INTRODUÇÃO: Líquen plano pilar (LPP) e alopecia frontal fibrosante (AFF) são alopecias cicatriciais linfocíticas crônicas, caracterizadas pela destruição permanente da unidade pilossebácea. Neuropeptídeos como a substância P (SP) e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) têm sido implicados no metabolismo lipídico das glândulas sebáceas e na manutenção do estado inflamatório de diversas doenças. OBJETIVOS: 1. Quantificar e comparar a expressão dos neuropeptídeos SP e CGRP em amostras do couro cabeludo (áreas afetadas e aparentemente não afetadas) e séricas de pacientes com LPP e AFF, em relação a indivíduos sadios, utilizando a técnica de ELISA. 2. Analisar áreas afetadas e aparentemente não afetadas de pacientes com LPP e AFF através da imunofluorescência direta (IFD). MÉTODO: 20 pacientes (10 com LPP e 10 com AFF) e 11 indivíduos sadios foram submetidos a biópsias com punch de 4mm do couro cabeludo e coleta de amostras sanguíneas. Pacientes foram submetidos a biópsias das áreas afetadas e aparentemente não afetadas do couro cabeludo, as quais foram pareadas com amostras da região anterior e posterior do couro cabeludo dos indivíduos-controle. As amostras dos pacientes foram enviadas para análise histopatológica, IFD e teste de ELISA para SP e CGRP. As amostras dos controles foram submetidas à análise histopatológica e aos mesmos testes de ELISA. Sintomas (dor, prurido, queimação e formigamento) e sinais inflamatórios (eritema difuso, eritema peripilar e descamação peripilar) na região afetada dos pacientes também foram avaliados. Este estudo foi realizado nas Universidades de São Paulo (BRA) e de Minnesota (EUA), entre os anos de 2012 e 2014. RESULTADOS: A análise histopatológica evidenciou infiltrado perifolicular linfocítico típico em 70% das áreas aparentemente não afetadas do couro cabeludo de pacientes com LPP e AFF, além de fibrose e depósitos de mucina perifoliculares. Em relação à IFD, o resultado se mostrou positivo em 50% das amostras das áreas afetadas e em 40% das áreas aparentemente não afetadas dos pacientes com LPP, em comparação a 40% e 20% nos casos de AFF, respectivamente. No teste de ELISA, pacientes do grupo LPP e infiltrado histopatológico de moderado a intenso na área afetada, demonstraram maior expressão de SP na área afetada, em comparação àquela aparentemente não afetada (P=0,046). Já pacientes do grupo AFF com o mesmo grau histopatológico de inflamação, demonstraram maior expressão de SP na área aparentemente não afetada, em comparação à área afetada (P=0,050). No teste de ELISA para CGRP, pacientes com LPP e inflamação histopatológica de leve a ausente na área afetada, tiveram maior expressão deste neuropeptídeo na área aparentemente não afetada, em comparação à área afetada (P=0,048). Por outro lado, pacientes com AFF que tinham o mesmo grau de inflamação histopatológica, a expressão deste neuropeptídeo foi favorecida na área afetada, em relação àquela aparentemente não afetada (P=0,050). Todas as amostras séricas dos pacientes e controles e do couro cabeludo dos indivíduos-controle tiveram resultados indetectáveis para SP e CGRP no teste de ELISA. Nenhuma relação entre sinais e sintomas inflamatórios e expressão de SP e CGRP no teste de ELISA foi vista. CONCLUSÃO: O acometimento das áreas aparentemente não afetadas do couro cabeludo de pacientes com LPP e AFF ao exame histopatológico, sugere que ambas as doenças possam acometer de forma difusa esta região. Apesar da semelhança dos achados histopatológicos entre pacientes com LPP e AFF, resultados antagônicos dos neuropeptídeos encontrados no teste de ELISA apontam para mecanismos fisiopatogênicos distintos. A inflamação neurogênica poderia explicar a sintomatologia e contribuir para a patogênese destas doenças / INTRODUCTION: Lichen planopilaris (LPP) and frontal fibrosing alopecia (FFA) are primary lymphocytic cicatricial alopecias characterized by permanent destruction of the pilossebaceous unit. Neuropeptides such as substance P (SP) and calcitonin gene-related peptide (CGRP) are related to lipid metabolism in sebaceous glands and to the maintenance of many inflammatory chronic disorders. OBJECTIVES: 1. Quantify SP and CGRP expression in affected and in normal-appearing scalp areas and serum samples from patients with LPP and FFA, and compare to healthy controls using ELISA technique. 2. Compare affected and normal-appearing areas from patients with LPP and FFA, using direct immunofluoresce (DIF) technique. METHODS: Twenty patients (10 with LPP and 10 with FFA) and eleven healthy controls underwent 4mm-punch biopsies and blood extraction. Patients collected samples from affected and normal-appearing scalp areas, and controls collected from anterior and posterior scalp areas. Patients samples were sent to histopathologic examination, DIF and ELISA tests for SP and CGRP detection. Control samples were sent to histopathologic examination and to the same ELISA tests. Symptoms (pain, burning, itching and tingling) and signs of inflammation (diffuse erythema, perifollicular erythema and perifollicular scale) were also assessed. This study was done at the Universities of São Paulo (Brazil) and Minnesota (USA), between 2012 and 2014. RESULTS: Normal-appearing scalp areas from patients with LPP and FFA showed lymphocytic perifollicular typical inflammation in 70% of the cases, as well as perifollicular fibrosis and mucin deposits. DIF test was positive in 50% of the affected areas and in 40% of normalappearing areas from patients with LPP, comparing to 40% and 20% in the FFA group, respectively. In SP ELISA test, affected areas from patients with LPP that had histopathologic moderate or intense infiltrate showed more expression of SP in the affected scalp, comparing to normal-appearing areas (P=0,046). However, affected areas from patients with FFA that showed the same degree of histopathologic infiltrate had higher expression of SP in normalappearing scalp, comparing to affected scalp (P=0.050). In CGRP ELISA test, affected scalp from patients with LPP that had histopathologic mild or irrelevant infiltrate showed increased CGRP expression in normal-appearing scalp areas, comparing to affected scalp (P=0,048). Althought, affected areas with the same degree of histopathologic inflammation from patients with FFA had more CGRP, comparing to normal-appearing scalp (P=0,050). All serum samples and scalp samples from controls had undetectable results in SP and CGRP ELISA tests. No clinical relationship was found among symptoms, signs of inflammation, and neuropeptide expression. CONCLUSION: Normal-appearing scalp areas can show histopathologic inflammation suggesting that both LPP and FFA can be more generalized processes affecting the scalp. Although both diseases share similar histopathologic findings, the opposite results in the ELISA test point that these diseases may have diverse pathogenic mechanisms. Neurogenic inflammation possibly play an important role in the pathogenesis of both LPP and FFA and may explain the symptomatic scalp some patients refer

Introdução: A doença tromboembólica é um distúrbio complexo multicausal com sinais e sintomas inespecíficos, confundindo-se com outras enfermidades. Devido à sua gravidade buscam-se estratégias objetivando obter um diagnóstico precoce. O teste de dosagem do dímero - D plasmático parece ser uma alternativa para exclusão do diagnóstico de tromboembolismo venoso agudo. Objetivo: Avaliar o valor do teste de dosagem de dímero - D plasmático, utilizando o método Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA), na rotina diagnóstica de tromboembolismo venoso agudo. Métodos: Em 89 pacientes com sinais e sintomas sugestivos de tromboembolismo pulmonar e/ou trombose venosa profunda foram realizadas dosagens do dímero - D pela técnica ELFA no equipamento VIDAS® - BioMérieux. Foram calculados os valores da sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e acurácia do teste, bem como a curva ROC da amostra estudada. Todos os pacientes foram submetidos a exame por imagem para confirmação do evento tromboembólico agudo. Foi calculado o índice kappa para analisar o resultado do teste dímero - D versus resultados de exames por imagem. Resultados: Entre os 89 pacientes estudados (média de idade 54,3 anos; 51 mulheres), 36 (40,4%) apresentaram TEV e 53 não apresentaram trombose aguda (59,6%). Entre os pacientes sem trombose aguda 15 (28,3%) apresentaram resultado de dímero - D negativo. Todos pacientes com trombose apresentaram resultado de dímero - D positivo. O teste apresentou sensibilidade de 100%; especificidade de 28,3%; valor preditivo positivo de 48,6%; valor preditivo negativo de 100% e exatidão de 57,3%. A ASC para a amostra total estudada foi igual a 0,734, indicando que o teste é um bom preditor de trombose aguda. O valor do índice kappa para a amostra total foi igual a 0,24 (p<0,001), indicando uma concordância fraca entre dímero - D e diagnóstico confirmatório de trombose. Conclusão: A dosagem do dímero - D pelo método ELFA foi capaz de excluir o diagnóstico de tromboembolismo venoso agudo nessa amostra estudada. Os resultados obtidos nessa amostra estudada permitiram concluir que o uso do teste dímero - D em pacientes com suspeita de tromboembolismo venoso revelou alta sensibilidade no diagnóstico dessa enfermidade. / Introduction: The thromboembolic disease is a multicausal complex disturb with signals and symptoms that confusing itself with other diseases. Because its gravity strategies search objecting to get a faster diagnosis. The measure plasmatic D dimer test seems to be an alternative for exclusion of the diagnostic of acute venous thromboembolism. Objectives: To evaluate the value of the measure plasmatic D dimer test, using the method Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA), in the diagnostic of acute venous thromboembolism. Methods: In 89 patients with signals and symptoms suggestive of pulmonary thromboembolism and/or deep vein thrombosis had been carried through measure D dimer by technique ELFA equipment VIDAS® - BioMérieux. The values of sensibility, accuracy specificity, predictive values positive and negative and of the test had been calculated, as well as curve ROC of the sample studied. All the patients had been submitted the image exams for the confirmation of the acute thromboembolism event. It was calculated kappa ratio to compare D dimer test results with image exams results. Results: Between 89 studied patients (mean of age 54.3 years; 51 women), 36 (40.4%) they had presented and 53 had not presented acute thrombosis (59.6%). It enters the patients without acute thromboembolism 15 (28.3%) had presented resulted negative of D dimer. All patients with thrombosis had presented resulted positive of D dimer. The test presented 100% sensibility; 28.3% of specificity; positive predictive value was 48.6%; 100% of negative predictive value and accuracy value was 57.3%. The area under the curve (AUC) to total sample studied was 0.734, it was showed that the test have a good prediction to acute thrombosis. The kappa ratio value was 0.24 (p<0.001) showing a bad concordat n to thrombosis diagnostic. Conclusion: The measure of D dimer by method ELFA was able to exclude the diagnostic of acute venous thromboembolism in this sample studied. The results obtained in this sample studied let to conclude that the D dimer test in patients with suspected of acute thromboembolism presented high sensibility to diagnostic of this disease.

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Cryptococcus sp é um fungo saprófita, cosmopolita, que causa micose sistêmica, geralmente, subaguda ou crônica, conhecida, sobretudo, por sua localização meníngea, após aquisição da infecção por via respiratória Embora seja ubíquo, a criptococose ocorre predominantemente em indivíduos imunodeficientes e podendo ocorrer, também, em indivíduos imunocompetentes. Os estudos experimentais e em humanos avaliando a ativação do sistema complemento e a produção de anticorpos específicos mostram que a resposta inata e de anticorpos são importantes para a delimitação do processo infeccioso por Cryptococcus sp, como também, a administração de anticorpos monoclonais podem induzir uma resposta eficaz na disseminação da doença. O sistema complemento contribui para a defesa do organismo contra o Cryptococcus sp de diferentes maneiras: secretando opsoninas e fatores quimiotáticos e colaborando com a ação dos anticorpos específicos, aumentando a interação entre a imunidade inata e adquirida. Os anticorpos antiglicuroxilomanana (GXM) possuem numerosas atividades biológicas: a) opsonização para fagocitose, b) ativação da via clássica do complemento resultando na deposição precoce de fragmentos de C3 no fungo, c) supressão do excesso de acúmulo de C3 pela via alternativa; d) facilitação do clareamento do GXM do soro in vivo, resultando no maior acúmulo de GXM nos tecidos ricos em células do sistema fagocítico mononuclear; e) proteção em modelos murinos da criptococose e f) facilitação de vários aspectos da imunidade celular ao Cryptococcus sp. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta humoral ao GXM e às proteínas da parede celular (Ag S) avaliando a atividade do sistema complemento como também a produção de anticorpos específicos em amostras séricas de adultos com e sem neurocriptococose. Foram coletadas 106 amostras de soro e divididas em 3 grupos: grupo 1- 21 indivíduos com neurocriptococose e baixa exposição a levedura, grupo 2- foi composto por 23 indivíduos saudáveis com alta exposição ao fungo e HIV negativos, granjeiros da cidade de Jumirim localizada a 164 km de São Paulo, na região de Sorocaba e, o grupo 3- 60 indivíduos saudáveis, HIV negativos e com baixa exposição ao Cryptococcus sp. Dois pacientes foram excluídos do estudo por apresentarem tumores (timona e câncer de pulmão). O sistema complemento foi avaliado por ensaio hemolítico (CH 50 e AP 50) e, a dosagem da proteína ligadora de manose (MBL) foi feita por ELISA. Os valores de CH 50 estiveram dentro da normalidade em 17/21, 13/23, 59/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. A média dos valores de CH 50 foi diferente significativamente entre o três grupos (P < 0,0001). O grupo 2 mostrou níveis reduzidos significantes em comparação aos dois outros grupos. Os valores de AP 50 estiveram dentro da normalidade em 11/21; 21/23 e 60/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. Houve diferença nos valores de AP 50 (P = 0,0005) e apenas um paciente do grupo 1 apresentou valores indetectáveis desta via. Houve diferença significante na dosagem de MBL entre os três grupos (P = 0,0277). Anticorpos IgG anti-GXM foram quantificados por ELISA e expressos por densidade óptica (DO). IgG anti GXM foi detectado em todos os grupos com diferença significante entre eles (P= 0,0127). As médias de IgG anti- GXM (DO) foram: 1.191 (0,49 a 1.217) no grupo 1, 1.572 (0,815 a 2.479) no grupo 2 e 0,965 (0,321 a 1.295) no grupo 3. Dois indivíduos assintomáticos do grupo 2 tiveram títulos de GXM detectáveis (1/256 e 1/32). Quatro pacientes com neurocriptococose faleceram (19%) e seus resultados mostravam: CH 50 normal, 2/4 tinham valores de AP 50 baixo (12 UI/mL) e indetectável; 3/4 tinham altos níveis de MBL e apenas um tinha baixa DO de IgG anti-GXM. Baseado em nosso estudo, podemos concluir que a resposta humoral (sistema complemento e anticorpos) não é suficiente para explicar a susceptibilidade a neurocriptococose, porém a alta e constante exposição ao Cryptococcus sp pode prevenir o desenvolvimento de doença, ou seja, a constante e intensa exposição ao fungo induz a produção de anticorpos que previnem a doença clínica mas não a infecção. Por outro lado fatores genéticos que determinam as concentrações de MBL podem influenciar na susceptibilidade a neurocriptococose. Os anticorpos contribuem para o clearence de GXM, entretanto as concentrações séricas não se correlacionam com resistência à doença / Cryptococcus sp is a fungal pathogen with a worldwide distribution. Although it is ubiquitous in the environment, cryptococcal disease occurs predominantly in immunocompromised hosts and can also occur in apparently immunocompetent individuals. The innate immunity is of special relevance for the antifungal reaction, as it allows an immediate reaction and recognizes a broad variety of fungal pathogens. The host immune response is a major determinant of the outcome of cryptococcal infection; however, the antibodies response is poorly understood. In addition, most of the studies are experimental and there is restricted knowledge concerning the human immune response. Complement system has soluble factors, restrictive regulator proteins and cellular receptors involved in defense mechanism. Glucuroxylomannan (GXM) monoclonal antibodies (MAbs) have numerous biological activities: a) opsonization for phagocytosis, b) activation of the classical complement pathway leading to early deposition of C3 fragments on the yeast, c) suppression overall accumulation of C3 via the alternative pathway; d) clearance facilitation of GXM from serum in vivo, leading to increased accumulation of GXM in tissues rich in mononuclear phagocyte system; e) protection in murine models of cryptococcosis and f) facilitation of various aspects of cellular immunity to Cryptococcus sp. The goal of our study was to evaluate if the antibody response to GXM and cell wall proteins regarding specific antibodies as well as complement system in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. The aim of our research was to evaluate classical and alternative complement system pathway, to quantify mannose-binding lectin (MBL) as well antibody response to GXM and cell wall proteins (AgS) regarding specific antibodies in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. One hundred and six samples were collected and classified in 3 groups: group 1- 21 individuals with neurocryptococcosis and low exposure to the yeast; group 2- was composed by 23 healthy individuals, chicken farmings from Jurumirim, a town 164 km to São Paulo, and with high exposure to Cryptoccocus spp and HIV negative. The third group included 60 healthy HIV negative individuals with presumed low exposure to Cryptococcus. Two patients were excluded by report of previous malignancies (timoma and pulmonary cancer). The complement system was evaluated by hemolytic assay and ELISA to MBL. CH 50 and AP 50 values were within the normal range in 17/21; 13/23; 59/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. Mean CH 50 values were significantly different among the three groups (P < 0,0001). Group 2 showed significantly reduced levels in comparison with groups 1 and 3. AP 50 values were within the normal range in 11/21; 21/23; 60/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. There was difference in the AP 50 values (P=0,0005) and one no activation of this pathway in group 1. There was significant difference in MBL among the groups (P = 0,0277). GXM antibodies IgG was measured by ELISA and expressed as optical density (OD). GXM- IgG was detected in all the groups with significant difference among them (P = 0,0127). The means of IgG anti-GXM (OD) were: 1.191 (range 0,49 to 1.217) in group 1, 1.572 (range 0,815 to 2.479) in group 2 and 0,965 (range 0,321 to 1.295) in the group 3. Two of the group 2 individuals had low GXM titers (1/256 and 1/32) and no symptoms. Four patients (4/21; 19%) with neurocryptococcosis died and the results showed: normal classical pathway activation, 2/4 had low (12 UI/mL) or undetectable alternative pathway values ; 3/4 had high MBL concentrations and only one had low OD for IgG anti-GXM. In conclusion, our results suggest that constant and high exposure to Cryptococcus sp can prevent the development of cryptococcosis, i.e. constant and intensive fungal exposition induces protective antibodies to clinical disease but not to the infection. In the other side, genetic factors which determine MBL concentrations could influence the susceptibility to neurocryptococcosis. The antibodies contribute to GXM clearance, however, the concentrations did not correlate with the resistance to the disease

A estrongiloidíase é uma infecção intestinal causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. A maioria dos casos evolui para um quadro crônico benigno; entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação, sobretudo em pacientes imunodeprimidos. Os métodos parasitológicos convencionais apresentam baixa sensibilidade e, com isso, os testes sorológicos podem representar uma boa alternativa para o diagnóstico dessa helmintíase. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as técnicas de RIFI, ELISA e WB para o diagnóstico da estrongiloidíase em pacientes candidatos a transplante. Para validação dos testes, foram utilizadas amostras de soros de pacientes imunocompetentes (positivos para S. stercoralis, positivos para outras parasitoses e negativos). Foram utilizadas amostras de fezes e soros de pacientes candidatos a transplante, a saber: 50 para transplante renal; 50 para transplante de fígado; 50 para transplante de medula óssea. As amostras fecais de todos os pacientes foram analisadas pelas técnicas de sedimentação espontânea, Rugai, e cultura em placa de ágar. Para a execução das técnicas sorológicas foram utilizadas como fonte de antígeno larvas filarioides de S. venezuelensis. Para a RIFI, os soros foram diluídos a 1:40 em tampão PBS-TM e o conjugado anti-IgG humano marcado com fluoresceína diluído 1:500 em PBS acrescido de 4% de azul de Evans, sendo realizada a leitura em microscópio de imunofluorescência, utilizando as objetivas de 20X e 40X. Para a técnica ELISA foram utilizadas placas poliestireno sensibilizadas com 10?g de antígeno (frações solúveis salina e alcalina), soro dos indivíduos diluídos a 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBS-TM) e conjugado (anti-IgG humana peroxidase) em PBS-TM. As amostras foram consideradas positivas quando o índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB, os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBS-TM. Dos 150 pacientes candidatos a transplante analisados, 9,3% (n=14) foram positivos pelas técnicas parasitológicas, sendo que a cultura em placa de ágar detectou 6,6% (n=10). Na RIFI a soropositividade para detecção da infecção por S. stercoralis foi de 16,6% (n=25), sendo, 22% transplante renal, 18% hepático e 10% medula óssea. Pela técnica ELISA a soropositividade foi de 11,3% (n=17), sendo 14% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 3% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 24,6% (n=37), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 50% hepático e 6% medula óssea, utilizando o antígeno salino. Pela técnica WB a soropositividade foi de 20,6% (n=31), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 32% hepático e 12% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 18,6% (n=28) sendo 10% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 32% medula óssea, utilizando o antígeno salino. A utilização de técnicas imunodiagnósticas pode ser indicada na triagem de pacientes em fila de transplante, devendo-se levar em conta as limitações de reações sorológicas em pacientes imunodeprimidos / Strongyloidiasis is an intestinal infection caused by the nematode Strongyloides stercoralis. Most cases progress to a benign chronic condition; however hyperinfection and dissemination may occur, especially in immunocompromised patients. Conventional parasitological methods have low sensitivity and, thus, serological tests may be a good alternative for the diagnosis of this helminthiasis. The aim of this study was to evaluate RIFI, ELISA and WB techniques for the diagnosis of strongyloidiasis in patients candidates for transplants. In order to validate the tests samples of sera from immunocompetent patients (positive for S. stercoralis, positive for other parasitosis, and negatives) were used. Feces and sera samples of patients candidates for transplants were used as follows: 50 for renal transplant, 50 for liver transplant, 50 for bone marrow transplant. Fecal samples of all patients were analyzed by spontaneous sedimentation, Rugai and Agar plate culture techniques. Filarioid larvae of S. venezuelensis were used as source of antigen for serological tests. For RIFI, sera were diluted 1:40 in PBS-TM buffer and human anti-IgG conjugate labeled with fluorescein was diluted 1:500 in PBS with 4% Blue Evans, reading being performed in immunofluorescence microscope using 20X and 40X objectives. For ELISA technique polystyrene plates sensitized with 10?g of antigen (saline and alkaline soluble fractions), individual sera diluted at 1:200 in PBS 0.05% Tween 3% of milk (PBS-TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM were used. Samples were considered positive when ELISA index was higher than 1. For WB technique, sera were diluted in Tris-HCl 5% of milk (TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM. From 150 patients candidates for transplants analyzed 9.3% (n=14) were positive by parasitological techniques, agar plate culture detected 6.6% (n=10). In RIFI seropositivity for S. stercoralis infection detection was 16.6% (n=25) being 22% renal transplant, 18% hepatic and 10% for bone marrow. By ELISA technique seropositivity was 11.3% (n=17), being 14% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 3% bone marrow, using alkaline antigen and 24.6% (n=37), being 18% in patients candidates for renal transplant, 50% hepatic and 6% bone marrow, using saline antigen. By WB technique seropositivity was 20.6% (n=31), being 18% in patients candidates for renal transplant, 32% hepatic and 12% bone marrow, using alkaline antigen, and 18.6% (n=28) being 10% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 32% bone marrow, using saline antigen. Application of immunodiagnostic techniques could be indicated in screening of patients in transplant waiting list, however limitations of serological reactions in immunodepressed patients should be considered

No advento dos antirretrovirais potentes, os indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) começaram a apresentar risco maior para o desenvolvimento de doença cardiovascular (DCV). Este aumento do risco cardiovascular pode ser associado tanto à infecção viral quanto ao tratamento antirretroviral (TARV), que provocam mudanças pró-aterogênicas como o aumento do colesterol total e da lipoproteína de baixa densidade (LDL), além da diminuição da lipoproteína de alta densidade (HDL). A ativação imune e as alterações lipídicas são mecanismos associados com a infecção pelo HIV e com o risco de DCV. Este trabalho utilizou ensaios imunoenzimáticos para a determinação plasmática de biomarcadores emergentes de risco cardiovascular relacionados com modificações da lipoproteína de baixa densidade, a saber: LDL eletronegativa [LDL(-)] e formas oxidadas da LDL, ou seja, LDL-oxi (resíduos lisina da apolipoproteína B100 modificados com malondialdeído), LDL-HNE (resíduos lisina da ApoB100 modificados com 4-hidroxinonenal) e LDL-CML (resíduos lisina da ApoB100 modificados por carboximetila), além de biomarcadores relacionados com a resposta imune-inflamatória, ou seja, autoanticorpos IgG e IgM anti-LDL(-), imunocomplexo de LDL(-) [IC-LDL(-)], proteína amiloide sérica A (SAA) e mieloperoxidase (MPO). Também foram determinadas as concentrações séricas dos biomarcadores de risco relacionados às apolipoproteínas: apolipoproteína A-I (ApoA-I), apolipoproteína B (ApoB) e apolipoproteína E (ApoE). A população estudada incluiu indivíduos com infecção pelo HIV, tratados (HIV-TARV) e não tratados (HIV-NT) com terapia antirretroviral e indivíduos sem infecção pelo HIV (controle). Não foram identificadas diferenças para as concentrações de LDL(-), IC-LDL(-), anti- LDL(-)-IgM, SAA, ApoA-I, ApoB e ApoE entre os grupos estudados (HIV-TARV, HIV-NT e controle). A ApoA-I correlacionou-se positivamente com ApoB e ApoE (rs= 0,418 e rs= 0,347, Spearman, p<0,01) e a ApoB com a ApoE (rs= 0,286, Spearman, p<0,01). Verificou-se correlação inversa entre as concentrações de LDL(-) e IC-LDL(-) (rs= -0,214, Spearman, p<0,05). Os níveis de anti-LDL(-)-IgG correlacionaram-se positivamente com IC-LDL(-) e anti-LDL(-)-IgM (rs= 0,240, Spearman, p<0,05 e rs= 0,348, Spearman, p<0,01). As concentrações de LDL-CML correlacionaram-se positivamente com LDL(-), LDL-oxi, LDL-HNE e IC-LDL(-) (rs= 0,212, Spearman, p<0,05; rs= 0,214, Spearman, p<0,05; rs= 0,573, Spearman, p<0,01 e rs= 0,219, Spearman, p<0,05). O grupo HIV-NT apresentou níveis mais elevados de anticorpos anti-LDL(-)-IgG comparado ao grupo controle (Kruskal-Wallis, p<0,01). Em contraste, observou-se no grupo HIV-NT diminuição das concentrações de MPO, LDL-HNE e LDL-CML em relação ao grupo controle (Kruskal-Wallis, p<0,01). A comparação dos grupos HIV-NT e HIV-TARV demonstrou que o TARV promoveu diminuição das concentrações dos anticorpos anti-LDL(-)-IgG e aumentou os níveis de LDL-oxi (Kruskal-Wallis, p<0,01). O grupo HIV-TARV apresentou aumento das concentrações de LDL-oxi e diminuição dos níveis de MPO, LDL-HNE e LDL-CML em relação ao controle (Kruskal-Wallis, p<0,01). Em conclusão, a infecção pelo HIV modificou o biomarcador de inflamação MPO e o perfil de biomarcadores relacionados às modificações da LDL (menor formação de LDL-HNE e LDL-CML), além aumentar a resposta imune-humoral à LDL eletronegativa [anti-LDL(-)-IgG], enquanto o tratamento com antirretrovirais inibiu esta resposta. Os outros biomarcadores estudados não foram modificados pela infecção viral ou pelo tratamento antirretroviral. / In the advent of potent antiretroviral therapy, individuals infected with human immunodeficiency virus (HIV) have showed an increased risk for developing cardiovascular disease (DCV). Studies have discussed that the increased risk may be related to both the disease and antiretroviral treatment (TARV), that produced pro-atherogenic changes such as increased of total cholesterol and low density lipoprotein (LDL) and decreased high density lipoprotein. The immune activation and the lipid modifications are well known mechanisms related to HIV infection and the risk of DCV. This study used immunoassays for plasma quantification for emerging biomarkers of cardiovascular risk related to modification of low density lipoprotein: electronegative LDL [LDL(-)] and oxidized forms of LDL, LDL-oxi (lysine residues of apolipoprotein B100 modified by malondialdehyde), LDL-HNE (lysine residues of ApoB100 modified by 4-hydroxynonenal) and LDL-CML (lysine residues of ApoB100 modified by carboxymethyl) and biomarkers associated to immune and inflammatory responses, IgG and IgM autoantibodies anti-LDL(-) and immunecomplexe of LDL(-) [IC-LDL(-)], serum amyloid A protein (SAA) and myeloperoxidase (MPO). Also, were determined serum concentrations of risk biomarkers related to apolipoproteins: apolipoprotein A-I (ApoA-I), apolipoprotein B (ApoB) and apolipoprotein E (ApoE). The studied population included patients with HIV infection, treated (HIV-TARV) and untreated (HIV-NT) with antiretroviral therapy and individuals without HIV infection (controle). No differences were identified for concentrations of LDL(-), ICLDL(-), anti-LDL(-)-IgM, SAA, ApoA-I, ApoB and ApoE between studied groups (HIV-TARV, HIV-NT and controle). The ApoA-I was positively correlated to ApoB and ApoE (rs= 0,418 e rs= 0,347, Spearman, p<0,01) and ApoB to ApoE (rs= 0,286, Spearman, p<0,01). There was an inverted correlation between LDL(-) and IC-LDL(-) (rs= -0.214, Spearman, p<0,05). The levels of anti-LDL(-)-IgG were positively correlated to IC-LDL(-) and antibodies anti-LDL(-)-IgM (rs= 0.240; Spearman; p <0.05 and rs= 0.348; Spearman; p <0.01). The concentrations of LDL-CML were positively correlated to LDL(-), LDL-oxi, LDL-HNE e IC-LDL(-) (rs= 0,212, Spearman, p<0,05; rs= 0,214, Spearman, p<0,05; rs= 0,573, Spearman, p<0,01 e rs= 0,219, Spearman, p<0,05). The HIV-NT group showed higher levels of anti-LDL(-)-IgG compared to Control group (Kruskal-Wallis, p<0,01). In contrast, was observed lower levels for HIV-NT group to MPO, LDL-HNE and LDL-CML when compared to Control group (Kruskal-Wallis, p<0,01). The comparison of HIV-NT and HIV-TARV groups demonstrated that TARV caused a decrease of concentrations of anti-LDL(-)-IgG antibodies and an increased of LDL-oxi levels (Kruskal-Wallis, p <0.01). The HIV-TARV group showed increased LDL-oxi concentrations and decreased at levels of MPO, LDL-HNE e LDL-CML when compared to Control (Kruskal-Wallis, p<0,01). In conclusion, the HIV infection changed the biomarker of inflammation MPO and the profile of biomarkers related to modifications of LDL (lower concentrations of LDL-HNE and LDL-CML), as well as increased the humoral-immune response to electronegative LDL [anti-LDL(-)-IgG], while treatment with antiretroviral therapy inhibited this response. The other studied biomarkers were not modified either by viral infection or antiretroviral treatment.

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-09-29T20:17:35Z No. of bitstreams: 1 josehenriquemferreira_dissert.pdf: 1670640 bytes, checksum: 3707d57cc4f4e98d8edb6594786c1b7e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-29T20:17:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 josehenriquemferreira_dissert.pdf: 1670640 bytes, checksum: 3707d57cc4f4e98d8edb6594786c1b7e (MD5) Previous issue date: 2014-10-20 / Introduction: Mammary neoplasms are the most common type of tumor in dogs. Some proteins play an important role in tumor progression, thus are candidate prognosis markers. During tumor growth, the transcription factor induced by hypoxia (HIF-1α) activates the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), promoting angiogenesis. Interleukin-8 (IL-8) is a pro-inflammatory and pro-angiogenic cytokine and has been associated with tumor progression. Objectives: To evaluate the prognostic value of HIF-1α, VEGF and IL-8 proteins in tumor tissue in dogs with mammary tumors, correlating them with clinicopathological parameters, clinical outcome and survival. Material and Methods: The concentrations of HIF-1α, VEGF and IL-8 proteins were evaluated by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent) in macerated tumor of 25 bitches with mammary tumors and control samples and compared statistically. Results: The levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 were higher in dogs over the age of 10 years and that had died (p <0.05). Moreover, HIF-1α concentrations were elevated in the tumors of dogs who developed metastases (p = 0.04), while VEGF levels were highest in tumors with clinical stages III and IV (p = 0.03) and IL-8 tumors in tumor with development greater than six months (p = 0.03). Still, high levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 were also related to shorter overall survival (p <0.05). Conclusions: High levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 are associated with features of poor prognosis, suggesting that the assessment of these proteins in tumor macerated has important prognostic value. / Introdução: As neoplasias mamárias são o tipo mais comum de tumor na espécie canina. Algumas proteínas exercem importante papel na progressão tumoral e portanto, são candidatos marcadores de prognóstico. Durante o crescimento tumoral, o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF-1α) ativa a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), promovendo a angiogênese. A interleucina-8 (IL-8) é uma citocina pró-inflamatória e pró-angiogênica e tem sido associada à progressão tumoral. Objetivos: Avaliar o valor prognóstico das proteínas HIF-1α, VEGF e IL-8 no tecido tumoral em cadelas com neoplasia mamária, relacionando-os com os parâmetros clínico-patológicos, evolução clínica e sobrevida. Material e Métodos: As concentrações das proteínas HIF-1α, VEGF e IL-8 foram avaliadas pelo método de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent Assay) no macerado tumoral de 25 cadelas com neoplasia mamária e amostras controle e comparadas estatisticamente. Resultados: Os níveis de HIF-1α, VEGF e IL-8 foram maiores em cadelas com idade superior a 10 anos e que vieram a óbito (p < 0,05). Além disso, concentrações de HIF-1α foram elevadas nos tumores de cadelas que desenvolveram metástase (p = 0,04), enquanto os níveis de VEGF foram maiores em tumores com estadiamento clínico III e IV (p = 0,03), e de IL-8 em tumores com evolução tumoral maior que seis meses (p = 0,03). Ainda, níveis elevados de HIF-1α, VEGF e IL-8 também foram relacionados com menor tempo de sobrevida global (p < 0,05). Conclusões: Altas concentrações de HIF-1α, VEGF e IL-8 estão associadas com características de pior prognóstico, sugerindo que a avaliação dessas proteínas no macerado tumoral possui importante valor prognóstico.

A estrongiloidíase é uma infecção intestinal causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. A maioria dos casos evolui para um quadro crônico benigno; entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação, sobretudo em pacientes imunodeprimidos. Os métodos parasitológicos convencionais apresentam baixa sensibilidade e, com isso, os testes sorológicos podem representar uma boa alternativa para o diagnóstico dessa helmintíase. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as técnicas de RIFI, ELISA e WB para o diagnóstico da estrongiloidíase em pacientes candidatos a transplante. Para validação dos testes, foram utilizadas amostras de soros de pacientes imunocompetentes (positivos para S. stercoralis, positivos para outras parasitoses e negativos). Foram utilizadas amostras de fezes e soros de pacientes candidatos a transplante, a saber: 50 para transplante renal; 50 para transplante de fígado; 50 para transplante de medula óssea. As amostras fecais de todos os pacientes foram analisadas pelas técnicas de sedimentação espontânea, Rugai, e cultura em placa de ágar. Para a execução das técnicas sorológicas foram utilizadas como fonte de antígeno larvas filarioides de S. venezuelensis. Para a RIFI, os soros foram diluídos a 1:40 em tampão PBS-TM e o conjugado anti-IgG humano marcado com fluoresceína diluído 1:500 em PBS acrescido de 4% de azul de Evans, sendo realizada a leitura em microscópio de imunofluorescência, utilizando as objetivas de 20X e 40X. Para a técnica ELISA foram utilizadas placas poliestireno sensibilizadas com 10?g de antígeno (frações solúveis salina e alcalina), soro dos indivíduos diluídos a 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBS-TM) e conjugado (anti-IgG humana peroxidase) em PBS-TM. As amostras foram consideradas positivas quando o índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB, os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBS-TM. Dos 150 pacientes candidatos a transplante analisados, 9,3% (n=14) foram positivos pelas técnicas parasitológicas, sendo que a cultura em placa de ágar detectou 6,6% (n=10). Na RIFI a soropositividade para detecção da infecção por S. stercoralis foi de 16,6% (n=25), sendo, 22% transplante renal, 18% hepático e 10% medula óssea. Pela técnica ELISA a soropositividade foi de 11,3% (n=17), sendo 14% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 3% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 24,6% (n=37), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 50% hepático e 6% medula óssea, utilizando o antígeno salino. Pela técnica WB a soropositividade foi de 20,6% (n=31), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 32% hepático e 12% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 18,6% (n=28) sendo 10% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 32% medula óssea, utilizando o antígeno salino. A utilização de técnicas imunodiagnósticas pode ser indicada na triagem de pacientes em fila de transplante, devendo-se levar em conta as limitações de reações sorológicas em pacientes imunodeprimidos / Strongyloidiasis is an intestinal infection caused by the nematode Strongyloides stercoralis. Most cases progress to a benign chronic condition; however hyperinfection and dissemination may occur, especially in immunocompromised patients. Conventional parasitological methods have low sensitivity and, thus, serological tests may be a good alternative for the diagnosis of this helminthiasis. The aim of this study was to evaluate RIFI, ELISA and WB techniques for the diagnosis of strongyloidiasis in patients candidates for transplants. In order to validate the tests samples of sera from immunocompetent patients (positive for S. stercoralis, positive for other parasitosis, and negatives) were used. Feces and sera samples of patients candidates for transplants were used as follows: 50 for renal transplant, 50 for liver transplant, 50 for bone marrow transplant. Fecal samples of all patients were analyzed by spontaneous sedimentation, Rugai and Agar plate culture techniques. Filarioid larvae of S. venezuelensis were used as source of antigen for serological tests. For RIFI, sera were diluted 1:40 in PBS-TM buffer and human anti-IgG conjugate labeled with fluorescein was diluted 1:500 in PBS with 4% Blue Evans, reading being performed in immunofluorescence microscope using 20X and 40X objectives. For ELISA technique polystyrene plates sensitized with 10?g of antigen (saline and alkaline soluble fractions), individual sera diluted at 1:200 in PBS 0.05% Tween 3% of milk (PBS-TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM were used. Samples were considered positive when ELISA index was higher than 1. For WB technique, sera were diluted in Tris-HCl 5% of milk (TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM. From 150 patients candidates for transplants analyzed 9.3% (n=14) were positive by parasitological techniques, agar plate culture detected 6.6% (n=10). In RIFI seropositivity for S. stercoralis infection detection was 16.6% (n=25) being 22% renal transplant, 18% hepatic and 10% for bone marrow. By ELISA technique seropositivity was 11.3% (n=17), being 14% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 3% bone marrow, using alkaline antigen and 24.6% (n=37), being 18% in patients candidates for renal transplant, 50% hepatic and 6% bone marrow, using saline antigen. By WB technique seropositivity was 20.6% (n=31), being 18% in patients candidates for renal transplant, 32% hepatic and 12% bone marrow, using alkaline antigen, and 18.6% (n=28) being 10% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 32% bone marrow, using saline antigen. Application of immunodiagnostic techniques could be indicated in screening of patients in transplant waiting list, however limitations of serological reactions in immunodepressed patients should be considered

Cryptococcus sp é um fungo saprófita, cosmopolita, que causa micose sistêmica, geralmente, subaguda ou crônica, conhecida, sobretudo, por sua localização meníngea, após aquisição da infecção por via respiratória Embora seja ubíquo, a criptococose ocorre predominantemente em indivíduos imunodeficientes e podendo ocorrer, também, em indivíduos imunocompetentes. Os estudos experimentais e em humanos avaliando a ativação do sistema complemento e a produção de anticorpos específicos mostram que a resposta inata e de anticorpos são importantes para a delimitação do processo infeccioso por Cryptococcus sp, como também, a administração de anticorpos monoclonais podem induzir uma resposta eficaz na disseminação da doença. O sistema complemento contribui para a defesa do organismo contra o Cryptococcus sp de diferentes maneiras: secretando opsoninas e fatores quimiotáticos e colaborando com a ação dos anticorpos específicos, aumentando a interação entre a imunidade inata e adquirida. Os anticorpos antiglicuroxilomanana (GXM) possuem numerosas atividades biológicas: a) opsonização para fagocitose, b) ativação da via clássica do complemento resultando na deposição precoce de fragmentos de C3 no fungo, c) supressão do excesso de acúmulo de C3 pela via alternativa; d) facilitação do clareamento do GXM do soro in vivo, resultando no maior acúmulo de GXM nos tecidos ricos em células do sistema fagocítico mononuclear; e) proteção em modelos murinos da criptococose e f) facilitação de vários aspectos da imunidade celular ao Cryptococcus sp. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta humoral ao GXM e às proteínas da parede celular (Ag S) avaliando a atividade do sistema complemento como também a produção de anticorpos específicos em amostras séricas de adultos com e sem neurocriptococose. Foram coletadas 106 amostras de soro e divididas em 3 grupos: grupo 1- 21 indivíduos com neurocriptococose e baixa exposição a levedura, grupo 2- foi composto por 23 indivíduos saudáveis com alta exposição ao fungo e HIV negativos, granjeiros da cidade de Jumirim localizada a 164 km de São Paulo, na região de Sorocaba e, o grupo 3- 60 indivíduos saudáveis, HIV negativos e com baixa exposição ao Cryptococcus sp. Dois pacientes foram excluídos do estudo por apresentarem tumores (timona e câncer de pulmão). O sistema complemento foi avaliado por ensaio hemolítico (CH 50 e AP 50) e, a dosagem da proteína ligadora de manose (MBL) foi feita por ELISA. Os valores de CH 50 estiveram dentro da normalidade em 17/21, 13/23, 59/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. A média dos valores de CH 50 foi diferente significativamente entre o três grupos (P < 0,0001). O grupo 2 mostrou níveis reduzidos significantes em comparação aos dois outros grupos. Os valores de AP 50 estiveram dentro da normalidade em 11/21; 21/23 e 60/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. Houve diferença nos valores de AP 50 (P = 0,0005) e apenas um paciente do grupo 1 apresentou valores indetectáveis desta via. Houve diferença significante na dosagem de MBL entre os três grupos (P = 0,0277). Anticorpos IgG anti-GXM foram quantificados por ELISA e expressos por densidade óptica (DO). IgG anti GXM foi detectado em todos os grupos com diferença significante entre eles (P= 0,0127). As médias de IgG anti- GXM (DO) foram: 1.191 (0,49 a 1.217) no grupo 1, 1.572 (0,815 a 2.479) no grupo 2 e 0,965 (0,321 a 1.295) no grupo 3. Dois indivíduos assintomáticos do grupo 2 tiveram títulos de GXM detectáveis (1/256 e 1/32). Quatro pacientes com neurocriptococose faleceram (19%) e seus resultados mostravam: CH 50 normal, 2/4 tinham valores de AP 50 baixo (12 UI/mL) e indetectável; 3/4 tinham altos níveis de MBL e apenas um tinha baixa DO de IgG anti-GXM. Baseado em nosso estudo, podemos concluir que a resposta humoral (sistema complemento e anticorpos) não é suficiente para explicar a susceptibilidade a neurocriptococose, porém a alta e constante exposição ao Cryptococcus sp pode prevenir o desenvolvimento de doença, ou seja, a constante e intensa exposição ao fungo induz a produção de anticorpos que previnem a doença clínica mas não a infecção. Por outro lado fatores genéticos que determinam as concentrações de MBL podem influenciar na susceptibilidade a neurocriptococose. Os anticorpos contribuem para o clearence de GXM, entretanto as concentrações séricas não se correlacionam com resistência à doença / Cryptococcus sp is a fungal pathogen with a worldwide distribution. Although it is ubiquitous in the environment, cryptococcal disease occurs predominantly in immunocompromised hosts and can also occur in apparently immunocompetent individuals. The innate immunity is of special relevance for the antifungal reaction, as it allows an immediate reaction and recognizes a broad variety of fungal pathogens. The host immune response is a major determinant of the outcome of cryptococcal infection; however, the antibodies response is poorly understood. In addition, most of the studies are experimental and there is restricted knowledge concerning the human immune response. Complement system has soluble factors, restrictive regulator proteins and cellular receptors involved in defense mechanism. Glucuroxylomannan (GXM) monoclonal antibodies (MAbs) have numerous biological activities: a) opsonization for phagocytosis, b) activation of the classical complement pathway leading to early deposition of C3 fragments on the yeast, c) suppression overall accumulation of C3 via the alternative pathway; d) clearance facilitation of GXM from serum in vivo, leading to increased accumulation of GXM in tissues rich in mononuclear phagocyte system; e) protection in murine models of cryptococcosis and f) facilitation of various aspects of cellular immunity to Cryptococcus sp. The goal of our study was to evaluate if the antibody response to GXM and cell wall proteins regarding specific antibodies as well as complement system in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. The aim of our research was to evaluate classical and alternative complement system pathway, to quantify mannose-binding lectin (MBL) as well antibody response to GXM and cell wall proteins (AgS) regarding specific antibodies in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. One hundred and six samples were collected and classified in 3 groups: group 1- 21 individuals with neurocryptococcosis and low exposure to the yeast; group 2- was composed by 23 healthy individuals, chicken farmings from Jurumirim, a town 164 km to São Paulo, and with high exposure to Cryptoccocus spp and HIV negative. The third group included 60 healthy HIV negative individuals with presumed low exposure to Cryptococcus. Two patients were excluded by report of previous malignancies (timoma and pulmonary cancer). The complement system was evaluated by hemolytic assay and ELISA to MBL. CH 50 and AP 50 values were within the normal range in 17/21; 13/23; 59/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. Mean CH 50 values were significantly different among the three groups (P < 0,0001). Group 2 showed significantly reduced levels in comparison with groups 1 and 3. AP 50 values were within the normal range in 11/21; 21/23; 60/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. There was difference in the AP 50 values (P=0,0005) and one no activation of this pathway in group 1. There was significant difference in MBL among the groups (P = 0,0277). GXM antibodies IgG was measured by ELISA and expressed as optical density (OD). GXM- IgG was detected in all the groups with significant difference among them (P = 0,0127). The means of IgG anti-GXM (OD) were: 1.191 (range 0,49 to 1.217) in group 1, 1.572 (range 0,815 to 2.479) in group 2 and 0,965 (range 0,321 to 1.295) in the group 3. Two of the group 2 individuals had low GXM titers (1/256 and 1/32) and no symptoms. Four patients (4/21; 19%) with neurocryptococcosis died and the results showed: normal classical pathway activation, 2/4 had low (12 UI/mL) or undetectable alternative pathway values ; 3/4 had high MBL concentrations and only one had low OD for IgG anti-GXM. In conclusion, our results suggest that constant and high exposure to Cryptococcus sp can prevent the development of cryptococcosis, i.e. constant and intensive fungal exposition induces protective antibodies to clinical disease but not to the infection. In the other side, genetic factors which determine MBL concentrations could influence the susceptibility to neurocryptococcosis. The antibodies contribute to GXM clearance, however, the concentrations did not correlate with the resistance to the disease

Large numbers of samples often need to be prepared and analysed in surveys of organic pollutants in the environment, but while the methods commonly used in such surveys can provide abundant detail they are generally costly, time-consuming and require large amounts of resources, so there is a need for simpler techniques. The work underlying this thesis assessed the potential utility of more convenient sample preparation and bioanalytical techniques for rapidly screening various environmental matrices that could be useful complements to higher resolution methods. Initially, the utility of a simplified extraction technique followed by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in authentic (i.e. unspiked) contaminated soils was explored. The results showed that there are relationships between the structure and cross-reactivity among compounds that often co-occur with target PAHs. However, their potential contribution to deviations between estimates of total PAH contents of soils obtained using ELISA and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) based reference methods were limited. Instead, the cross-reactivity of target PAHs and the failure to extract all of the PAHs prior to the ELISA determinations were the main reasons for these deviations. Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and polychlorinated dibenzofurans (PCDFs) were detected in food and feed matrices, as well as in authentic contaminated soils using different bioanalytical techniques – ELISA and two cell-based bioassays: CAFLUX and CALUX (chemically activated fluorescent/luciferase gene expression) assays. In addition, enhanced sample preparation techniques based on accelerated solvent extraction (ASE) were developed. ASE with integrated carbon fractionation (ASE-C) in combination with CAFLUX produced estimates of PCDD and PCDF contents in fish oil and fish meal that agreed well with results obtained using reference methods. Furthermore, results from ELISA and GC-high resolution MS analyses of extracts of PCDD- and PCDF-contaminated soil samples obtained using an adjusted ASE-C technique were strongly correlated. Finally, the thesis reports the first experiments in which the results of CAFLUX, CALUX, and ELISA determinations of PCDDs and PCDFs in extracts of authentic contaminated soil samples were evaluated and compared to those obtained using a reference method. All of the bioanalytical techniques were found to be sufficiently sensitive, selective, and accurate for use in screening in compliance with soil quality assessment criteria. Overall, the improved sample preparation and bioanalytical techniques examined proved to be useful potential complements to conventional methods, enhancing the analytical framework for PAHs, PCDDs, and PCDFs. However, further validation has to be undertaken before they are applied on a large-scale.