Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Introdução. A pesquisa de Escherichia coli em alimentos é relevante para a Saúde Pública porque indica a contaminação fecal e a qualidade do produto oferecido ao consumidor. A determinação do grupo filogenético e de fatores de virulência de E. coli permite identificar a existência de cepas patogênicas que poderiam causar doença. Objetivos: Determinar o grupo filogenético e fatores de virulência de isolados de E. coli pertencentes aos patotipos ETEC, EIEC, EPEC, STEC e EAEC usando métodos moleculares, obtidos de amostras de queijo Minas, discutir a presença dos patotipos nas amostras e o significado para Saúde Pública. Métodos. 250 isolados de Escherichia coli provenientes de 10 amostras de queijo Minas foram utilizados para a realização do estudo. O DNA genômico foi extraído e neste foi realizado a reação de PCR multiplex. Resultados. Os resultados demonstraram que dos 250 isolados, 93,2% foi classificado como grupo filogenético A, 3,2% como B1, 2,8% como B2 e 0,8% como D. Dos 250 isolados estudados, em 96,8% (242) foram encontrados fatores de virulência, sendo 91,6% de marcadores para ETEC, 0,4% para EPEC e 4,8% para EAEC. Conclusões. Houve predominância de fatores de virulência do patotipo ETEC e do grupo filogenético A. A presença de fatores de virulência indica que as amostras de queijo estavam contaminadas e poderiam causar doença, evidenciando a necessidade de medidas de controle efetivas por parte das autoridades sanitárias, bem como campanhas educativas / Introduction. The search of Escherichia coli in foods is relevant for the Public Health because it indicates the fecal contamination and the product quality offered to the consumer. The determination of phylogenetic group and virulence factors of E. coli, allows the identification of the existence of pathogenic strains that could cause disease. Objectives: Determine the phylogenetic group and the pathogenic of Escherichia coli belonging to the patotipos isolated occurrence ETEC, EIEC, EPEC, STEC and EAEC using molecular methods obtained from Minas cheese samples, to discuss the presence of the patotipos in the samples and the meaning for Public Health. Methods. 250 isolates of Escherichia coli from 10 Minas cheese samples was used for the accomplishment of the study. Genomic DNA was extracted and in this the multiplex reaction PCR was accomplished. Results. The results demonstrated that the isolates 250, 93.2% were classified as phylogenetic group A, 3.2% as B1, 2.8% as B2 and 0.8% as D. Of the isolates 250 studied, in 96.8% (242) were found virulence factors, being 91.6% of markers for ETEC, 0.4% for EPEC and 4.8% for EAEC. Conclusions. There was predominance to virulence factors of the patotipo ETEC and the phylogenetic group A. The presence of virulence factors indicates that the cheese samples were contaminated and they could cause disease, 11 put in evidence the need of effective control measures on the part of the sanitary authorities, as well as educational campaigns.

A serinoprotease Pic é uma proteína autotransportadora que apresenta papel importante na colonização da mucosa intestinal por E. coli enteroagregativa (EAEC). Uma cepa de E. coli enteropatogênica atípicas (aEPEC) albergando o gene pic foi detectada em um estudo prévio. O presente estudo teve como objetivo caracterizar a proteína Pic produzida por essa cepa de aEPEC (BA589). O gene pic em BA589 está presente em um plasmídeo de alto peso molecular (~98 kb) e o sequenciamento desse gene mostrou identidade de 99% com pic de EAEC 042. Pic da cepa BA589 (Pic589) foi capaz de clivar mucina bovina, hemaglutinar eritrócitos de coelho e clivar moléculas das três vias sistema complemento. O mutante BA589Dpic todas essas atividades in vitro. A cepa selvagem foi capaz de colonizar o intestino de camundongos tratados com estreptomicina, o que não foi observado com o mutante BA589Dpic. Desta forma, a serinoprotease Pic representa um fator de virulência adicional na cepa de aEPEC BA589, relacionada às etapas de adesão, colonização e evasão do sistema imune inato. / The serine protease Pic is an autotransporter protein that plays an important role in the colonization of the intestinal mucosa by enteroaggregative E. coli (EAEC). An atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) strain harboring the pic gene has been detected in a previous study. The present study aimed to characterize the protein Pic produced by that aEPEC strain (BA589). In BA589 pic is located in a high molecular weight plasmid (~98 kb), and sequencing of this gene showed 99% identity with pic from EAEC 042. Pic from BA589 (Pic589) was able to cleave bovine mucin, hemagglutinate rabbit erythrocytes and cleave molecules of the three complement system pathways. The mutant BA589Dpic lost all these capacities. The wild type strain was able to colonize the intestine of streptomycin treated mice, which was not observed with the mutant BA589Dpic. Thus, the serine protease Pic represents an additional virulence factor in aEPEC strain BA589, associated with adherence, colonization and evasion of innate immune system.

O pEO5, que codifica hemolisina, foi isolado de uma amostra de EPEC do sorotipo O26. Este plasmídio mostrou ser conjugativo e compatível com o pO157, e pelos testes de hibridização observou-se que estes plasmídios não são geneticamente relacionados. Para o estudo comparativo de similaridade foi seqüenciada uma região de 9227 pb de DNA do pEO5 que compreende todo o operon hlyCABD e suas regiões a montante e a jusante. A região do operon hemolitico (7225 pb) e a região promotora do operon foram similares às mesmas regiões do pHly152, que em uma amostra de E. coli isolada de roedor, codifica uma a hemolisina. No entanto, verificou-se a presença de elementos de inserção na região a montante do gene hlyC no pHly152. O pEO5 mostrou ser semelhante a outros plasmídios que também codificam a hemolisina em cepas de EPEC O26 de origem humana e de bovinos. A presença de estruturas semelhantes a transposons em ambas as extremidades do operon a hemolítico do pEO5 indica que esse fator de virulência provavelmente foi adquirido por transferência horizontal de genes. / The conjugative pEO5 encoding haemolysin in strains of EPEC O26 was investigated for its relationship with EHEC haemolysin-encoding of EHEC O26 and O157 strains. pEO5 was found to be compatible with EHEC virulence plasmids and did not hybridize in Southern blots with pO157, indicating that both plasmids were unrelated. A 9227 bp stretch pEO5 DNA encompassing the entire operon hlyCABD was sequenced and compared for similarity to plasmid and chromosomally inherited hly determinants. The a hly determinant of pEO5 (7252 bp) and its upstream region was most similar to corresponding sequences of pHly152, in particular, the structural a-hlyCABD and hlyR regions. pEO5 and hly of EPEC O26 strains from humans and cattle were very similar for the regions encompassing the structural a-hlyCABD. The major difference found between the hly regions of pHly152 and pEO5 is caused by the IS2 upstream of the hlyC in pHly152. The presence of transposonlike structures at both ends of hly sequence indicates that pEO5 was probably acquired by horizontal gene transfer.

Introdução. A pesquisa de Escherichia coli em alimentos é relevante para a Saúde Pública porque indica a contaminação fecal e a qualidade do produto oferecido ao consumidor. A determinação do grupo filogenético e de fatores de virulência de E. coli permite identificar a existência de cepas patogênicas que poderiam causar doença. Objetivos: Determinar o grupo filogenético e fatores de virulência de isolados de E. coli pertencentes aos patotipos ETEC, EIEC, EPEC, STEC e EAEC usando métodos moleculares, obtidos de amostras de queijo Minas, discutir a presença dos patotipos nas amostras e o significado para Saúde Pública. Métodos. 250 isolados de Escherichia coli provenientes de 10 amostras de queijo Minas foram utilizados para a realização do estudo. O DNA genômico foi extraído e neste foi realizado a reação de PCR multiplex. Resultados. Os resultados demonstraram que dos 250 isolados, 93,2% foi classificado como grupo filogenético A, 3,2% como B1, 2,8% como B2 e 0,8% como D. Dos 250 isolados estudados, em 96,8% (242) foram encontrados fatores de virulência, sendo 91,6% de marcadores para ETEC, 0,4% para EPEC e 4,8% para EAEC. Conclusões. Houve predominância de fatores de virulência do patotipo ETEC e do grupo filogenético A. A presença de fatores de virulência indica que as amostras de queijo estavam contaminadas e poderiam causar doença, evidenciando a necessidade de medidas de controle efetivas por parte das autoridades sanitárias, bem como campanhas educativas / Introduction. The search of Escherichia coli in foods is relevant for the Public Health because it indicates the fecal contamination and the product quality offered to the consumer. The determination of phylogenetic group and virulence factors of E. coli, allows the identification of the existence of pathogenic strains that could cause disease. Objectives: Determine the phylogenetic group and the pathogenic of Escherichia coli belonging to the patotipos isolated occurrence ETEC, EIEC, EPEC, STEC and EAEC using molecular methods obtained from Minas cheese samples, to discuss the presence of the patotipos in the samples and the meaning for Public Health. Methods. 250 isolates of Escherichia coli from 10 Minas cheese samples was used for the accomplishment of the study. Genomic DNA was extracted and in this the multiplex reaction PCR was accomplished. Results. The results demonstrated that the isolates 250, 93.2% were classified as phylogenetic group A, 3.2% as B1, 2.8% as B2 and 0.8% as D. Of the isolates 250 studied, in 96.8% (242) were found virulence factors, being 91.6% of markers for ETEC, 0.4% for EPEC and 4.8% for EAEC. Conclusions. There was predominance to virulence factors of the patotipo ETEC and the phylogenetic group A. The presence of virulence factors indicates that the cheese samples were contaminated and they could cause disease, 11 put in evidence the need of effective control measures on the part of the sanitary authorities, as well as educational campaigns.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

O pEO5, que codifica hemolisina, foi isolado de uma amostra de EPEC do sorotipo O26. Este plasmídio mostrou ser conjugativo e compatível com o pO157, e pelos testes de hibridização observou-se que estes plasmídios não são geneticamente relacionados. Para o estudo comparativo de similaridade foi seqüenciada uma região de 9227 pb de DNA do pEO5 que compreende todo o operon hlyCABD e suas regiões a montante e a jusante. A região do operon hemolitico (7225 pb) e a região promotora do operon foram similares às mesmas regiões do pHly152, que em uma amostra de E. coli isolada de roedor, codifica uma a hemolisina. No entanto, verificou-se a presença de elementos de inserção na região a montante do gene hlyC no pHly152. O pEO5 mostrou ser semelhante a outros plasmídios que também codificam a hemolisina em cepas de EPEC O26 de origem humana e de bovinos. A presença de estruturas semelhantes a transposons em ambas as extremidades do operon a hemolítico do pEO5 indica que esse fator de virulência provavelmente foi adquirido por transferência horizontal de genes. / The conjugative pEO5 encoding haemolysin in strains of EPEC O26 was investigated for its relationship with EHEC haemolysin-encoding of EHEC O26 and O157 strains. pEO5 was found to be compatible with EHEC virulence plasmids and did not hybridize in Southern blots with pO157, indicating that both plasmids were unrelated. A 9227 bp stretch pEO5 DNA encompassing the entire operon hlyCABD was sequenced and compared for similarity to plasmid and chromosomally inherited hly determinants. The a hly determinant of pEO5 (7252 bp) and its upstream region was most similar to corresponding sequences of pHly152, in particular, the structural a-hlyCABD and hlyR regions. pEO5 and hly of EPEC O26 strains from humans and cattle were very similar for the regions encompassing the structural a-hlyCABD. The major difference found between the hly regions of pHly152 and pEO5 is caused by the IS2 upstream of the hlyC in pHly152. The presence of transposonlike structures at both ends of hly sequence indicates that pEO5 was probably acquired by horizontal gene transfer.

A serinoprotease Pic é uma proteína autotransportadora que apresenta papel importante na colonização da mucosa intestinal por E. coli enteroagregativa (EAEC). Uma cepa de E. coli enteropatogênica atípicas (aEPEC) albergando o gene pic foi detectada em um estudo prévio. O presente estudo teve como objetivo caracterizar a proteína Pic produzida por essa cepa de aEPEC (BA589). O gene pic em BA589 está presente em um plasmídeo de alto peso molecular (~98 kb) e o sequenciamento desse gene mostrou identidade de 99% com pic de EAEC 042. Pic da cepa BA589 (Pic589) foi capaz de clivar mucina bovina, hemaglutinar eritrócitos de coelho e clivar moléculas das três vias sistema complemento. O mutante BA589Dpic todas essas atividades in vitro. A cepa selvagem foi capaz de colonizar o intestino de camundongos tratados com estreptomicina, o que não foi observado com o mutante BA589Dpic. Desta forma, a serinoprotease Pic representa um fator de virulência adicional na cepa de aEPEC BA589, relacionada às etapas de adesão, colonização e evasão do sistema imune inato. / The serine protease Pic is an autotransporter protein that plays an important role in the colonization of the intestinal mucosa by enteroaggregative E. coli (EAEC). An atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) strain harboring the pic gene has been detected in a previous study. The present study aimed to characterize the protein Pic produced by that aEPEC strain (BA589). In BA589 pic is located in a high molecular weight plasmid (~98 kb), and sequencing of this gene showed 99% identity with pic from EAEC 042. Pic from BA589 (Pic589) was able to cleave bovine mucin, hemagglutinate rabbit erythrocytes and cleave molecules of the three complement system pathways. The mutant BA589Dpic lost all these capacities. The wild type strain was able to colonize the intestine of streptomycin treated mice, which was not observed with the mutant BA589Dpic. Thus, the serine protease Pic represents an additional virulence factor in aEPEC strain BA589, associated with adherence, colonization and evasion of innate immune system.

Orientador: Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T01:00:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Culler_HebertFabricio_D.pdf: 4509234 bytes, checksum: 996664e9d72f80df8f43076b618a7f73 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As Escherichia coli enteropatogênicas atípicas são capazes de formar biofilme em superfícies abióticas e bióticas. Diversos mecanismos em E. coli são regulados por Quorum Sensing, incluindo a expressão de fatores de virulência e formação de biofilme. Quorum Sensing é um sistema de sinalização que confere às bactérias a habilidade de responder à moléculas químicas denominadas autoindutores (AI). SdiA e QseC são receptores de quorum sensing encontrados em diversas bactérias, entre elas EPECa. SdiA detecta moléculas autoindutoras do tipo 1 (AI-1) denominadas N-acil homoserina lactonas (AHLs). Entretanto as Escherichia coli não possuem a sintase para estas moléculas e, deste modo, SdiA detecta AHLs produzidas por outras bactérias. O receptor QseC detecta moléculas autoindutoras do tipo 3, além dos hormônios humanos adrenalina e noradrenalina. Neste estudo verificamos a influência da deleção de sdiA e qseC na formação e arquitetura do biofilme, formação de película, anel e também na transcrição de alguns dos genes envolvidos nestes fenótipos (bcsA, csgA, csgD, fliC, fimA e rpoS) em duas amostras de EPECa, sendo uma do sorotipo O55:H7 e outra do sorotipo ONT:H25. Os resultados das análises nas duas amostras de EPECa foram distintos, confirmando a grande heterogeneidade reportada em outros estudos em amostras deste patótipo. A amostra ONT:H25?sdiA formou espesso biofilme em placas de 96 poços e espessa estrutura (em anel) como anéis na parede do tubo de ensaio em relação às amostras selvagem e complementada. Além disso, o mutante sdiA desta amostra foi capaz de formar película na superfície do meio enquanto as amostras selvagem e complementada foram negativas. A amostra O55:H7?sdiA não apresentou diferença significativa na formação (das estruturas analisadas) destas estruturas em relação às amostras selvagem e complementada. Análises de qRT-PCR demonstraram (maiores níveis de transcrição de) um aumento na transcrição de csgA, csgD e fimA na amostra ONT:H25 deletada em sdiA, possivelmente indicando que o aumento na formação de biofilme por esta amostra esteja relacionado ao aumento da expressão das fímbrias tipo 1 e curli. A adição de AHLs à amostra selvagem ONT:H25 diminuiu a formação de biofilme e os níveis transcricionais de csgD e fimA, enquanto na amostra deletada não houve diferença, indicando que sdiA participa da regulação da formação de biofilme em EPECa e que as AHLs aumentam os efeitos repressores deste receptor nos genes relacionados à formação de biofilme. Quanto às amostras deletadas em qseC foi possível verificar uma diminuição da formação de biofilme em relação às amostras selvagens e complementadas, mas não houve diferença na formação de película na interface ar-líquido e também na formação de anel na parede dos tubos. A amostra ONT:H25?qseC foi negativa para expressão de fímbria curli em placas contendo vermelho congo e apresentou aumento da transcrição de bcsA e fimA, enquanto teve a transcrição de csgA, csgD e fliC diminuída em relação à amostra selvagem. A adição de adrenalina aumentou a formação de biofilme e motilidade nas duas amostras mutantes indicando a possível presença de outro receptor em EPECa responsável pela detecção destes hormônios na ausência de QseC. Portanto, conclui-se que estes dois receptores de quorum sensing estão relacionados, direta ou indiretamente, à formação de biofilme em EPECa / Abstract: Atypical enteropathogenic Escherichia coli are capable to form biofilm on biotic and abiotic surfaces. Several E. coli mechanisms are regulated by Quorum Sensing, including expression of virulence factors and biofilm formation. Quorum Sensing is a signaling system that confers bacteria the ability to respond to chemical molecules known as autoinducers. SdiA and QseC are Quorum Sensing receptors found in several bacteria, including aEPEC. SdiA detects type 1 autoinducer molecules (AI-1) known as N-acil homoserin lactones. However, Escherichia coli do not produce this kind of molecules and SdiA detects AHLs produced by other bacteria. QseC receptor detects type 3 autoinducer molecules and the human hormones adrenalin and noradrenaline. In this study the influence of the sdiA and qseC deletion in the biofilm formation and architecture, pellicle and ring-like structure formation and transcription of some genes (bcsA, csgA, csgD, fliC, fimA and rpoS) in two strains of aEPEC (O55:H7 and ONT:H25) was verified. The results of the analysis of the two aEPEC strains were distinct, confirming the heterogeneity reported by other studies in the same patotypes. The strain ONT:H25?sdiA formed a thick biofilm in 96-well plates and thick ring-like structure on the tube wall compared with the wild type and complemented strains. Furthermore, the sdiA mutant strain was capable to form pellicle on both surfaces, while the wild type and complemented strains were negative. The strain O55:H7?sdiA did not show a significant difference on the formation of these structures compared to the wild type and complemented strains. qRT-PCR analysis demonstrated an enhance on the transcription of csgA, csgD and fimA in the deleted sdiA ONT:H25 strain, suggesting that a relative increase of biofilm formation in ONT:H25 strain could be related to the increase of the expression of type 1 and curli fimbriae. The addition of AHLs to the wild type strain ONT:H25 decreased the biofilm formation and the transcriptional levels of csgD and fimA, but not in the mutant strain, indicating that sdiA plays a role in the regulation of biofilm formation in aEPEC. AHLs also increased the repressor efects of this receptor in biofilm related genes. The mutant qseC strains showed a decrease in biofilm formation when compared to wild type and complemented strains, but there was no difference in the pellicle formation in the air-liquid interface, as in the ring-like structure formation in the tube wall. The ONT:H25?qseC strain was negative to curli fimbriae expression in congo red plates and displayed an increase in the transcription of bcsA and fimA genes, while a decrease was verified in the csgA, csgD and fliC genes compared to the wild type strain. The addition of adrenalin increased the biofilm formation and motility in both mutant strains, possibly indicating the presence of other receptor in aEPEC involved in the detection of these hormones in the absence of QseC. In conclusion, these two Quorum Sensing receptors are related with biofilm formation in aEPEC / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

In der vorliegenden Arbeit wurde in einem in vitro-Modell mit porcinen intestinalen Epithelzellen (IPEC-J2) der Einfluss des probiotischen E. coli Nissle 1917 (EcN) auf die Infektion mit atypischen EPEC (aEPEC) untersucht. EcN reduzierte bei Vorinkubation auf IPEC-J2 die aEPEC-Infektion drastisch. Konfokale Laserscanning- und Elektronenmikroskopie zeigten, dass EcN die Adhäsion und Mikrokoloniebildung inhibierte, jedoch nicht die Ausbildung von Attaching and Effacing-Läsionen adhärenter aEPEC. Der inhibierende Effekt von EcN wurde durch dessen sehr gute Adhäsionsfähigkeit an IPEC-J2 vermittelt. Die F1C-Fimbrien wurden als wichtigster Adhäsionsfaktor von EcN identifiziert. Darüber hinaus waren auch H1-Flagellen durch Ausbildung interbakterieller Verbindungen maßgeblich an der Adhäsion des Stammes beteiligt. In gleichem Maß wie die Vorinkubation von EcN reduzierte die Koinkubation seines Kulturüberstandes die aEPEC-Infektion, was auf die Abgabe eines inhibierenden Faktors in den Kulturüberstand schließen lässt. Dieser Faktor wurde auch von anderen pathogenen sowie nicht pathogenen E. coli-Stämmen in Schüttelkultur gebildet und scheint deshalb nicht spezifisch für EcN zu sein. Jedoch ermöglichte erst die gute Adhäsionsfähigkeit von EcN auf der Epithelzelloberfläche die Abgabe ausreichender Mengen des Inhibitors und eine Beeinflussung der aEPEC-Infektion. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass durch EcN die initiale Anheftung von aEPEC an die Wirtszelle unterbunden wird. Der inhibierende Effekt von EcN auf die aEPEC-Infektion war zeitabhängig. Im Gegensatz zur Vorinkubation erhöhten Ko- und Nachinkubation von EcN die Adhäsion von aEPEC und hatten einen geringeren inhibierenden Effekt auf die Mikrokoloniebildung. Dieser gegensätzliche Effekt auf die Adhäsion von aEPEC wird möglicherweise von einem zweiten Faktor hervorgerufen. Dieser scheint nur dann wirksam zu sein, wenn der inhibierende Faktor in zu geringer Konzentration oder erst nach Adhäsion von aEPEC vorliegt. / In this study, the effects of the probiotic E. coli strain Nissle 1917 (EcN) on host cell infection with atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) were investigated in an in vitro porcine intestinal epithelial cell model (IPEC-J2). In pre-incubation experiments, EcN drastically reduced the infection efficiencies of aEPEC. Using confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopy, it was shown that EcN inhibited the attachment and formation of microcolonies, but not the formation of attaching and effacing lesions by adherent aEPEC. The inhibitory effect was mediated by the adherent properties of EcN to epithelial cells. The F1C fimbriae were identified as the most important adhesion factor of EcN in vitro. Furthermore, the H1 flagellae were also shown to be involved in the adhesion of EcN, serving as bridges between bacterial cells. Co-incubation of culture supernatants of EcN reduced the infection efficiencies of aEPEC to the same extent as in pre-incubation with EcN bacteria, indicating the secretion of an inhibitory factor by EcN. This factor was also secreted by other pathogenic and non-pathogenic E. coli strains in shaking culture and therefore does not appear to be specific for EcN. However, the outstanding ability of EcN to adhere to epithelial cells largely contributes to the secretion of sufficient concentrations of this inhibitory factor und to the influence on the aEPEC infection. The results suggest that EcN interferes with the initial adhesion of aEPEC to host cells. The inhibitory effect of EcN was found to be time-dependent. In contrast to pre-incubation experiments, co- and post-incubation of EcN actually increased the adhesion efficiencies of aEPEC and showed only minor effects on microcolony formation. This second effect of EcN on aEPEC adhesion, possibly due to a second factor, appears only to be effective when the putative inhibitory factor is either present at low concentrations or after aEPEC is already adherent to host cells.