessas cepas para humanos via cadeia alimentar. O gênero Enterococcus encontra-se entre os patógenos mais relevantes nas infecções hospitalares em humanos e tem capacidade de adquirir resistência a diversos antimicrobianos. No presente estudo foi avaliada a frequência de isolamento e a resistência antimicrobiana de Enterococcus sp. de carcaças suínas na etapa de pré-resfriamento, em três matadouros-frigoríficos localizados no estado de Santa Catariana. Dois ciclos de amostragem foram conduzidos em cada estabelecimento resultando em 252 suabes de carcaças. A partir dessas amostras, foram obtidos 240 isolados de Enterococcus sp. identificados por testes fenotípicos e pela detecção do gene tuf e ddlE.faecalis pela técnica de reação em cadeia da polimerase. Todos os isolados de Enterococcus sp. foram testados quanto à resistência a antimicrobianos pela técnica de difusão em ágar. A espécie mais prevalente foi Enterococcus faecalis (E. faecalis), presente em 90,83% das amostras de carcaça. Foi observada resistência à tetraciclina (42,5%), eritromicina (26,7%), estreptomicina (20,4%), ciprofloxacina (13,8%), cloranfenicol (12,1%) e a gentamicina (10,4%). Não foram encontrados isolados resistentes à vancomicina, teicoplanina e ampicilina. Os isolados que apresentaram perfil intermediário e resistente aos antimicrobianos ciprofloxacina e eritromicina, no teste de disco-difusão, foram submetidos à determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Em relação à ciprofloxacina, das 25 cepas com resistência intermediária no teste de disco-difusão, todas apresentaram CIM na concentração limítrofe (1,56 μg/mL), entre a sensibilidade e resistência, enquanto nas 74 cepas intermediárias frente à eritromicina, apenas duas apresentaram valor limítrofe máximo (4 μg/mL). Conclui-se que o gênero Enterococcus está presente em carcaças suínas na etapa de pré-resfriamento, sendo a espécie E. faecalis a mais encontrada. Apesar de existirem isolados resistentes a antimicrobianos usados na terapêutica humana, os resultados indicam que isolados resistentes a vancomicina, teicoplanina e ampicilina não estão presentes em carcaças suínas nos abatedouros estudados. / The presence of antimicrobial-resistant bacteria has been increasingly monitored in animal products in order to prevent the spread of these strains to humans through the food chain. The genus Enterococcus is among the most important pathogens in hospital infections in humans and is able to acquire resistance to several antibiotics. In the current study, the frequency of isolation and antimicrobial resistance of Enterococcus sp. from swine carcasses at the pre-chill stage in three slaughterhouses located in the state of Santa Catarina were evaluated. Two sampling cycles were performed at each establishment and 252 carcass swabs were taken. A total of 240 strains of Enterococcus sp. were identified by phenotypic testing and by PCR detection of tuf and ddI genes. All Enterococcus isolates were tested for resistance against antimicrobials by the agar diffusion technique. The most prevalent species was Enterococcus faecalis (E. faecalis), present in 90.83% of the carcass samples. Tetracycline (42.5%), erythromycin (26.7%), streptomycin (20.4%), ciprofloxacin (13.8%), chloramphenicol (12.1%) and gentamicin (10.4%) resistance was observed. No isolates were found resistant to vancomycin, teicoplanin and ampicillin. The isolates with intermediate and resistant profile to antimicrobials ciprofloxacin and erythromycin were further subjected to minimum inhibitory concentration (MIC) determination. Regarding ciprofloxacin, all the 25 strains with intermediary resistance profile in the disk diffusion test presented MIC at the limit concentration (1.56μg/mL) between sensitivity and resistance, while from 74 intermediary resistant strains against erythromycin only two presented MIC at the limit concentration (4 μg/mL). It is concluded that the genus Enterococcus is present in swine carcasses during the pre-chill stage and the species E. faecalis is the most prevalent. Although resistance against antimicrobials used for the human treatment has been found, the results indicate that isolates resistant to vancomycin, teicoplanin and ampicillin are not present on pig carcasses from those abattoirs.

O objetivo deste estudo foi caracterizar o potencial probiótico, antimicrobiano e antioxidante, bem como analisar os genes envolvidos em relação aos fatores de virulência e de resistência. Do mesmo modo, objetivouse avaliar a capacidade de bioacumulação e a especiaçao de selênio (Se(IV)) na biomassa microbiana. O micro-organismo utilizado neste estudo foi isolado de queijo “Minas Frescal” e caracterizado por métodos fenotípicos (Vitek® 2 system) e moleculares (sequenciamento do gene 16s rRNA e análise pelo gene ddl (D-Ala–D-Ala ligase)). O isolado LAB18s foi identificado fenotipicamente e genotipicamente como Enterococcus durans. Além disso, apresentou características probióticas; atividade antimicrobiana e capacidade antioxidante. Quando analisados os genes relacionados aos fatores de virulência (ace, agg, asa, bopA, bopB, bopC e bopD), e de resistência à vancomicina (vanA, vanB, vanC1 e vanC2/3) não foi verificada a presença destes genes pela E. durans LAB18s. Da mesma forma, o isolado mostrou-se sensível aos antibióticos testados (eritromicina, tetraciclina, vancomicina, gentamicina e penicilina) e apresentou ainda capacidade de adesão e hidrofobicidade, assim como forte capacidade para a formação de biofilme. Para a bioacumulação de Se(IV) pelo isolado E. durans LAB18s foram encontrados como parâmetros ótimos de crescimento a temperatura de 30°C e pH 7. Através da especiação foi demonstrado que em todas as análises o isolado E. durans LAB18s pode bioacumular concentrações consideráveis de Se(IV), sendo que a maior percentagem de selênio orgânico foi encontrada na fração de proteínas totais e, quando analisada as extrações por diferentes solventes, observou-se maior conteúdo de selênio em meio alcalino. As análises de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e Espectrometria de Energia Dispersiva (MEV-EDS) corroboraram com os resultados obtidos em termos de bioacumulação de selênio pelo E. durans LAB18s. De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que o isolado E. durans LAB18s pode ser considerado um micro-organismo com potencial probiótico, biologicamente seguro e com ampla capacidade em bioacumular selênio na biomassa microbiana. / The aim of this study was to characterize the potential probiotic, antimicrobial and antioxidant activity as well as analyze the genes involved in virulence factors and resistance. Similarly, it was aimed to evaluate the ability of selenium (Se (IV)) bioaccumulation and speciation through the microbial biomass. The micro-organism used in this study was isolated from "Minas Frescal" cheese and characterized by phenotypic (Vitek® 2 system) and molecular methods (16S rRNA gene sequencing and analysis by gene ddl (DAla- D-Ala ligase)). The isolate LAB18s was identified phenotypically and genotypically as Enterococcus durans. Moreover, it exhibited probiotic characteristics, antimicrobial and antioxidant activity. The genes related to virulence factors (ace, agg, asa, bopA, bopB, bopC e bopD), and vancomycin resistance (vanA, vanB, vanC1 e vanC2/3) were not verified the presence of these genes by LAB18s. Likewise, the isolate showed susceptibility to the antibiotics tested (erythromycin, tetracycline, vancomycin, gentamicin and penicillin) and also it showed adhesion and hydrophobicity ability, as well as a strong ability to form biofilms. For the Se(IV) bioaccumulation by isolated Enterococcus durans LAB18s have been found as optimal parameters growth by isolate at temperature of 30°C and pH 7. Analysis for Se(IV) speciation had shown in all analyzes that the isolate E. durans LAB18s can bioaccumulate considerable concentrations of Se(IV), and the highest percentage of organic selenium was found in the fraction of total protein; and when analyzed different solvent extractions, it was observed a higher content of selenium in alkaline medium. Analyses from Electron Microscopy (SEM), Transmission Electron Microscopy (TEM) and Energy Dispersive Spectroscopy (SEM-EDS) corroborate with the results obtained with Se(IV) bioaccumulation by E. durans LAB18s. In according to the obtained results it can be infer that the isolated E. durans LAB18s can be considered a micro-organism with potential probiotic, biologically safe and with wide capacity to bioaccumulate selenium in microbial biomass.